222/2004 Sb., kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí

Schválený:
222/2004 Sb.
VYHLÁŠKA
ze dne 14. dubna 2004,
kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí
Změna: 389/2005 Sb.
Ministerstvo životního prostředí stanoví podle § 8 odst. 5 písm. c) zákona č. 356/2003 Sb., o chemických látkách a chemických přípravcích a o změně některých zákonů:
 
§ 1
Metody pro zkoušení fyzikálně-chemických a výbušných vlastností chemických látek (dále jen "látky") a chemických přípravků (dále jen "přípravky"), které jsou uvedeny v příloze č. 1, se použijí pro stanovení
a) bodu tání/bodu tuhnutí,
b) bodu varu,
c) relativní hustoty,
d) tlaku par,
e) povrchového napětí,
f) rozpustnosti ve vodě,
g) rozdělovacího koeficientu,
h) výbušných vlastností,
i) číselně střední molekulové hmotnosti a distribuce molekulové hmotnosti polymerů,
j) obsahu molekul o nízké hmotnosti v polymerech,
k) chování polymerů při rozpouštění/extrakci ve vodě.
 
§ 2
Metody pro zkoušení vlastností látek a přípravků nebezpečných pro životní prostředí, které jsou uvedeny v příloze č. 2, se použijí pro stanovení
a) akutní toxicity pro ryby,
b) akutní toxicity pro dafnie,
c) inhibice růstu řas,
d) "snadné" biologické rozložitelnosti pomocí
- úbytku rozpuštěného organického uhlíku (DOC),
- úbytku DOC modifikovanou screeningovou zkouškou,
- uvolňování oxidu uhličitého (CO
2
) modifikovanou Sturmovou zkouškou,
- manometrické respirometrie,
- zkoušky v uzavřených lahvičkách,
- zkoušky MITI,
e) rozložitelnosti - biologická spotřeba kyslíku,
f) rozložitelnosti - chemická spotřeba kyslíku,
g) abiotického rozkladu - hydrolýza jako funkce pH,
h) toxicity pro žížaly - zkouška na umělé půdě,
i) biologické rozložitelnosti - Zahn-Wellensova zkouška,
j) biologické rozložitelnosti - simulační zkouška s aktivovaným kalem,
k) biologické rozložitelnosti - zkouška inhibice dýchání aktivovaného kalu,
l) biologické rozložitelnosti - modifikovaná zkouška SCAS,
m) bioakumulace - průtoková zkouška na rybách,
n) růstu na nedospělých rybách,
o) toxicity na rybích embryích a potěru - krátkodobá zkouška,
p) akutní orální toxicity pro včelu medonosnou,
r) akutní kontaktní toxicity pro včelu medonosnou,
s) adsorpce/desorpce v rovnovážném stavu,
t) odhadu adsorpčního koeficientu (KOU) pro půdy a čistírenské kaly vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC),
u) toxicity pro reprodukci u Daphnia magna,
v) aktivity půdních mikroorganismů při transformaci dusíku,
w) aktivity půdních mikroorganismů při transformaci uhlíku,
x) aerobní a anaerobní transformace v půdě,
y) aerobní a anaerobní transformace v systémech voda-sediment.
 
§ 3
Zrušuje se:
1. Vyhláška č. 299/1998 Sb., kterou se stanoví metody pro zjišťování fyzikálně-chemických a chemických vlastností chemických látek a chemických přípravků a vlastností chemických látek a chemických přípravků nebezpečných pro životní prostředí.
2. Vyhláška č. 316/1998 Sb., kterou se stanoví metoda pro zjišťování výbušnosti chemických látek a chemických přípravků.
 
§ 4
Tato vyhláška nabývá účinnosti dnem vstupu smlouvy o přistoupení České republiky k Evropské unii v platnost.
Ministr:
RNDr. Ambrozek v. r.
 
Příl.1
METODY PRO ZKOUŠENÍ FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH A VÝBUŠNÝCH VLASTNOSTÍ
I. METODY PRO STANOVENí BODU TÁNÍ / BODU TUHNUTÍ – metody uvedené v bodu a.1 přílohy směrnice Komise 92/69/EHS ze dne 31. července 1992, kterou se po sedmnácté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování správních a právních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (dále jen „směrnice 92/69/EHS“)
I.1 METODA
Většina dále popsaných metod je založena na Pokynech OECD pro zkoušení (1). Jejich základní principy jsou uvedeny v literatuře (2) a (3).
I.1.1 ÚVOD
Popsané metody a přístroje jsou určeny ke stanovení bodu tání látek bez omezení z hlediska stupně jejich čistoty.
Výběr metody závisí na povaze látky, která má být zkoumána. Omezením bude tedy skutečnost, zda lze danou látku rozmělnit na prášek snadno, obtížně nebo zda ji nelze rozmělnit.
U některých látek je vhodnější stanovení bodu tuhnutí nebo krystalizace a normalizované metody pro tato stanovení jsou v této metodě rovněž uvedeny.
Nelze-li vzhledem ke zvláštním vlastnostem látky dobře stanovit žádný z uvedených parametrů, může být vhodné stanovit bod tekutosti.
I.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
Bod tání je definován jako teplota, při níž dochází za atmosférického tlaku k přechodu z tuhého do kapalného skupenství a která za ideálních podmínek odpovídá bodu tuhnutí.
Vzhledem k tomu, že u mnoha látek dochází k fázovému přechodu v rozmezí teplot, je toto rozmezí často nazýváno rozmezím bodu tání.
Přepočet jednotek (K na st.C):
t = T - 273,15
t - Celsiova teplota, stupně Celsia (st.C)
T - termodynamická teplota, kelvin (K)
I.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provedení metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami.
Některé kalibrační látky jsou uvedeny v literatuře (4).
I.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍCH METOD
Stanovuje se teplota (teplotní rozmezí) fázového přechodu z tuhého do kapalného skupenství nebo z kapalného do tuhého skupenství. V praxi se při zahřívání/ochlazování vzorku zkušební látky za atmosférického tlaku stanoví teploty počátku tání/tuhnutí a konce tání/tuhnutí. Je popsáno pět typů metod, jmenovitě kapilární metoda, metody používající zahřívací bloky, stanovení bodu tuhnutí, metody termické analýzy a stanovení bodu tekutosti (vyvinuto pro minerální oleje).
V některých případech může být vhodné měřit bod tuhnutí místo bodu tání.
I.1.4.1 Kapilární metoda
I.1.4.1.1 Zařízení pro stanovení bodu tání s kapalinovou lázní
Malé množství jemně rozmělněné látky se vpraví do kapiláry a zhutní se. Kapilára se zahřívá spolu s teploměrem, přičemž se rychlost nárůstu teploty během tání nastaví na méně než 1 K·min
-1
. Stanoví se teploty počátku a konce tání.
I.1.4.1.2 Zařízení pro stanovení bodu tání s kovovým blokem
Provádí se podobně jako v bodě 1.4.1.1 s tím rozdílem, že kapilára a teploměr jsou umístěny v kovovém vyhřívaném bloku a pozorují se otvory v bloku.
I.1.4.1.3 Detekce fotočlánkem
Vzorek v kapiláře se automaticky zahřívá v kovovém válci. Otvorem ve válci prochází látkou světelný paprsek na přesně kalibrovaný fotočlánek. Při tání mění většina látek optické vlastnosti a z neprůhledných se mění na průhledné. V tomto okamžiku vzroste intenzita světla dopadajícího na fotočlánek a do zařízení odečítajícího teplotu platinového odporového teploměru umístěného v topné komůrce je vyslán signál k zastavení zaznamenávání. Tato metoda není vhodná pro některé silně zbarvené látky.
I.1.4.2 Zahřívací bloky
I.1.4.2.1 Koflerův zahřívací stolek
Koflerův zahřívací stolek je tvořen dvěma kovovými hastmi s různou teplotní vodivostí, je vyhříván elektricky a je konstruován tak, že teplotní gradient je po jeho délce téměř lineární. Teplota stolku se může měnit od 283 do 573 K; stolek je vybaven speciálním zařízením pro odečítání teploty, tvořeným jezdcem s ukazatelem a stupnicí navrženou pro daný stolek. Pro stanovení bodu tání se látka nanese v tenké vrstvě přímo na povrch stolku. Během několika sekund se vytvoří ostrá dělicí linie mezi kapalnou a tuhou fází. Teplota v místě dělicí linie se odečte po nastavení ukazatele na tuto dělicí linii.
I.1.4.2.2 Tavicí mikroskop
Pro stanovení bodu tání velmi malých množství látek se používají různé typy mikroskopů s ohřívacím stolkem. Většina ohřívacích stolků využívá k měření teploty citlivé termočlánky, používají se však i rtuťové teploměry. Typický přístroj pro stanovení bodu tání pomocí mikroskopu s ohřívacím stolkem má ohřívací komoru s kovovou deskou, na kterou se umístí vzorek na podložním sklíčku. Ve středu kovové desky je otvor, kterým může procházet světelný paprsek odražený osvětlovacím zrcátkem mikroskopu. Při měřeních se ohřívací komora přikryje skleněnou destičkou, aby se omezila cirkulace vzduchu v místě, kde se nachází vzorek.
Ohřev vzorku se kontroluje regulačním odporem. Pro velmi přesná měření opticky anisotropních látek lze používat polarizované světlo.
I.1.4.2.3 Menisková metoda
Tato metoda se používá především pro polyamidy. Vizuálně se stanoví teplota, při které se zřetelně posune meniskus silikonového oleje uzavřeného mezi ohřívacím blokem a skleněnou krycí destičkou umístěnou na vzorku zkoušeného polyamidu.
I.1.4.3 Metoda stanovení bodu tuhnutí
Vzorek se vloží do speciální zkumavky, která se umístí do přístroje pro stanovení bodu tuhnutí. Během ochlazování se vzorek nepřetržitě pomalu míchá a ve vhodných intervalech se odečítá teplota. Jakmile je teplota po několik odečtů konstantní (po odpovídající korekci teploměru), je zaznamenána jako bod tuhnutí. Podchlazení je nutno zabránit udržováním rovnováhy mezi tuhou a kapalnou fází.
I.1.4.4 Termická analýza
I.1.4.4.1 Diferenční termická analýza (DTA)
Při této technice se zaznamenává teplotní rozdíl mezi danou látkou a referenční látkou, jež jsou podrobeny stejnému řízenému teplotnímu programu. Jestliže u vzorku dojde k fázovému přechodu, který je spojen se změnou enthalpie, je tato změna zaznamenána jako endotermická (tání) nebo exotermická (tuhnutí) odchylka od základní linie záznamu teploty.
I.1.4.4.2 Diferenční skenovací kalorimetrie (DSC)
Při této technice se daná látka a referenční látka podrobí stejnému řízenému teplotnímu programu a zaznamenává se rozdíl energie absorbované danou látkou a referenční látkou jako funkce teploty. Tato energie je energií potřebnou k zachování nulového teplotního rozdílu mezi danou látkou a referenční látkou. Jestliže u vzorku dojde k fázovému přechodu, který je spojen se změnou enthalpie, je tato změna zaznamenána jako endotermická (tání) nebo exotermická (tuhnutí) odchylka od základní linie záznamu tepelného toku.
I.1.4.5 Bod tekutosti
Metoda byla vyvinuta pro minerální oleje a je vhodná pro měření olejovitých látek s nízkým bodem tání.
Po počátečním zahřátí se vzorek určitou rychlostí ochlazuje a v intervalech po 3 K se stanovuje jeho tekutost. Nejnižší teplota, při níž je ještě pozorován pohyb látky, se zaznamená jako bod tekutosti.
I.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI
Použitelnost a přesnost různých metod stanovení bodu / rozmezí bodu tání jsou uvedeny v následující tabulce.
                  TABULKA: POUŽITELNOST METOD


                      A. Kapilární metody
----------------------------------------------------------------
  Metoda     Látky,     Látky,    Rozsah  Odhadnutá Existující
  měření    které lze    které    teplot  přesnost 1)   norma
            rozmělnit    nelze                
            na prášek   snadno
                       rozmělnit
                       na prášek
----------------------------------------------------------------
Zařízení       ano     pouze pro  273 až  +/-0,3 K  JIS K 0064
pro                     několik    573 K
stanovení                látek
bodu tání s
kapalinovou
lázní
----------------------------------------------------------------
Zařízení       ano     pouze pro  293 až  +/-0,5 K  ISO 1218(E)
pro                     několik   > 573 K           
stanovení                látek
bodu tání
s kovovým
blokem
----------------------------------------------------------------
Detekce        ano        pro     253 až  +/-0,5 K  
fotočlánkem             některé    573 K
                         látky
                      s použitím
                      přídavných
                       zařízení
----------------------------------------------------------------
1) Závisí na typu zařízení a stupni čistoty látky


          B. Zahřívací bloky a stanovení         bodu tuhnutí
----------------------------------------------------------------          
 Metoda     Látky,      Látky,   Rozsah  Odhadnutá  Existující
 měření    které lze    které    teplot  přesnost1)    norma
           rozmělnit    nelze                
           na prášek    snadno
                      rozmělnit
                      na prášek
----------------------------------------------------------------
Koflerův      ano         ne     283 až   +/-1,0 K  ANSI/ASTM
zahřívací                        > 573 K            D 3451­76
stolek
----------------------------------------------------------------
Tavicí        ano     pouze pro  273 až   +/-0,5 K  DIN 53736
mikroskop              několik   > 573 K
                        látek
----------------------------------------------------------------
Menisková     ne      především  293 až   +/-0,5 K   ISO 1218
metoda                   pro     > 573 K               (E)
                      polyamidy
----------------------------------------------------------------
Metoda        ano        ano     223 až   +/-0,5 K   např. BS
stanovení                         573 K                4695
bodu
tuhnutí
----------------------------------------------------------------
1) Závisí na typu zařízení a stupni čistoty látky


                      C. Termická analýza
----------------------------------------------------------------
   Metoda     Látky,     Látky,   Rozsah  Odhadnutá Existující
   měření    které lze   které    teplot  přesnost    norma
             rozmělnit   nelze               1)
             na prášek   snadno
                       rozmělnit
                       na prášek
----------------------------------------------------------------
Diferenční      ano       ano     173 až  do 600 K     ASTM
termická                          1 273 K  +/-0,5 K  E 537­76
analýza                                      do
                                           1 273 K
                                           +/-2,0 K
----------------------------------------------------------------
Diferenční      ano       ano     173 až  do 600 K     ASTM
skenovací                         1 273 K  +/-0,5 K  E 537­76
kalorimetrie                                 do
                                           1 273 K
                                           +/-2,0 K
----------------------------------------------------------------
1) Závisí na typu zařízení a stupni čistoty látky


                       D. Bod tekutosti
----------------------------------------------------------------
 Metoda     Látky,      Látky,    Rozsah Odhadnutá  Existující
 měření    které lze  které nelze teplot  přesnost    norma
           rozmělnit    snadno               1)
           na prášek   rozmělnit
                       na prášek
----------------------------------------------------------------
Teplota       pro         pro     223 až  +/-3,0 K     ASTM
tekutosti  minerální   minerální  323 K              D 97­66
            oleje a     oleje a
           olejovité   olejovité
             látky       látky
----------------------------------------------------------------
1) Závisí na typu zařízení a stupni čistoty látky

I.1.6 POPIS METOD
Postupy téměř všech těchto zkušebních metod jsou popsány ve vnitrostátních a mezinárodních normách (viz doplněk 1)
.
I.1.6.1 Kapilární metody
Při pomalém vzestupu teploty lze u jemně práškovitých látek obvykle rozlišit stupně tání znázorněné na obrázku 1.
  Obrázek 1
                         


Fáze A (Počátek tání): na vnitřní straně trubičky se stejnoměrně drží jemné kapičky.
Fáze B V důsledku smrštění vzorku se mezi vnitřní stěnou a vzorkem tvoří mezera.
Fáze C Smrštěný vzorek se začíná hroutit dolů a stává se tekutým.
Fáze D Na povrchu se tvoří úplný meniskus, ale značná část vzorku je dosud tuhá.
Fáze E (Konečná fáze tání): Vzorek již neobsahuje žádné tuhé částice.
Během stanovení bodu tání se zaznamenávají teploty počátku tání a konečné fáze.
I.1.6.1.1 Zařízení pro stanovení bodu tání s kapalinovou lázní
Na obrázku 2 je znázorněna normalizovaná skleněná aparatura pro stanovení bodu tání (JIS K 0064); všechny rozměry jsou uvedeny v milimetrech.
  Obrázek 2
       


Kapalinová lázeň:
Je třeba zvolit vhodnou kapalinu. Volba kapaliny závisí na bodu tání, který má být stanovena např. kapalný parafin pro stanovení bodu tání nižšího než 473 K, silikonový olej pro stanovení bodu tání nižšího než 573 K.
Pro stanovení bodu tání vyššího než 523 K lze použít směs tří hmotnostních dílů kyseliny sírové a dvou hmotnostních dílů síranu draselného. S tímto typem směsi je třeba pracovat s náležitou opatrností.
Teploměr:
Měly by se používat pouze teploměry, které splňují požadavky norem ASTM E 1­71, DIN 12770, JIS K 8001 nebo rovnocenných norem.
Postup:
Suchá látka se jemně rozetře v třecí misce a vpraví se do kapiláry zatavené na jednom konci, a to tak, aby po zhutnění byla kapilára naplněna do výšky přibližně 3 mm. Má-li se dosáhnout stejnoměrného zhutnění, nechá se kapilára dopadnout z výšky přibližně 700 mm skleněnou trubicí na hodinové sklíčko.
Naplněná kapilára se vloží do lázně tak, aby se střední část rtuťové baňky teploměru dotýkala kapiláry v místě, kde se nachází vzorek. Kapilára se obvykle vkládá do lázně při teplotě asi o 10 K nižší, než je bod tání.
Lázeň se zahřívá tak, aby vzestup teploty činil přibližně 3 K·min
-1
. Lázeň se míchá. Asi 10 K pod očekávaným bodem tání se růst teploty upraví na nejvýše 1 K*min
-1
.
Výpočet:
Bod tání se vypočte takto:
T = T
D
+ 0,00016 (T
D
- T
E
) n
kde:
T = korigovaný bod tání v K
T
D
= odečet teploty na teploměru D v K
T
E
= odečet teploty na teploměru E v K
n = počet stupňů, o něž rtuťový sloupec teploměru D vyčnívá z kapaliny
.
I.1.6.1.2 Zařízení pro stanovení bodu tání s kovovým blokem
Přístroj:
Je tvořen
— válcovým kovovým blokem, jehož horní část je dutá a tvoří komoru (viz obrázek 3),
— kovovou krycí deskou se dvěma nebo více otvory, kterými je možno do kovového bloku zavést trubičky,
— ohřívacím systémem kovového bloku, například elektrickým topným odporem uzavřeným v kovovém bloku,
— regulačním odporem pro regulaci příkonu, je­li použit elektrický ohřev,
— čtyřmi okénky ze žáruvzdorného skla v bočních stěnách ohřívací komory, orientovanými vůči sobě pod pravým úhlem. Před jedním z těchto okének je umístěn okulár pro pozorování kapilární trubičky. Ostatní tři okénka slouží k osvětlení vnitřního prostoru žárovkami,
— kapilární trubičkou ze žáruvzdorného skla zatavenou na jednom konci (viz 1.6.1.1).
Teploměr:
Viz normy uvedené v 1.6.1.1. Je rovněž možné použít termoelektrické měřicí přístroje srovnatelné přesnosti.
 Obrázek 3



I.1.6.1.3 Detekce fotočlánkem
Přístroj a postup:
Přístroj sestává z kovové komory s automatickým ohřívacím zařízením. Tři kapilární trubičky se naplní podle bodu 1.6.1.1 a umístí se do ohřívací komory. Pro kalibraci přístroje je k dispozici několik lineárních režimů růstu teploty, přičemž vhodný lineární růst teploty se elektricky nastaví předem zvolenou konstantou. Zaznamenávací zařízení ukazují teplotu v ohřívací komoře a teplotu látky v kapilárách.
I.1.6.2 Zahřívací bloky
I.1.6.2.1 Koflerův zahřívací stolek
Viz doplněk.
I.1.6.2.2 Tavicí mikroskop
Viz doplněk.
I.1.6.2.3 Menisková metoda (pro polyamidy)
Viz doplněk.
V oblasti bodu tání by měla být rychlost ohřevu menší než 1 K·min
-1
.
I.1.6.3 Metody stanovení bodu tuhnutí
Viz doplněk.
I.1.6.4 Termická analýza
I.1.6.4.1 Diferenční termická analýza
Viz doplněk.
I.1.6.4.2 Diferenční skenovací kalorimetrie
Viz doplněk.
I.1.6.5 Stanovení bodu tekutosti
Viz doplněk
.
I.2 DATA
V některých případech je nutno provést korekci teploměru.
I.3 ZPRÁVY
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:
— použitá metoda,
— přesná specifikace látky (identita a nečistoty) a popř. informace o provedeném předběžném čištění,
— odhad přesnosti.
Jako bod tání se uvede střední hodnota alespoň dvou měření, jejichž výsledky leží v rozmezí odhadnuté přesnosti (viz tabulky).
Leží-li rozdíl teplot počáteční a konečné fáze tání v mezích přesnosti metody, uvede se jako bod tání konečná teplota, v opačném případě se uvedou obě teploty.
Jestliže se látka před dosažením bodu tání rozkládá nebo sublimuje, uvede se teplota, při které dochází k pozorovanému jevu.
Musí být uvedeny všechny informace a poznámky, které jsou důležité pro interpretaci výsledků, zejména pokud jde o nečistoty a fyzikální stav látky.
I.4 LITERATURA
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Council C(81) 30 final.
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, (eds.). Experimental thermodynamics. Butterworths, London, 1975, II, 803-834.
(3) R. Weissberger (ed.): Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry. 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, I, Part I, Chapter VII.
(4) IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry. 1976, 48, 505-515.
DODATEK
Další technické podrobnosti je možné zjistit například v následujících normách:
1. Kapilární metody
1.1 Přístroje pro stanovení bodu tání s kapalinovou lázní
ASTM E 32­69 Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals
BS 4634 Method for the determination of melting point and/or melting range
DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles von Harzen nach Kapillarverfahren
JIS K 00-64 Testing methods for melting point of chemical products
1.2 Přístroje pro stanovení bodu tání s kovovým blokem
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen
ISO 1218 (E) Plastics – polyamides – determination of „melting point“
2. Zahřívací bloky
2.1 Koflerův zahřívací stolek
ANSI/ASTM D 3451­76 Standard recommended practices for testing polymeric powder coatings
2.2 Tavicí mikroskop
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunssttoffen
2.3 Menisková metoda (polyamidy)
ISO 1218 (E) Plastics – polyamides – determination of „melting point“
ANSI/ASTM D 2133­66 Standard specificatin for acetal resin injection moulding and extrusion materials
NF T 51-050 Résines de polyamides. Détermination du „point de fusion“. Méthode du ménisque
3. Metody stanovení bodu tuhnutí
BS 4633 Method for the determination of crystallizing point
BS 4695 Method for Determination of Melting Point of Petroleum Wax (Cooling Curve)
DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen
ISO 2207 Cires de pétrole: détermination de la temperature de figeage
DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsäuren
NF T 60-114 Point de fusion des paraffines
NF T 20-051 Méthode de détermination du point de cristallisation (point de congélation)
ISO 1392 Method for the determination of the freezing point
4. Termická analýza
4.1 Diferenční termická analýza
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe
4.2 Diferenční skenovací kalorimetrie
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe
5. Stanovení bodu tekutosti
NBN 52014 Echantillonnage et analyse des produits du pétrole: Point de trouble et point ďécoulement limite – Monsterneming en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt
ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of petroleum oils
ISO 3016 Petroleum oils – Determination of pour point.
II. METODY PRO STANOVENÍ BODU VARU – METODY UVEDENÉ V BODU A.2 PŘÍLOHY SMĚRNICE 92/69/EHS
II.1 METODA
Většina dále popsaných metod je založena na Pokynech OECD pro zkoušení (1). Jejich základní principy jsou uvedeny v literatuře (2) a (3).
II.1.1 ÚVOD Popsané metody a zařízení lze použít pro kapaliny a látky s nízkým bodem tání, pokud nepodléhají chemickým reakcím pod bodem varu (např. autooxidaci, přesmyku, rozkladu atd.). Metody lze použít jak pro čisté kapalné látky, tak pro kapalné látky obsahující nečistoty. Přednost mají metody využívající detekci fotočlánkem a metody termické analýzy, protože umožňují stanovení jak bodu tání, tak bodu varu. Tato měření mohou být navíc prováděna automaticky.
„Dynamická metoda“ má tu výhodu, že ji lze použít i ke stanovení tlaku par a přitom není třeba korigovat bod varu na normální tlak (101,325 kPa), neboť ten lze během měření nastavit manostatem.
Poznámky:
Vliv nečistot na stanovení bodu varu závisí ve velké míře na jejich povaze. Jestliže vzorek obsahuje těkavé nečistoty, které mohou ovlivnit výsledky, může být látky přečištěna.
II.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
Standardní bod varu je definován jako teplota, při které je tlak par dané kapaliny roven 101,325 kPa. Jestliže se měření bodu varu neprovádí za normálního tlaku, lze závislost tlaku par na teplotě popsat Clausiovou-Clapeyronovou rovnicí:
                delta H
v
log p = ---------- + konst. 2,3 RT
kde
p = tlak par látky v Pa
delta H
v
= výparné teplo v J*mol
-1
R = univerzální molární plynová konstanta = 8,314 J*mol
-1
*K
-1
T = termodynamická teplota v K
Bod varu se uvádí s ohledem na okolní tlak při měření.
Přepočty:
Tlak (jednotka: kPa)
100 kPa = 1 bar = 0,1 MPa (jednotka „bar“ je nadále přípustná, její používání se však nedoporučuje)
133 Pa = 1 mm Hg = 1 torr (jednotky „mm Hg“ a „torr“ nejsou povoleny)
1 atm = standardní atmosféra = 101 325 Pa (jednotka „atm“ není povolena).
Teplota (jednotka: K)
t = T - 273,15
t - Celsiova teplota, stupeň Celsia (st.C)
T - termodynamická teplota, kelvin (K)
II.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provedení metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami. Některé kalibrační látky jsou uvedeny v doplňku.
II.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍCH METOD
Pět metod stanovení bodu varu (teplotního rozmezí bodu varu) je založeno přímo na měření teploty varu, další dvě využívají termální analýzy.
II.1.4.1 Stanovení ebuliometrem
Ebuliometry byly původně vyvinuty pro stanovení molekulové hmotnosti na základě zvýšení teploty varu, jsou však vhodné také pro přesná měření bodu varu. Velmi jednoduchý přístroj je popsán v normě ASTM D 1120­72 (viz doplněk). V tomto přístroji se kapalina zahřívá za rovnovážných podmínek při atmosférickém tlaku, dokud nezačne vřít.
II.1.4.2 Dynamická metoda
Metoda zahrnuje měření teploty kondenzace páry vhodným teploměrem umístěným za varu ve zpětném toku (refluxu). U této metody lze měnit tlak.
II.1.4.3 Destilační metoda pro stanovení bodu varu
Metoda zahrnuje destilaci kapaliny a měření teploty kondenzace páry, přičemž se stanovuje také množství destilátu.
II.1.4.4 Postup podle Siwoloboffa
Vzorek se zahřívá ve zkumavce, která je ponořena do tepelné lázně. Do zkumavky se vzorkem je zasunuta zatavená kapilára, v jejíž spodní části se nachází vzduchová bublinka.
II.1.4.5 Detekce fotočlánkem
Při použití principu unikajících bublinek podle Siwoloboffa se provádí automatické fotoelektrické měření.
II.1.4.6 Diferenční termická analýza
Při této technice se zaznamenává teplotní rozdíl mezi danou látkou a referenčním materiálem jako funkce teploty, přičemž látka a referenční materiál se podrobí témuž řízenému teplotnímu programu. Jestliže u studované látky dojde k fázovému přechodu, který je spojen se změnou enthalpie, je tato změna indikována jako endotermická odchylka (var) od základní linie záznamu teploty.
II.1.4.7 Diferenční skenovací kalorimetrie
Při této technice se látka a referenční materiál podrobí stejnému řízenému teplotnímu programu a zaznamenává se rozdíl energie absorbované látkou a referenčním materiálem jako funkce teploty. Tato energie je energií potřebnou k zachování nulového teplotního rozdílu mezi látkou a referenčním materiálem. Jestliže u vzorku dojde k fázovému přechodu, který je spojen se změnou enthalpie, je tato změna indikována jako endotermická odchylka (var) od základní linie záznamu tepelného toku.
II.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI
Použitelnost a přesnost různých metod používaných pro stanovení bodu / teplotního rozmezí bodu varu jsou uvedeny v následující tabulce 1.
                   TABULKA 1: SROVNÁNÍ METOD
-----------------------------------------------------------------
   Metoda měření       Odhadnutá přesnost        Existující norma
-----------------------------------------------------------------
Stanovení               +/-1,4 K (do 373 K)1) 2)  ASTM D 1120­721)
ebuliometrem            +/-2,5 K (do 600 K)1) 2)  

Dynamická metoda        +/-0,5 K (do 600 K)2)     

Destilační metoda       +/-0,5 K (do 600 K)       ISO / R 918,
(stanovení rozmezí                                DIN 53171,
bodu varu)                                        BS 4591/71

Postup podle            +/-2 K (do 600 K)2)       
Siwoloboffa

Detekce fotočlánkem     +/-0,3 K (při 373 K)2)    

Diferenční termická     +/-0,5 K (do 600 K)       ASTM E 537­76
analýza                 +/-2,0 K (do 1 273 K)

Diferenční skenovací    +/-0,5 K (do 600 K)       ASTM E 537­76
kalorimetrie            +/-2,0 K (do 1 273 K)
-----------------------------------------------------------------
1) Tato  přesnost  platí  pouze  pro  jednoduchý  přístroj,
   popsaný  např.  v  normě ASTM D 1120­72;  může  být  zlepšena
   užitím dokonalejšího ebuliometru.
2) Platí pouze pro čisté látky. Užití za jiných okolností by
   mělo být zdůvodněno.

II.1.6 POPIS METOD
Postupy některých zkušebních metod jsou popsány v mezinárodních a vnitrostátních normách (viz doplněk).
II.1.6.1 Ebuliometr
Viz doplněk.
II.1.6.2 Dynamická metoda
Viz metoda A.4 pro stanovení tlaku par. Zaznamená se teplota varu naměřená při tlaku 101,325 kPa.
II.1.6.3 Destilační metoda (stanovení rozmezí bodu varu)
Viz doplněk.
II.1.6.4 Postup podle Siwoloboffa
Vzorek se zahřívá ve zkumavce o průměru přibližně 5 mm v přístroji pro stanovení bodu tání (obrázek 1). Na obrázku 1 je znázorněn normalizovaný přístroj pro stanovení bodu varu (JIS K 0064) (přístroj je skleněný, všechny rozměry jsou uvedeny v milimetrech).
                                   Obrázek 1
      


Do zkumavky se vloží kapilára (varná kapilára) zatavená asi 1 cm nad spodním koncem. Zatavená část kapiláry musí ležet pod hladinou kapaliny. Zkumavka obsahující kapiláru se upevní buď pryžovou páskou k teploměru nebo pomocí bočního držáku (viz obrázek 2).
 Obrázek 2   
         


              Obrázek 3
   


Kapalina pro lázeň se volí podle bodu varu. Pro teploty do 573 K lze použít silikonový olej. Parafinový olej lze použít pouze do 473 K. Kapalina v lázni se zahřívá tak, aby vzestup teploty byl zpočátku asi 3 K*min
-1
. Lázeň se míchá. Asi 10 K před očekávaným bodem tání se zahřívání sníží tak, aby nárůst teploty byl nejvýše 1 K*min
-1
. Krátce před dosažením bodu varu začnou z varné kapiláry rychle unikat bublinky.
Bodu varu je dosaženo, když při ochlazování náhle ustane unikání bublinek a kapalina začne v kapiláře stoupat. Příslušný údaj na teploměru je bodem varu látky.
Modifikovanou metodou (obrázek 3) se bod varu stanovuje v kapiláře pro stanovení bodu tání. Ta se vytáhne do tenké špičky dlouhé asi 2 cm (a) a do ní se nasaje malé množství vzorku. Otevřený konec tenké části kapiláry se zataví tak, aby na konci byla malá vzduchová bublinka. Při zahřívání v aparatuře pro stanovení bodu tání (b) se vzduchová bublinka rozpíná. Bod varu odpovídá teplotě, při které sloupeček látky dosáhne hladiny kapalinové lázně (c).
II.1.6.5 Detekce fotočlánkem
Vzorek se zahřívá v kapiláře ve vyhřívaném kovovém bloku.
Otvory v bloku se vede světelný paprsek tak, aby procházel látkou na přesně kalibrovaný fotočlánek.
Při zvyšování teploty vzorku stoupají z kapiláry jednotlivé vzduchové bublinky. Při dosažení bodu varu počet bublinek značně vzroste. To vede ke změně intenzity světla zaznamenané fotočlánkem a vyvolá signál v měřicím přístroji, kterým se zastaví zaznamenávání teploty měřené platinovým odporovým teploměrem umístěným v bloku.
Tato metoda je zvláště vhodná, protože umožňuje stanovení teplot nižších než laboratorní teplota až do 253,15 K (-20 st.C) bez jakékoli úpravy přístroje. Pouze je třeba umístit přístroj v chladicí lázni.
II.1.6.6 Termická analýza
II.1.6.6.1 Diferenční termická analýza
Viz doplněk.
II.1.6.6.2 Diferenční skenovací kalorimetrie
Viz doplněk.
II.2 DATA
Při malých odchylkách od normálního tlaku (nejvýše +/- 5 kPa) se hodnoty teploty varu přepočítávají na normalizovanou teplotu Tn pomocí Sidneyovy­Youngovy rovnice:
                      T
n
= T + (f
T
× deltap)
kde:
delta p = (101,325 - p) [pozor na znaménko]
p = naměřený tlak v kPa
fT = velikost změny teploty varu v závislosti na změně tlaku v K*kPa
-1
T = naměřená teploty varu v K
T
n
= teplota varu korigovaná na normální tlak v K
Teplotní korekční faktory fT a rovnice pro jejich aproximaci jsou uvedeny pro řadu látek ve zmíněných mezinárodních a vnitrostátních normách.
Například metoda podle DIN 53171 uvádí přibližné korekce pro rozpouštědla obsažená v nátěrových hmotách:
       
            TABULKA 2: TEPLOTNÍ KOREKČNÍ FAKTORY f
T
----------------------------------------------------------------- Teplota T (K) Korekční faktor f
T
(K kPa
-1
) ----------------------------------------------------------------- 323,15 0,26 348,15 0,28 373,15 0,31 398,15 0,33 423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,44 548,15 0,45 573,15 0,47 -----------------------------------------------------------------
II.3 ZPRÁVY
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:
— použitá metoda,
— přesná specifikace látky (identita a nečistoty) a popř. informace o provedeném předběžném čištění,
— odhad přesnosti.
Jako bod varu se uvede střední hodnota alespoň dvou měření, jejichž výsledky leží v rozmezí odhadnuté přesnosti (viz tabulka 1).
Uvedou se naměřené teploty varu a jejich střední hodnota a dále hodnota tlaku v kPa, při kterém byla měření provedena. Tlak by se měl pokud možno blížit normálnímu tlaku.
Musí být uvedeny všechny informace a poznámky, které jsou důležité pro interpretaci výsledků, zejména pokud jde o nečistoty a fyzikální stav látky.
II.4 LITERATURA
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C (81) 30 final.
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, (eds.). Experimental thermodynamics. Butterworths, London 1975, volume II.
(3) R. Weissberger (ed.): Technique of organic chemistry, Physical methods of organic chemistry. 3rd ed. Interscience Publications, New York, 1959, volume I, Part I, Chapter VIII.
DODATEK
Další technické podrobnosti je možné zjistit například v následujících normách:
1. Ebuliometr
ASTM D 1120­72 Standard test method for boiling point of engine anti­freezes
2. Destilační postupy (teplotní rozmezí bodu varu)
ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range)
BS 4349/68 Method for determination of distillation of petroleum products
BS 4591/71 Method for the determination of distillation characteristics
DIN 53171 Lösungsmittel für Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufes
NF T 20­608 Distillation: détermination du rendement et de l'intervalle de distillation
3. Diferenční termická analýza a diferenční skenovací kalorimetrie
ASTM E 537­76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis
ASTM E 473­85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis
ASTM E 472­86 Standard practice for reporting thermoanalytical data
DIN 51005 Thermische Analyse: Begriffe
III. METODY PRO STANOVENÍ RELATIVNÍ HUSTOTY – METODY UVEDENÉ V BODU A.3 PŘÍLOHY SMĚRNICE 92/69/EHS
III.1. METODA
Popsané metody jsou založeny na Pokynech OECD pro zkoušení (1). Základní principy jsou uvedeny v literatuře (2).
III.1.1 ÚVOD
Popsané metody stanovení relativní hustoty jsou použitelné pro tuhé a kapalné látky bez jakýchkoli omezení, pokud jde o jejich čistotu. Jednotlivé metody, které lze použít, jsou uvedeny v tabulce 1.
III.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
Relativní hustota D20
4
tuhých látek nebo kapalin je poměr mezi hmotností určitého objemu zkoumané látky stanovenou při 20 st.C a hmotností stejného objemu vody stanovenou při 4 st.C. Relativní hustota nemá rozměr. Hustota látky ró je podíl hmotnosti látky m a jejího objemu V.
Jednotkou hustoty ró v soustavě SI je kg·m
-3
.
III.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY (1, 3)
Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provedení metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami.
III.1.4 PODSTATA METOD
Používají se čtyři skupiny metod.
III.1.4.1 Vztlakové metody
III.1.4.1.1 Hustoměry (pro kapaliny)
Dostatečně přesné a rychlé stanovení hustoty lze provést plovoucími hustoměry, které umožní stanovit hustotu kapaliny odečtením hloubky jejich ponoření na kalibrované stupnici.
III.1.4.1.2 Hydrostatické váhy (pro kapaliny a tuhé látky)
Ke stanovení hustoty zkušebního vzorku lze využít rozdíl mezi jeho hmotností stanovenou na vzduchu a ve vhodné kapalině (např. vodě).
U tuhých látek je naměřená hustota reprezentativní jen pro daný použitý vzorek. Při stanovení hustoty kapalin se zváží těleso známého objemu nejdříve na vzduchu a poté v kapalině.
III.1.4.1.3 Metoda ponořené kuličky (pro kapaliny) (4)
Touto metodou se stanoví hustota kapaliny z rozdílu mezi výsledky vážení kapaliny před ponořením kuličky známého objemu do zkušební kapaliny a po něm.
III.1.4.2 Pyknometrické metody
Pro tuhé látky a kapaliny lze použít pyknometry různých tvarů o známém objemu. Hustota se vypočte z rozdílu výsledků vážení plného a prázdného pyknometru a z jeho známého objemu.
III.1.4.3 Vzduchový srovnávací pyknometr (pro tuhé látky)
Hustotu tuhé látky v libovolné formě je možné měřit při pokojové teplotě plynovým srovnávacím pyknometrem. Objem látky se měří ve vzduchu nebo v inertním plynu v kalibrovaném válci nastavitelného objemu. Pro výpočet hustoty se po skončení měření objemu provede vážení.
III.1.4.4 Oscilační densimetr (5, 6, 7)
Hustotu kapaliny lze měřit oscilačním densimetrem. Mechanický oscilátor konstruovaný ve tvaru U­trubice se rozkmitá na rezonanční kmitočet, který závisí na jeho hmotnosti. Po vložení vzorku se rezonanční kmitočet oscilátoru změní. Aparaturu je nutné kalibrovat dvěma kapalinami o známé hustotě. Kapaliny by měly být voleny nejlépe tak, aby pokrývaly rozmezí, ve kterém leží hustota měřeného vzorku.
III.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI
Použitelnost různých metod pro stanovení relativní hustoty je uvedena v tabulce.
III.1.6 POPIS METOD
Normy uvedené jako příklady, ve kterých je možno vyhledat technické podrobnosti, jsou uvedeny v doplňku. Zkoušky musí být provedeny při 20 st.C a provedou se nejméně dvě měření.
III.2 DATA
Viz normy.
III.3 ZPRÁVY
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:
— použitá metoda,
— přesná specifikace látky (identita a nečistoty) a popř. informace o provedeném předběžném čištění.
Relativní hustota se uvede podle definice v bodě 1.2 společně se skupenstvím měřené látky.
Musí být uvedeny všechny informace a poznámky, které jsou důležité pro interpretaci výsledků, zejména pokud jde o nečistoty a skupenství látky.
                  TABULKA: POUŽITELNOST METOD
------------------------------------------------------------------
     Metoda měření          Hustota       Nejvyšší    Existující
                                           možná        norma
                                          hodnota
                                         dynamické
                                         viskozity
                        -----------------
                        pevné   kapaliny             
                        látky
------------------------------------------------------------------
1.4.1.1 Hustoměr                   ano     5 Pa*s      ISO 387,
                                                      ISO 649-2,
                                                     NF T 20-050
------------------------------------------------------------------
1.4.1.2 Hydrostatické                                      
       váhy             ano                       ISO 1183 (A),
a)   tuhé látky                    ano     5 Pa*s   ISO 901 a 758
b)   kapaliny
------------------------------------------------------------------
1.4.1.3 Metoda ponořené            ano    20 Pa*s     DIN 53217
kuličky
------------------------------------------------------------------
1.4.2 Pyknometr                                       ISO 3507,
a)   tuhé látky           ano                       ISO 1183 (B),
                                                     NF T 20­053,
b)   kapaliny                      ano    500 Pa*s     ISO 758
------------------------------------------------------------------
1.4.3 Vzduchový           ano                         DIN 55990
srovnávací pyknometr                                   Teil 3,
                                                      DIN 53243
------------------------------------------------------------------
1.4.4 Oscilační                    ano     5 Pa*s          
densimetr
------------------------------------------------------------------
III.4 LITERATURA
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(81) 30 final.
(2) R. Weissberger (ed.), Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry. 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, I, Part 1.
(3) IUPAC. Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry. 1976, 48, 508.
(4) Wagenbreth, H. Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Flüssigkeiten. Technisches Messen tm, 1979, 11, 427-430.
(5) Leopold, H. Die digitale Messung von Flüssigkeiten. Elektronik, 1970, 19, 297-302.
(6) Baumgarten, D. Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen – Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung. Die Pharmazeutische Industrie, 1975, 37, 717-726.
(7) Riemann, J. Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Brauereilaboratorium. Brauwissenschaft, 1976, 9, 253-255.
DODATEK
Technické podobnosti lze vyhledat například v následujících normách.
1. VZTLAKOVÉ METODY
1.1 Hustoměr
DIN 12790, ISO 387 Hydrometer; general instructions
DIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, adjustment and use Part II: Density hydrometers; standardized sizes, designation Part III: Use and test
ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydrometers for general purpose
NF T 20­050 Chemical products for industrial use – Determination of density of liquids – Areometric method
DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydrometers
1.2 Hydrostatické váhy
Pro tuhé látky
ISO 1183 Method A: Methods for determining the density and relative density of plastics including cellular plastics
NF T 20­049 Chemical products for industrial use – Determination of the density of solids other than powders and cellular products – Hydrostatic balance method
ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by displacement
DIN 53479 Testing of plastics and elastomers; determination of density
Pro kapaliny
ISO 901 ISO 758
DIN 51757 Testing of mineral oils and related materials; determination of density
ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 a ASTM D 1481-62
ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method
BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method
1.3 Metoda ponořené kuličky
DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar coating materials; determination of density; immersed body method
2. PYKNOMETRICKÉ METODY
2.1 Pro kapaliny
ISO 3507 Pycnometers
ISO 758 Liquid chemical products; determination of density at 20 st.C
DIN 12797 Gay­Lussac pycnometer (for non- volatile liquids which are not too viscous)
DIN 12798 Lipkin pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100*10
-6
m2*s
-1
at 15 st.C)
DIN 12800 Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 12798)
DIN 12801 Reischauer pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100*10
-6
m2*s
-1
at 20 st.C, applicable in particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids with higher vapour pressure, approximately 1 bar at 90 st.C)
DIN 12806 Hubbard pycnometer (for viscous liquids of all types which do not have too high a vapour pressure, in particular also to paints, varnishes and bitumen)
DIN 12807 Bingham pycnometer (for liquids, as in DIN 12801)
DIN 12808 Jaulmes pycnometer (in particular for ethanol – water mixture)
DIN 12809 Pycnometr with ground­in thermometer and capillary side tube (for liquids which are not too viscous)
DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar products; determination of density by pycnometer
DIN 51757 Point 7: Testing of mineral oils and related materials; determination of density
ASTM D 297 Section 15: Rubber Products – Chemical Analysis
ASTM D 2111 Method C: Halogenated organic compounds
BS 4699 Method for determination of specific gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method)
BS 5903 Method for determination of relative density and density of petroleum products by the capillary – stoppered pycnometer method
NF T 20­053 Chemical products for industrial use – Determination of density of solids in powder and liquids – Pycnometric method
2.2 Pro tuhé látky:
ISO 1183 Method B: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics
NF T 20­053 Chemical products for industrial use – Determination of density of solids in powder and liquids – Pycnometric method
DIN 19683 Determination of the density of soils
3. VZDUCHOVÉ SROVNÁVACÍ PYKNOMETRY
DIN 55990 Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und ähnlichen Beschichtungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der Dichte
DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; Prüfung
IV. METODY PRO STANOVENí TLAKU PAR – METODY UVEDENÉ V BODU A.4 PŘÍLOHY SMĚRNICE 92/69/EHS
IV.1 METODA
Většina dále popsaných metod je založena na Pokynech OECD pro zkoušení (1). Jejich základní principy jsou uvedeny v literatuře (2) a (3).
IV.1.1 ÚVOD
Pro provádění zkoušky je užitečné mít předběžné informace o struktuře, bodu tání a bodu varu zkušební látky.
Neexistuje žádný postup vhodný pro celý rozsah tlaku par. Proto je pro měření tlaku par v rozmezí od <10
-4
Pa do 10
5
Pa doporučeno několik metod. Nečistoty mají obvykle na tlak par vliv, a to v rozsahu, který do značné míry závisí na druhu nečistoty.
Jsou­li ve vzorku přítomny těkavé nečistoty, které by mohly ovlivnit výsledek, může být látka přečištěna.
Může být vhodné uvést tlak par technického materiálu. U některých zde popsaných metod se užívají přístroje s kovovými díly. Tato skutečnost by měla být vzata v úvahu při zkoušení korozivních látek.
IV.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
Tlak par látky je definován jako tlak nasycené páry nad tuhou nebo kapalnou látkou. Při termodynamické rovnováze je tlak par čisté látky pouze funkcí teploty. Jednotkou tlaku v soustavě SI je pascal (Pa).
Dále jsou uvedeny některé dříve používané jednotky s odpovídajícími přepočítávacími faktory:
1 torr (= 1 mm Hg) = 1,333*10
2
Pa
1 fyzikální atmosféra (atm) = 1,013*10
5
Pa
1 bar = 10
5
Pa
Jednotkou termodynamické teploty v soustavě SI je kelvin (K).
Univerzální molární plynová konstanta R má hodnotu 8,314 J*mol
-1
*K
-1
.
Závislost tlaku par na teplotě je popsána Clausiovou­Clapeyronovou rovnicí:
                delta H
v
log p = ---------- + konst. 2,3 RT
kde
p = tlak par látky v Pa,
delta H
v
= výparné teplo v J*mol
-1
,
R = univerzální molární plynová konstanta v J*mol
-1
*K
-1
,
T = termodynamická teplota v K.
IV.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provedení metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami.
IV.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍCH METOD
Pro stanovení tlaku par je navrženo sedm metod, které lze používat v různých oblastech hodnot tlaku par. Každou z metod se stanovuje tlak par při různých teplotách. V omezeném rozsahu teplot je logaritmus tlaku par čisté látky nepřímo úměrný teplotě.
IV.1.4.1 Dynamická metoda
Při dynamické metodě se měří teplota varu při daném tlaku.
Doporučený rozsah:
10
3
až 10
5
Pa,
Tato metoda se rovněž doporučuje pro stanovení bodu varu a je vhodná až do teploty 600 K.
IV.1.4.2 Statická metoda
Statickou metodou se měří tlak par, který se ustaví při termodynamické rovnováze v uzavřeném systému při dané teplotě. Tato metoda je vhodná pro jednosložkové i vícesložkové tuhé látky a kapaliny.
Doporučený rozsah:
10 až 10
5
Pa
Při potřebné pečlivosti lze tuto metodu použít také pro oblast od 1 do 10 Pa.
IV.1.4.3 Isoteniskop
Tato normalizovaná metoda je rovněž statickou metodou, obecně však není vhodná pro vícesložkové systémy. Bližší informace lze získat v metodě ASTM D­2879­86.
Doporučený rozsah:
100 až 10
5
Pa.
IV.1.4.4 Efusní metoda: Váhy pro měření tlaku par
Ve vakuu se stanoví množství látky, které opustí měřicí celu za časovou jednotku otvorem známé velikosti tak, že může být zanedbán návrat látky do měřicí cely (např. měřením impulsů generovaných prouděním par na citlivých vahách nebo stanovením ztráty hmotnosti).
Doporučený rozsah:
10
-3
až 1 Pa.
IV.1.4.5 Efusní metoda: Měření hmotnostního úbytku nebo měření záchytem parní fáze
Metoda je založena na stanovení hmotnosti par zkušební látky unikající za jednotku času z Knudsenovy komůrky (4) mikrodýzou za podmínek vysokého vakua. Hmotnost difundujících par může být zjištěna buď stanovením úbytku hmotnosti komůrky, nebo kondenzací par při nízké teplotě a stanovením jejich množství chromatografickou analýzou. Tlak se vypočte za použití Herzovy-Knudsenovy rovnice.
Doporučený rozsah:
10
-3
až 1 Pa
IV.1.4.6 Metoda nasycení plynu
Nad látkou se vede proud inertního nosného plynu tak, že se nasytí jejími parami. Množství látky, které se přenese známým množstvím nosného plynu, lze stanovit zachycením ve vhodném lapači nebo průtokovou analytickou technikou. Z něho se vypočte tlak par při dané teplotě.
Doporučený rozsah:
10
-4
až 1 Pa.
Při potřebné pečlivosti lze tuto metodu použít také pro oblast od 1 do 10 Pa.
IV.1.4.7 Rotující tělísko
V zařízení s rotujícím tělískem je měřicím prvkem malá ocelová kulička zavěšená v magnetickém poli, která vysokou rychlostí rotuje. Tlak plynu se odvozuje ze zpomalení ocelové kuličky, které je závislé na tlaku plynu.
Doporučená oblast měření:
10
-4
až 0,5 Pa.
IV.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI V následující tabulce je uvedeno srovnání různých metod stanovení tlaku par z hlediska jejich použitelnosti, opakovatelnosti, reprodukovatelnosti, oblasti měření a existujících norem.

                                    KRITÉRIA JAKOSTI
-------------------------------------------- -------------------------------------------
  Metoda        Látky           Odhad              Odhad         Doporučená Existující
  měření                  opakovatelnosti1)  reprodukovatelnosti1)   oblast     norma
            --------------                                                    
             tuhé kapalné                                                   
-------------------------------------------- -------------------------------------------
1.4.1         s     ano        do 25 %            do 25 %        10
3
Pa až — Dynamická nízkým 2 × 10
3
Pa metoda bodem 1 až 5 % 1 až 5 % — tání 2 × 10
3
Pa až 10
5
Pa2) -------------------------------------------- ------------------------------------------- 1.4.2 ano ano 5 až 10 % 5 až 10 % 10 Pa až NF T Statická 10
5
Pa2) 20­048(5) metoda -------------------------------------------- ------------------------------------------- 1.4.3 ano ano 5 až 10 % 5 až 10 % 10
2
Pa až ASTM­D Isoteniskop 10
5
Pa 2879­86 -------------------------------------------- ------------------------------------------- 1.4.4 ano ano 5 až 20 % do 50 % 10
-3
Pa až NF T Efusní 1 Pa 20­047(6) metoda - váhy pro měření tlaku par -------------------------------------------- ------------------------------------------- 1.4.5 ano ano 10 až 30 % — 10
-3
Pa až — Efusní 1 Pa metoda - měření úbytku par -------------------------------------------- ------------------------------------------- 1.4.6 ano ano 10 až 30 % do 50 % 10
-4
Pa až — Metoda 1 Pa2) sycení plynu -------------------------------------------- ------------------------------------------- 1.4.7 ano ano 10 až 20 % — 10
-4
Pa až — Metoda 0,5 Pa rotujícího tělíska -------------------------------------------- ------------------------------------------- 1) V závislosti na stupni čistoty látky. 2) Metody mohou být při pečlivém provedení použity také pro rozmezí 1 až 10 Pa.
IV.1.6 POPIS METOD
IV.1.6.1 Dynamická metoda
IV.1.6.1.1 Aparatura
Aparatura je obecně tvořena varnou nádobou s nasazeným chladičem ze skla nebo kovu (obrázek l), zařízením pro měření teploty, zařízením pro regulaci a měření tlaku.
Typická měřicí aparatura znázorněná na obrázku je ze žáruvzdorného skla a skládá se z pěti částí:
Velká, částečně dvojitě oplášťovaná trubice sestává ze zábrusového spoje, z chladiče, z chladicí baňky a ze vpusti.
Skleněný válec s Cottrellovou vývěvou je umístěn ve varné část trubice a má zdrsněný vnitřní povrch ze slinutého skla, aby se zabránilo „utajenému“ varu.
Teplota se měří vhodným teplotním čidlem (např. odporovým teploměrem, plášťovým termočlánkem) zasunutým do aparatury až k místu měření (obrázek 1, číslo 5) přes vhodnou spojku (např. s vnějším zábrusem).
Musí být vytvořeno nezbytné spojení k regulátoru tlaku a k měřicímu zařízení.
Přes kapiláru je s měřicí aparaturou spojena kulatá baňka, která slouží jako vyrovnávací objem.
Varná nádoba je vyhřívána topnou vložkou např. zavedenou zespoda do skleněné aparatury. Požadovaná intenzita proudu pro ohřev se nastavuje a reguluje prostřednictvím termočlánku.
Potřebný podtlak mezi 10
2
Pa a přibližně 10
5
Pa se dosáhne pomocí vývěvy.
K měření a regulaci tlaku vzduchu nebo dusíku (měřicí rozsah přibližně 10
2
až 10
5
Pa) a k ventilaci se použije vhodný ventil.
Tlak se měří manometrem.
IV.1.6.1.2 Postup měření
Pro stanovení tlaku par vzorku se měří jeho teplota varu při různých specifikovaných tlacích mezi asi 10
3
a 10
5
Pa. Ustálení teploty při konstantním tlaku znamená, že bylo dosaženo teploty varu. Tato metoda není vhodná pro měření látek, které pění.
Látka se umístí do čisté, suché vzorkovnice. Při plnění tuhých látek, které nejsou ve formě prášku, může dojít k problémům, které však lze někdy obejít zahřátím chladicího pláště. Po naplnění se aparatura uzavře přírubou a látka se odplyní. Poté se nastaví nejnižší požadovaný tlak a zapne se ohřev. Současně se teplotní čidlo připojí k zapisovači.
Rovnováhy je dosaženo, je-li při konstantním tlaku zaznamenána konstantní teplota varu. Je třeba věnovat zvláštní pozornost tomu, aby se zabránilo prudkému uvolňování par během varu. Navíc musí dojít k úplné kondenzaci v chladiči. Při stanovování tlaku par u nízkotajících pevných látek je třeba dbát na to, aby nedošlo k ucpání chladiče.
Po zaznamenání naměřeného rovnovážného teplotního bodu se nastaví vyšší tlak. Takto se pokračuje, dokud se nedosáhne tlaku 10
5
Pa (celkem asi 5 až 10 měření). Pro kontrolu se musí stanovení rovnovážných bodů opakovat při klesajících hodnotách tlaku.
IV.1.6.2 Statické měření
IV.1.6.2.1 Aparatura
Aparatura sestává ze zásobníku vzorku, z ohřívací a chladicí soustavy k regulaci teploty vzorku a měření teploty. Aparatura též zahrnuje zařízení k nastavení a měření tlaku. Základní principy jsou znázorněny na obrázcích 2a a 2b.
Baňka na vzorek (obrázek 2a) je z jedné strany uzavřena vhodným vysokovakuovým ventilem. Z druhé strany je připojena U­trubice obsahující vhodnou manometrickou kapalinu. Jeden konec U­trubice je napojen k vývěvě, k tlakové lahvi s dusíkem, nebo k odvzdušňovacímu ventilu a k manometru.
Místo U­trubice se dá použít manometr s ukazatelem tlaku (obrázek 2b).
Za účelem regulace teploty vzorku je baňka se vzorkem spolu s ventilem a U­trubicí či tlakoměrem umístěna v lázni s konstantní teplotou udržovanou s přesností +/- 0,2 K. Teplota se měří na vnější straně baňky se vzorkem nebo v baňce samotné.
K evakuaci aparatury se užije vývěva s protiproudým chlazeným lapačem.
U metody 2a se tlak par látky měří nepřímo za použití indikátoru nuly. Přitom se zohledňuje skutečnost, že se hustota kapaliny při velkých změnách teploty v U­trubici mění.
V závislosti na rozsahu tlaků a v závislosti na chemickém chování zkušební látky jsou jako indikátory nuly pro U­trubici vhodné následující látky: silikonové oleje, ftaláty. Zkušební látka se nesmí znatelně rozpouštět ani nesmí reagovat s kapalinou v U­trubici.
V oblasti normálního tlaku vzduchu do 10
2
Pa lze v manometru používat rtuť, zatímco silikonové oleje a ftaláty je vhodné používat pro tlak od 10 Pa do 10
2
Pa. Ohřívatelné membránové kapacitní manometry lze dokonce používat pro tlak nižší než 10
-1
Pa. Existují též jiná měřidla tlaku, která lze použít pro tlaky pod 10
2
Pa.
IV.1.6.2.2 Postup měření
Před měřením se všechny části aparatury znázorněné na obrázku 2 důkladně očistí a vysuší.
V případě metody 2a se U­trubice naplní zvolenou kapalinou, která musí být před použitím odplyněna za zvýšené teploty.
Zkušební látka se vloží do aparatury, která se uzavře a sníží se v ní teplota, aby došlo k odplynění. Teplota musí být dostatečně nízká, aby se zajistilo vysátí vzduchu, aniž by došlo u vícesložkových směsných materiálů ke změně jejich složení, V případě potřeby lze rovnováhy rychleji dosáhnout mícháním.
Vzorek může být podchlazen např. kapalným dusíkem (je nutno zabránit kondenzaci vzduchu nebo kapaliny z vývěvy) nebo směsí ethylalkoholu a suchého ledu. Pro měření nízkých teplot se použije lázeň s teplotou regulovanou připojením k chladicímu systému (ultrakryomatu).
Při otevřeném ventilu nádoby se vzorkem se připojí na několik minut odsávání, aby se odstranil vzduch. Ventil se poté uzavře a teplota vzorku se sníží na nejnižší požadovanou úroveň. Je-li to nutné, musí se odplyňovací postup několikrát opakovat.
Při zahřívání vzorku roste tlak par. To mění rovnováhu kapaliny v U­trubici. Aby se změna kompenzovala, připouští se ventilem dusík nebo vzduch do té doby, dokud není indikátor tlaku opět na nule. Tlak potřebný k ustavení nulové hodnoty může být odečten přesným manometrem při laboratorní teplotě. Tento tlak odpovídá tenzi par látky při dané teplotě měření.
Metoda 2b je podobná, ale tlak par se odečítá přímo.
Závislost tlaku par na teplotě se stanoví ve vhodných krátkých intervalech (celkem přibližně 5 až 10 bodů měření) až do požadovaného maxima. Odečty při nízkých teplotách se musí pro kontrolu opakovat.
Neleží-li hodnoty zjištěné z opakovaných odečtů na křivce zjištěné pro zvyšující se teplotu, může to být způsobeno jednou z těchto příčin:
1. Vzorek stále obsahuje vzduch (např. u vysoce viskózních materiálů) nebo obsahuje látky s nízkým bodem varu, které jsou při zahřátí uvolňovány a které lze odstranit odsátím po předchozím podchlazení.
2. Teplota podchlazení není dostatečně nízká. V tomto případě se použije jako chladicí médium tekutý dusík.
Pokud nastane případ 1 nebo 2, musí se měření opakovat.
3. V látce probíhá ve vyšetřovaném teplotním rozsahu chemická reakce (např. rozklad, polymerace).
IV.1.6.3 Isoteniskop
Úplný popis této metody je uveden v literatuře (7). Princip měřicího zařízení je znázorněn na obrázku 3. Podobně jako statická metoda popsaná v bodě 1.6.2 je isoteniskop vhodný k vyšetřování tuhých látek i kapalin.
V případě kapalin slouží látka samotná jako indikační sloupec v pomocném manometru. Do isoteniskopu se odměří množství kapaliny postačující k naplnění baňky a krátkého ramene manometru. Isoteniskop se připojí k vakuovému systému, evakuuje se a poté se naplní dusíkem. Evakuace a výplach systému se opakuje dvakrát, aby se odstranil veškerý zbytkový kyslík. Naplněný isoteniskop se umístí do horizontální polohy, aby se vzorek rozprostřel v baňce a v U­části manometru do tenké vrstvy. Tlak v systému se sníží na 133 Pa a vzorek se opatrně zahřeje právě k varu (odstranění rozpuštěných plynů). Poté se isoteniskop vrátí do původní polohy tak, aby se vzorek vrátil do baňky a krátkého ramene manometru, takže oba díly jsou zcela naplněny kapalinou. Tlak se udržuje jako při odplyňování; špička baňky se zahřívá malým plamenem, dokud uvolněná pára neexpanduje natolik, že přetlačí část vzorku z horní části baňky a ramene manometru do manometrické části isoteniskopu, přičemž se vytvoří prostor bez dusíku, naplněný výhradně parami.
Isoteniskop se poté vloží do lázně se stálou teplotou a tlak dusíku se upraví tak, aby se rovnal tlaku vzorku. Rovnovážný tlak je udáván manometrickou částí isoteniskopu. V rovnováze se rovná tlak dusíku tenzi par látky.
U tuhých látek se v závislosti na oblasti tlaku a teploty používají manometrické kapaliny uvedené v bodě 1.6.2.1. Odplyněná manometrická kapalina se naplní do rozšířené části dlouhého ramene isoteniskopu. Poté se vyšetřovaná látka naplní do baňky a odplyní se při zvýšené teplotě. Isoteniskop se poté nakloní, aby manometrická kapalina natekla do U­trubice. Měření závislosti tlaku par na teplotě se provede jako v bodě 1.6.2.
IV.1.6.4 Efusní metoda: Váhy pro měření tlaku par
IV.1.6.4.1 Aparatura
V literatuře jsou popsána různá provedení aparatury (1). Aparatura popsaná zde slouží ke znázornění použitého obecného principu (obrázek 4). Na obrázku 4 jsou znázorněny hlavní části aparatury složené z vysokovakuové komory z korozivzdorné oceli nebo ze skla, z vývěvy a měřiče vakua a z vestavěného zařízení pro měření tlaku par pomocí vah. V aparatuře jsou vestavěny následující díly:
— odpařovací pícka s přírubou a otočnou průchodkou. Odpařovací pícku tvoří válcová nádoba vyrobená např. z mědi nebo z chemicky odolné slitiny s dobrou tepelnou vodivostí. Rovněž lze použít skleněnou nádobu opatřenou měděným pláštěm. Pícka má průměr přibližně 3 až 5 cm a je 2 až 5 cm vysoká. Je opatřena jedním až třemi otvory různé velikosti pro průchod par. Pícka je vyhřívána buď podstavenou vyhřívací destičkou nebo topnou spirálou v plášti. Aby nedošlo k rozptylování tepla do základní desky, je spojení vyhřívací destičky se základní realizováno deskou přes materiál s nízkou tepelnou vodivostí (stříbroniklová nebo chromniklová ocel); je-li např. použita pícka s několika průchody, je izolace tvořena stříbroniklovými trubicemi připojenými k rotující ose pícky. Toto uspořádání je výhodné, neboť umožňuje zavedení měděné tyče. Je tím umožněno chlazení z vnějšku chladicí lázní,
— je­li měděné víko pícky opatřeno třemi otvory různého průměru, jejichž poloha je posunuta vůči sobě o 90°, pokrývá měření široký rozsah tlaků par (otvory o průměru 0,30 až 4,50 mm). Široké otvory se použijí při nízkých tlacích par a naopak. Otáčením pícky se žádaný otvor nebo mezipoloha nastaví do směru toku páry (v ose se nachází otvor pícky – clona – miska vah) a proud molekul se propustí nebo odkloní otvorem pícky na misku vah. Pro měření teploty látky se na vhodné místo umístí termočlánek nebo odporový teploměr,
— nad clonou je miska velmi citlivých mikrovah (viz níže). Miska vah má průměr přibližně 30 mm. Vhodným materiálem je pozlacený hliník,
— miska vah je obklopena válcovitým chladicím blokem z mosazi nebo mědi. Otvory v bloku jsou přizpůsobeny typu raménka podle typu vah a otvor ve cloně musí umožnit průchod proudu molekul a současně musí zajišťovat úplné zkapalnění par na misce. Odvod tepla směrem ven je zajištěn např. měděnou tyčí připojenou k chladicímu bloku. Tyč prochází základní deskou a je od ní tepelně izolována např. trubicí z chromniklové oceli. Tyč je ponořena do Dewarovy nádoby s kapalným dusíkem umístěné pod základní deskou a/nebo se zajistí cirkulace kapalného dusíku přímo provrtanou tyčí. Chladicí blok je tak udržován při teplotě -120 st.C. Miska vah je chlazena výhradně vyzařováním, které pro vyšetřovanou oblast tlaku postačuje (zahájení chlazení přibližně 1 h před začátkem měření),
— váha je umístěna nad chladicím blokem. Vhodné váhy jsou např. vysoce citlivé dvojramenné elektronické mikrováhy nebo vysoce citlivý přístroj s pohyblivou cívkou (viz Pokyny OECD pro zkoušení 104, vydání 12.5.1981),
— v základní desce jsou také elektrické zásuvky pro připojení termočlánků (nebo odporových teploměrů) a topných spirál,
— vakuum se vytváří v nádobě pomocí středněvakuové nebo vysokovakuové pumpy (požadované vakuum přibližně 1 až 2*10
-3
Pa, kterého se dosáhne po dvouhodinovém odsávání). Tlak se sleduje vhodným ionizačním manometrem.
IV.1.6.4.2 Postup měření
Nádoba se naplní zkušební látkou a uzavře se víčkem. Clona a chladicí blok jsou vysunuty proti pícce. Aparatura se uzavře a spustí se vývěvy. Před zahájením měření by měl být tlak asi 10
-4
Pa. Od 10
-2
Pa je třeba začít s chlazením chladicího bloku. Po dosažení potřebného vakua se zahájí řada kalibračních měření při nejnižší požadované teplotě. Otevře se odpovídající otvor ve víku, proud páry projde clonou umístěnou nad ním a dopadne na ochlazovanou misku vah. Miska vah musí být dostatečně velká, aby zajistila zachycení veškeré páry procházející clonou. Hybnost proudu par působí jako síla proti misce vah a molekuly se srážejí na jejím studeném povrchu.
Hybnost a současná kondenzace vytvářejí signál v zapisovači. Vyhodnocení signálu poskytuje dva druhy informací:
1. V popsaném zařízení je tlak par určen přímo z působení na misku vah (k tomu není třeba znát molekulovou hmotnost (2)). Při vyhodnocení odečtu musí být vzaty v úvahu geometrické faktory, jako jsou otvor v pícce a úhel molekulárního proudu.
2. Současně může být měřeno množství kondenzátu, z čehož může být vypočtena rychlost vypařování. Tlak par může být také vypočítán z rychlosti vypařování a z molekulové hmotnosti pomocí Hertzovy rovnice (2).
                              2 píRT x 10 
3
p = G odmocnina -------------------- M
kde
G = rychlost vypařování (kg*s
-1
*m
-2
),
M = molekulová hmotnost (g*mol
-1
),
T = termodynamická teplota (K),
R = univerzální molární plynová konstanta (J*mol
-1
*K
-1
),
p = tlak páry (Pa).
Poté, co je dosaženo potřebného vakua, začíná série měření při nejnižší možné teplotě.
Pro další měření se teplota zvyšuje v malých intervalech, dokud se nedosáhne její nejvyšší požadované hodnoty. Vzorek se poté znovu ochladí a je možné zaznamenat druhou křivku tlaku par. Jestliže se při druhém opakování nepotvrdí výsledek prvního měření, je možné, že se látka v dané teplotní oblasti měření rozkládá.
IV.1.6.5 Efusní metoda: Měření hmotnostního úbytku
IV.1.6.5.1 Aparatura
Zařízení se skládá z následujících částí:
— blok, ve kterém jsou umístěny efusní komůrky, s možností termostatování a evakuace,
— vysokovakuová vývěva (např. difusní vývěva nebo turbomolekulární vývěva) a podtlakové měřidlo,
— zařízení pro zachycování par se zkapalněným dusíkem nebo suchým ledem.
Elektricky vyhřívaný hliníkový vakuový blok se čtyřmi ocelovými efusními komůrkami je znázorněn jako příklad na obrázku 5. Membrána z korozivzdorné oceli tloušťky asi 0,3 mm s efusním otvorem o průměru 0,2 až 1 mm je připojena k efusní komůrce víčkem opatřeným závitem.
IV.1.6.5.2 Postup měření
Do každé efusní komůrky se umístí referenční a zkušební látka, kovová membrána s otvorem se zajistí šroubovacím víčkem a každá komůrka se zváží s přesností na 0,1 mg. Měřicí komůrka se umístí do termostatovaného bloku, který se poté evakuuje na tlak nižší, než je jedna desetina očekávaného tlaku par. Ve stanovených časových intervalech v rozmezí od 5 do 30 h se do zařízení vpouští vzduch a úbytek hmotnosti efusní komůrky se stanoví opakovaným vážením.
Aby bylo zajištěno, že výsledky nebudou ovlivněny těkavými nečistotami, váží se komůrka opakovaně ve stanovených časových intervalech a tak se kontroluje, zda je rychlost odpařování konstantní nejméně po dva měřicí intervaly.
      
       Tlak par p je dán vztahem:

           m              2pí RT
      p = ----  odmocnina ---------
          KAt               M
           
kde
p = tlak par (Pa),
m = hmotnost látky opouštějící komůrku za čas t (kg),
t = čas (s),
A = plocha otvoru (m
2
),
K = korekční faktor,
R = univerzální plynová konstanta (J*mol
-1
*K
-1
),
T = teplota (K),
M = molekulární hmotnost (kg*mol
-1
).
       Korekční  faktor  K závisí na poměru délky  a  poloměru
       kruhového otvoru:

poměr:            0,1      0,2     0,6     1,0      2,0
K:               0,952    0,909   0,771   0,672    0,514
       Výše uvedená rovnice může být zapsána ve tvaru


              m             T
        p = E -- odmocnina --- 
              t             M

                               
       kde  

      
            1
       E = ---- odmocnina 2pí R       je efusní konstanta komůrky.
            KA

            Tato  efusní  konstanta  může  být  určena  s  využitím
       referenčních látek (2, 9) pomocí následující rovnice:


           p(r)t           M(r)
       E = ----- odmocnina ----
            m                T


                               
   
       p(r) = tlak par referenční látky (Pa)
       M(r) = molekulární hmotnost referenční látky (kg*mol
-1
).
IV.1.6.6. Metoda nasycení plynu
IV.1.6.6.1 Aparatura
Typická aparatura používaná pro tuto zkoušku sestává z řady dále popsaných a na obrázku 6a vyobrazených částí (1).
Inertní plyn:
Nosný plyn nesmí se zkušební látkou chemicky reagovat. Obvykle je vhodný dusík, někdy je však nutné použít jiné plyny (10). Použitý plyn musí být suchý (viz obrázek 6a, číslo 4: čidlo pro měření relativní vlhkosti plynu).
Kontrola průtoku:
Pro kontrolu průtoku plynu je nezbytný vhodný regulační systém pro zajištění konstantního a podle potřeby nastavitelného průtoku plynu syticí kolonou.
Zařízení pro zachycování par:
Jejich výběr závisí na vlastnostech zkoumané látky a na zvolené analytické metodě. Páry by se měly zachycovat kvantitativně a ve formě, která umožní následnou analýzu. Pro některé zkušební látky jsou vhodné lapače obsahující kapaliny jako hexan nebo ethylenglykol. Pro jiné látky lze použít tuhé absorbenty.
Jako alternativní metody zachycení páry a následné analýzy mohou být ke stanovení množství hmoty transportované známým množstvím nosného plynu použity průtokové analytické techniky, jako je chromatografie. Navíc může být měřen úbytek hmotnosti vzorku.
Výměník tepla:
Pro měření při různých teplotách může být nezbytné zabudovat do aparatury výměník tepla.
Syticí kolona:
Zkušební látka se v rozpuštěné formě nanese na vhodný inertní nosič. Nosič s nanesenou látkou se vloží do sytící kolony. Kolona by měla být dimenzována a průtok plynu nastaven tak, aby bylo zaručeno úplné nasycení nosného plynu. Kyticí kolonu je nutno termostatovat. Má- li se měřit při teplotách nad laboratorní teplotou, musí být části aparatury mezi sytící kolonou a zařízeními pro zachycování par rovněž ohřívány, aby se zamezilo kondenzaci zkušební látky.
Za sytič kolony může být umístěna kapilára (obrázek 6b), aby se snížil tok hmoty způsobený difůzí.
IV.1.6.6.2 Postup měření
Příprava sytící kolony:
Roztok zkušební látky ve vysoce těkavém rozpouštědle se přidá k přiměřenému množství nosiče. Mělo by být přidáno dostatečné množství zkušební látky, aby bylo zajištěno nasycení po celou dobu zkoušky. Rozpouštědlo se úplně odpaří na vzduchu nebo v rotačním odpařovači a pečlivě promísený materiál se přidá do sytící kolony. Po zahřátí vzorku se aparaturou vede suchý dusík.
Měření:
Zařízení na zachycování par nebo průtokové detektory se připojí na výstup z kolony a měří se čas. Na počátku a v pravidelných intervalech během měření se kontroluje průtok počítačem bublinek (nebo kontinuálně průtokoměrem).
Na výstupu ze sytící kolony je nutno měřit tlak. To lze provést
a) zapojením manometru mezi kolonu a lapače (tento způsob nemusí být zcela uspokojivý, protože se zvyšuje mrtvý objem a zvětšuje se adsorpční plocha); nebo
b) stanovením tlakových úbytků za použitým zachycovacím zařízením jako funkce objemového průtoku v samostatném experimentu (toto nemusí přinášet uspokojivé výsledky pro lapače s absorpčními kapalinami).
Doba potřebná pro zachycení množství látky nezbytného pro jednotlivé metody analýzy se určí předběžnými pokusy nebo odhadem. Jako alternativa zachycení látky pro další analýzu může být užita průtoková kvantitativní analytická technika (např. chromatografie). Před výpočtem tlaku par při dané teplotě se provedou předběžné pokusy pro stanovení maximální průtokové rychlosti, při které je nosný plyn dokonale nasycen parami látky. Za tímto účelem se zavádí nosný plyn do sytící kolony nízkým objemovým průtokem voleným tak, že dalším snižováním průtokové rychlosti již vypočtená hodnota tlaku par neroste.
Specifická analytická metoda závisí na druhu studované látky (např. plynová chromatografie nebo gravimetrie).
Stanoví se množství látky, které je unášeno známým objemem nosného plynu.
IV.1.6.6.3 Výpočet tlaku par
       Tlak par se počítá z hustoty par, W/V, podle rovnice:
        
        
               W    RT
          p = --- x ---
               V     M           
       kde
       p =  tlak par (Pa),
       W =  hmotnost odpařené zkušební látky (g),
       V =  objem nasyceného plynu (m
3
), R = univerzální molární plynová konstanta (J*mol
-1
*K
-1
), T = termodynamická teplota (K), M = molární hmotnost (g*mol
-1
). Naměřené objemy musí být korigovány v důsledku rozdílů tlaků a teplot mezi průtokoměrem a sytící kolonou vyhřívanou termostatem. Je-li průtokoměr zařazen za lapači, může být nezbytné provést korekce s ohledem na podíl složek odpařených z lapače (1).
IV.1.6.7 Rotující tělísko (8, 11, 13)
IV.1.6.7.1 Aparatura
Metoda rotujícího tělíska může být provedena za použití měřiče viskozity s rotujícím tělískem, znázorněného na obrázku 8. Schematický nákres měřicí soustavy je znázorněn na obrázku 7.
Typické měřicí zařízení má měřicí hlavu s rotujícím tělískem, umístěnou v termostatovaném prostoru (regulovaném s přesností na 0,1 st.C). Nádobka se vzorkem je umístěna do termostatovaného prostoru (regulovaného s přesností na 0,01 st.C). Všechny ostatní části zařízení jsou udržovány při vyšší teplotě, aby nedocházelo ke kondenzaci. K zařízení se vakuovými ventily připojí vysokovakuová vývěva.
Měřicí hlava s rotujícím tělískem se skládá z ocelové kuličky (průměr 4 až 5 mm) umístěné v trubici. Kulička je zavěšena a stabilizována v magnetickém poli obvykle s využitím kombinace permanentních magnetů a regulačních cívek.
Kulička je uváděna do rotačního pohybu rotujícími magnetickými poli produkovanými cívkami. Zvedací cívky měřící nízkou, ale trvalou zbytkovou magnetizaci kuličky, umožňují měření rotační rychlosti.
IV.1.6.7.2 Postup měření
Jakmile kulička dosáhne stanovenou rotační rychlost v(0) (obvykle asi 400 otáček za sekundu), zastaví se další napájení a zahájí se zpomalování vyvolané brzdicím účinkem plynu.
Pokles rotační rychlosti je měřen jako funkce času. Vzhledem k tomu, že brzdění způsobené magnetickým závěsem je zanedbatelné ve srovnání s brzděním způsobeným plynem, je tlak par dán vztahem:
  



kde c = průměrná rychlost molekul plynu, r = poloměr kuličky, ró = hustota kuličky, sigma = koeficient tečného přenosového impulsu (ró = 1 pro ideálně kulový povrch kuličky), t = čas, v
(t)
= rotační rychlost po čase t, v
(0)
= počáteční rotační rychlost. Rovnice může být rovněž napsána ve tvaru:


kde tn, t
n-1
jsou časy potřebné pro stanovený počet rotací N. Časové intervaly tn, tn
-1
následují za sebou a tn > tn
-1
. Průměrná rychlost molekul plynu je dána vztahem:


kde T = teplota, R = univerzální molární plynová konstanta, M = molární hmotnost.
IV.2 DATA
Stanovení tlaku par kteroukoli z výše popsaných metod by se mělo provést nejméně při dvou teplotách. Aby se ověřil lineární průběh křivky tlaku par v oblasti teplot od 0 st.C do 50 st.C, doporučuje se měření při třech nebo více teplotách.
IV.3 ZPRÁVY
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:
— použitá metoda,
— přesná specifikace látky (identita a nečistoty) a popř. informace o provedeném předběžném čištění,
— nejméně dvě hodnoty tlaku par a teploty, pokud možno v oblasti 0 st.C až 50 st.C,
— všechny původní údaje,
— křivka závislosti log p na 1/T,
— odhadnutá hodnota tlaku par při 20 st.C nebo 25 st.C.
Zjistí­li se změna stavu (fázový přechod, rozklad), měly by být uvedeny následující skutečnosti:
— druh změny,
— teplota při atmosférickém tlaku, při které ke změně dochází,
— hodnoty tlaku par při 10 st.C a 20 st.C pod teplotou přechodu a nad teplotou přechodu (s výjimkou přechodů z tuhého do plynného skupenství).
Musí být uvedeny všechny informace a poznámky, které jsou důležité pro interpretaci výsledků, zejména pokud jde o nečistoty a fyzikální stav látky.
IV.4 LITERATURA
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104, Decision of the Council C(81) 30 final.
(2) Ambrose, D. V: B. Le Neindre, B. Vodar, (eds.): Experimental Thermodynamics. Butterworths, London, 1975, II.
(3) R. Weissberger (ed.): Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry. 3rd ed. Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, I, Part I.
(4) Knudsen, M. Ann. Phys. Lpz., 1909, 29, 1979; 1911, 34, 593.
(5) NF T 20-048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10
-1
to 105 Pa – Static method.
(6) NF T 20-047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10
-3
to 1 Pa – Vapour pressure balance method.
(7) ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure- temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope.
(8) G. Messer, P. Röhl, G. Grosse, W. Jitschin. J. Vac. Sci. Technol. (A), 1987, 5 (4), 2440.
(9) Ambrose, D., Lawrenson, I. J., Sprake, C. H. S. J. Chem. Thermodynamics 1975, 7, 1173.
(10) B. F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, 85, 435.
(11) G. Comsa, J. K. Fremerey, B. Lindenau. J. Vac. Sci. Technol., 1980, 17 (2), 642.
(12) G. Reich. J. Vac. Sci. Technol., 1982, 20 (4), 1148.
(13) J. K. Fremerey. J. Vac. Sci. Technol. (A), 1985, 3 (3), 1715.
DODATEK 1
Metoda odhadu
ÚVOD
Vypočtené hodnoty tlaku par lze využít
— k rozhodnutí, která z experimentálních metod je vhodná,
— k provedení odhadu nebo ke stanovení mezní hodnoty v případech, kdy nelze z technických důvodů použít experimentální metodu (včetně případů, kdy je tlak par velmi nízký),
— jako pomoc při vyhledání případů, kdy je neprovedení experimentálního měření odůvodnitelné, neboť tlak par je při laboratorní teplotě pravděpodobně < 10
-5
Pa.
METODA ODHADU
Tlak par kapalin a tuhých látek může být odhadnut pomocí modifikovaného Watsonova korelačního vztahu (a). Požaduje se pouze jeden experimentální údaj, a to teplota varu za normálního tlaku. Metoda je použitelná pro tlaky od 105 do 10
-5
Pa.
Podrobná informace o metodě je uvedena v příručce Handbook of Chemical Property Estimation Methods (b).
POSTUP VÝPOČTU Podle příručky (b) se tlak par vypočte podle vzorce:
    


kde
T =  teplota, pro kterou je tlak par vypočítáván
T
b
= teplota varu při normálním tlaku P
vp
= tlak par při teplotě T deltaH
vb
= výparné teplo deltaZ
b
= faktor stlačitelnosti (použije se hodnota 0,97) m = empirický faktor, jehož hodnota závisí na fyzikálním stavu při teplotě, pro níž je prováděn výpočet Dále


kde K
F
je empirický součinitel zohledňující polaritu látky. V příručce b) jsou uvedeny hodnoty faktoru KF pro několik typů sloučenin. Velmi často jsou k dispozici údaje o teplotě varu při sníženém tlaku. V takovém případě se podle příručky (b) vypočte tlak par podle následujícího vztahu:


kde T
1
je teplota varu při sníženém tlaku P
1
.
ZPRÁVA
Je­li použita metoda odhadu, musí zpráva obsahovat úplný postup výpočtu.
LITERATURA
a) K. M. Watson, Ind. Eng. Chem. 1943, 35, 398.
b) W. J. Lyman, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt. Handbook of Chemical Estimation Methods. McGraw­Hill, 1982.
DODATEK 2
                           Obrázek 1
  Zařízení pro stanovení křivky tlaku par dynamickou metodou




Obrázek 2a Zařízení pro stanovení křivky tlaku par statickou metodou (s manometrickou U­trubicí)


1. Zkušební látka 6. Lázeň termostatu 2. Plynná fáze 7. Měřidlo teploty 3. Vysokovakuový kohout 8. K vývěvě 4. U­trubice (pomocný 9. Odvzdušnění manometr) 5. Manometr Obrázek 2b Zařízení pro stanovení křivky tlaku par statickou metodou (s použitím ukazatele tlaku)


1. Zkušební látka 5. Ukazatel tlaku 2. Plynná fáze 6. Lázeň termostatu 3. Vysokovakuový kohout 7. Měřidlo teploty 4. Stupnice tlaku Obrázek 3 Isoteniskop (viz literatura (7))


1. K systému měření a kontroly tlaku 2. Trubice s vnějším průměrem 8 mm 3. Suchý dusík v tlakovém systému 4. Páry vzorku 5. Špička baňky 6. Kapalný vzorek Obrázek 4 Zařízení pro stanovení křivky tlaku par podle metody stanovení tlaku par pomocí vah


1. Zkušební látka 7. Clona 2. Plynná fáze s proudem par 8. Tyčka chladicího bloku 3. Odpařovací pícka s otočným 9. Miska vah vstupem 3a. Víko s otvory 10. Mikrováhy 4. Vyhřívání pícky (chlazení) 11. K zapisovači 5. Měření teploty vzorku 12. K vysokovakuové vývěvě 6. Chladicí box Obrázek 5 Příklad zařízení pro odpařování za nízkého tlaku při efusní metodě, vybaveného efusní komůrkou o objemu 8 cm
3



1. Přípojka k vakuu 2. Otvory pro platinový odporový teploměr nebo pro systém měření a kontroly teploty (2) 3. Víko vakuového bloku 4. O­kroužek 5. Hliníkový vakuový blok 6. Zařízení pro zasouvání a vytahování efusních komůrek 7. Šroubovací víčko 8. Křídlové matice (6) 9. Šrouby (6) 10. Efusní komůrky z korozivzdorné oceli 11. Topná tělesa (6) Obrázek 6a Příklad průtokového systému pro stanovení tlaku par metodou nasycení plynu


1 = Regulátor průtoku 2 = Výměník tepla 3 = Jehlové ventily 4 = Čidlo pro měření relativní vlhkosti plynu 5 = Saturační kolony 6 = Těsnění z PTFE 7 = Průtokoměr 8 = Lapač (absorbér) 9 = Olejový lapač 10 = Fritový počítač bublinek Obrázek 6b Příklad zařízení pro stanovení tlaku par metodou nasycení plynu s kapilárou zařazenou za syticí kolonu 1. Průtokoměr s vyhřívanou 6. Syticí kolona spirálou 2. Manometr 7. Kapilára 3. Lázeň termostatu 8. Absorbéry 4. Spirála pro termostatování 9. Plynoměr nosného plynu 5. Teploměr (Pt 100) 10. Chlazený lapač Obrázek 7 Příklad experimentálního uspořádání pro metodu rotujícího tělíska Zařízení pro měření tlaku par A. Hlava pro snímání otáček rotujícího tělíska B. Komůrka se vzorkem C. Termostat D. Zdroj vakua (turbomolekulární vývěva) E. Vzduchový termostat obrázky 6b a 7


Obrázek 8 Příklad měřicí hlavy s rotujícím tělískem


1. Kulička 2. Evakuovaný trubkový nástavec k 6 3. Permanentní magnety 4. Cívky (2) pro svislou stabilizaci 5. Hnací cívky (4) 6. Připojovací spojka
V. METODY PRO STANOVENÍ POVRCHOVÉHO NAPĚTÍ – METODY UVEDENÉ V BODU A.5 PŘÍLOHY SMĚRNICE 92/69/EHS
V.1 METODA
Popsané metody jsou založeny na Pokynech OECD pro zkoušení (1). Jejich základní principy jsou uvedeny v literatuře (2).
V.1.1 ÚVOD
Popsané metody jsou určeny pro měření povrchového napětí vodných roztoků.
Před provedením těchto zkoušek je vhodné mít k dispozici předběžné informace o rozpustnosti látky ve vodě, o její struktuře, o hydrolýze a o kritické koncentraci pro tvorbu micel.
Níže uvedené metody jsou použitelné pro většinu chemických látek bez omezení z hlediska stupně jejich čistoty.
Měření povrchového napětí metodou prstencového tenziometru je omezeno na vodné roztoky s dynamickou viskozitou nižší než přibližně 200 mPa·s.
V.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
Povrchová volná enthalpie vztažená na jednotku povrchu se nazývá povrchové napětí.
Povrchové napětí se vyjadřuje těchto jednotkách:
N*m
-1
(v soustavě SI) nebo
mN*m
-1
(odvozená jednotka v soustavě SI)
1 N*m
-1
= 10
3
dyn*cm
-1
1 mN*m
-1
= 1 dyn*cm
-1
ve staré soustavě CGS
V.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provedení metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami.
Referenční látky, které pokrývají široké rozpětí hodnot povrchového napětí, jsou uvedeny v literatuře (1, 3).
V.1.4 PODSTATA METOD
Metody jsou založeny na měření největší síly, kterou je nutné působit ve svislém směru na třmínek nebo prstenec, který se dotýká povrchu zkoumané kapaliny umístěné v měřicí nádobě, aby se od tohoto povrchu oddělil, nebo na destičku, která se svým okrajem dotýká povrchu, aby se vzniklý film vytáhl nahoru.
Látky, jejichž rozpustnost ve vodě dosahuje hodnoty alespoň 1 mg·l
-1
se zkoušejí ve vodných roztocích při jedné koncentraci.
V.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI
Přesnost těchto metod je pravděpodobně vyšší, než je požadováno pro účely hodnocení stavu životního prostředí.
V.1.6 POPIS METOD
Připraví se roztok látky v destilované vodě. Koncentrace roztoku by měla být 90 % koncentrace nasyceného roztoku látky ve vodě; pokud tato koncentrace přesáhne 1 g·l
-1
, použije se k měření roztok o koncentraci 1 g*l
-1
. Látky, jejichž rozpustnost je menší než 1 mg*l
-1
, není nutné zkoušet.
V.1.6.1 Destičková metoda
Viz ISO 304 a NF T 73­060 (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films).
V.1.6.2 Třmínková metoda
Viz ISO 304 a NF T 73­060 (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films).
V.1.6.3 Prstencová metoda
Viz ISO 304 a NF T 73­060 (Surface active agents – determination of surface tension by drawing up liquid films).
V.1.6.4 Harmonizovaná prstencová metoda OECD
V.1.6.4.1 Aparatura
Pro toto měření jsou vhodné komerční tenziometry. Sestávají z těchto částí:
— pohyblivý stolek pro vzorek,
— systém měření síly,
— měřicí tělísko (prstenec),
— měřicí nádoba.
V.1.6.4.1.1 Pohyblivý stolek pro vzorek
Pohyblivý stolek pro vzorek slouží jako podložka pro termostatovanou měřicí nádobu, ve které je kapalina, která má být zkoušena. Spolu se systémem měření síly je upevněn na stojanu.
V.1.6.4.1.2 Systém měření síly
Systém měření síly je umístěn nad stolkem pro vzorek (viz obrázek). Chyba měření síly nemá překročit +/-10
-6
N, což odpovídá chybě +/-0,1 mg při měření hmotnosti. Ve většině případů je měřicí stupnice komerčních tenziometrů dělena v mN*m
-1
, takže je možné povrchové napětí odečítat přímo v mN*m
-1
s přesností na 0,1 mN*m
-1
.
V.1.6.4.1.3 Měřicí tělísko (prstenec)
Prstenec je obvykle zhotoven z platino-iridiového drátu o průměru asi 0,4 mm a středním obvodu 60 mm. Prstenec z drátu je zavěšen vodorovně na upevňovací vidlici z drátu a na kovové tyčince, která tvoří spojení k systému měření síly (viz obrázek).
                            Obrázek
                        Měřicí tělísko
         (všechny rozměry jsou uvedeny v milimetrech)
  


V.1.6.4.1.4 Měřicí nádoba
Měřicí nádobou pro zkušební roztok je termostatovaná skleněná nádoba. Má být konstruována tak, aby teplota zkoumané kapaliny i plynné fáze nad jejím povrchem zůstala během měření konstantní a aby se vzorek nemohl odpařovat. Vhodná je válcová skleněná nádoba o vnitřním průměru nejméně 45 mm.
V.1.6.4.2 Příprava aparatury
V.1.6.4.2.1 Čištění
Skleněné nádoby je třeba pečlivě vyčistit. Pokud je to nutné, měly by se vymýt horkou kyselinou chromsírovou a následně koncentrovanou kyselinou fosforečnou (83 až 98% hmot. H
3
PO
4
), pečlivě vypláchnout tekoucí vodou a nakonec omýt redestilovanou vodou do neutrální reakce a následně vysušit nebo vypláchnout vzorkem kapaliny, která má být měřena.
Prstenec je třeba nejprve pečlivě umýt vodou, aby se odstranily všechny látky rozpustné ve vodě. Poté se krátce ponoří do kyseliny chromsírové, opláchne se v redestilované vodě do neutrální reakce a nakonec se krátce ohřeje nad methanolovým plamenem.
Poznámka: Znečištění látkami, které se nerozpouštějí ani nerozkládají kyselinou chromsírovou ani kyselinou fosforečnou, jako například silikony, je nutné odstraňovat vhodnými organickými rozpouštědly.
V.1.6.4.2.2 Kalibrování aparatury
Validace aparatury spočívá v ověření nuly a v nastavení přístroje tak, aby jeho údaje umožňovaly spolehlivé stanovení v mN·m
-1
.
Poloha:
Přístroj musí být nastaven do vodorovné polohy, např. pomocí libely položené na základovou desku tenziometru a nastavením stavěcích šroubů základnové desky.
Nastavení nuly:
Po upevnění prstence na aparatuře a před ponořením do kapaliny je třeba nastavit nulu ukazatele tenziometru a zkontrolovat rovnoběžnost prstence s hladinou kapaliny. K tomu je možné použít hladiny kapaliny jako zrcadla.
Kalibrace:
Vlastní  kalibraci před měřením je možné provést  dvěma
       postupy:
       a)   Použitím  závaží:  při tomto  postupu  se  použijí
             jezdce o známé hmotnosti od 0,1 g do 1,0 g, které
             se  umístí  na prstenec. Kalibrační  faktor  fía,
             kterým  je třeba násobit všechny hodnoty odečtené
             na přístroji, je možné určit podle rovnice (1):

                    ró
r
a
= ---- ró
a
kde: mg ró
r
= ---- . (mN . m
-1
) 2b m = hmotnost jezdce (g), g = tíhové zrychlení (981 cm*s
-2
na úrovni hladiny moře), b = střední obvod prstence (cm), ró
a
= odečtená hodnota na tenziometru po umístění jezdců na prstenec (mN*m
-1
). b) Použitím vody: při tomto postupu se použije čistá voda, jejíž povrchové napětí má při 23 st.C hodnotu 72,3 mN*m
-1
. Tento postup lze provést rychleji než kalibraci se závažími, ale existuje vždy nebezpečí, že povrchové napětí vody je zkresleno stopovým znečištěním povrchově aktivními látkami. Kalibrační faktor fí
b
, kterým je třeba násobit všechny hodnoty odečtené na přístroji, je možné určit podle rovnice (2): ró
0
b
= --- ró
g
kde: ró
0
= hodnota povrchového napětí vody uvedená v literatuře (mN*m
-1
), ró
g
= naměřená hodnota povrchového napětí vody (mN*m
-1
), obě při stejné teplotě.
V.1.6.4.3 Příprava vzorků
Připraví se vodné roztoky zkušebních látek o požadované koncentraci, které nesmějí obsahovat nerozpuštěné složky.
Roztoky musí být udržovány při konstantní teplotě (+/-0,5 st.C). Protože se povrchové napětí roztoku v měřicí nádobě v čase mění, provedou se měření v různých časech a sestrojí se křivka závislosti povrchového napětí na čase. Nedochází­li k žádným dalším změnám, bylo dosaženo rovnovážného stavu.
Měření je ovlivňováno znečištěním prachem nebo plynnými látkami. Práce musí být tedy prováděny pod ochranným krytem.
V.1.6.5 Zkušební podmínky
Měření se provádí přibližně při +20 st.C a udržuje se tolerance +/-0,5 st.C.
V.1.6.6 Postup zkoušky
Roztoky, které mají být měřeny, se převedou do pečlivě vyčištěné měřicí nádoby, přičemž je třeba dbát na to, aby nedošlo k pěnění, a nádoba se poté postaví na stolek zkušební aparatury. Horní část stolku s měřicí nádobou se vysune tak vysoko, aby se prstenec ponořil pod povrch roztoku, který má být měřen. Horní část stolku se následně postupně a rovnoměrně sníží (rychlostí přibližně 0,5 cm·min
-1
), aby došlo k oddělení prstence od povrchu, a to až do dosažení maximální hodnoty síly. Film kapaliny lpící na prstenci se od něho nesmí odtrhnout. Po ukončení měření se prstenec opět ponoří pod povrch a postup se opakuje až do dosažení konstantní hodnoty povrchového napětí. Při každém stanovení se začne zaznamenávat čas v okamžiku plnění roztoku do měřicí nádoby. Odečty se provedou vždy v okamžiku, kdy je dosaženo maximální síly nutné pro oddělení prstence od povrchu kapaliny.
V.2 DATA
Za účelem výpočtu povrchového napětí se hodnota odečtená na přístroji v mN·m
-1
nejprve vynásobí kalibračním faktorem fía nebo fíb (podle použitého postupu kalibrace). Získá se tak hodnota, která však platí pouze přibližně, a vyžaduje proto korekci. Harkins a Jordan (4) empiricky stanovili korekční faktory pro hodnoty povrchového napětí měřeného prstencovou metodou, které závisí na rozměrech prstence, hustotě kapaliny a jejím povrchovém napětí. Vzhledem k tomu, že je zdlouhavé stanovovat pro každé jednotlivé měření korekční faktor z tabulek Harkinse a Jordana, lze pro výpočet povrchového napětí vodných roztoků použít zjednodušenou metodu, která spočívá v odečtu korigovaných hodnot povrchového napětí přímo z tabulky. (Pro odečtené hodnoty, které leží mezi hodnotami uvedenými v tabulce, se provede interpolace.)
     TABULKA: KOREKCE NAMĚŘENÝCH HODNOT POVRCHOVÉHO NAPĚTÍ

              Pouze pro vodné roztoky,  ró = 1 g*cm
-3
R = 9,55 mm (střední poloměr prstence) r = 0,185 (poloměr drátu prstence) ------------------------------------------------------------ Experimentální hodnota Korigovaná hodnota (mN*m
-1
) (mN*m
-1
) ----------------------------------- Kalibrace Kalibrace vodou závažími (viz 1.6.4.2.2 (viz 1.6.4.2.2 písm. b)) písm. a)) ------------------------------------------------------------ 20 16,9 18,1 22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 26 22,4 24,1 28 24,3 26,1 30 26,2 28,1 32 28,1 30,1 34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 42 37,6 40,3 44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 50 45,3 48,6 52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9 58 53,2 57 60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72 74 69,2 – 76 71,2 – 78 73,2 – ------------------------------------------------------------ Tabulka byla sestavena na základě korekcí podle Harkinse a Jordana. Je obdobou tabulky podle normy DIN 53914 pro vodu a vodné roztoky (hustota ró = 1 g*cm
-3
); platí pro běžný komerční prstenec o rozměrech R = 9,55 mm (střední poloměr prstence) a r = 0,185 mm (poloměr drátu prstence). Tabulka udává korigované hodnoty pro měření povrchového napětí získané po kalibraci závažími nebo vodou. Jiným řešením je vypočítat povrchové bez předchozí kalibrace podle rovnice: f x F ró = ------- 4 pí R kde F = síla udaná měřicím systémem při oddělení filmu R = poloměr prstence f = korekční faktor (1)
V.3 ZPRÁVY
V.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:
— použitá metoda,
— druh vody nebo použitého roztoku,
— přesná specifikace látky (identifikace a nečistoty),
— výsledky měření: povrchové napětí (odečtené hodnoty) s uvedením jednotlivých odečtených hodnot a jejich aritmetického průměru a rovněž korigované střední hodnoty (přičemž se bere v úvahu kalibrační faktor a tabulka korekcí),
— koncentrace roztoku,
— zkušební teplota,
— stáří použitého roztoku, zejména časový odstup mezi přípravou roztoku a měřením,
— znázornění časové závislosti povrchového napětí po převedení roztoku do měřicí nádoby,
— uvedou se všechny informace a poznámky, které jsou důležité pro interpretaci výsledků, zejména pokud jde o nečistoty a fyzikální stav látky.
V.3.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ
Vzhledem k tomu, že povrchové napětí vody je 72,75 mN·m
-1
při 20 st.C, měly by být látky vykazující za podmínek této metody povrchové napětí menší než 60 mN*m
-1
považovány za povrchově aktivní materiály.
V.4 LITERATURA
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final.
(2) R. Weissberger (ed.). Technique of Organic Chemistry, 3rd ed. Interscience Publ., New York, 1959, 1, Part I, Chapter XIV.
(3) Pure and Applied Chem., 48, 1976, 511.
(4) Harkins, W. D., Jordan, H. F., J. Amer. Chem. Soc., 52, 1930, 1751.
VI. METODY PRO STANOVENÍ ROZPUSTNOSTI VE VODĚ – METODY UVEDENÉ V BODU A.6 PŘÍLOHY SMĚRNICE 92/69/EHS
VI.1 METODA
Popsané metody jsou založeny na Pokynech OECD pro zkoušení (1).
VI.1.1 ÚVOD
Před provedením této zkoušky je vhodné mít k dispozici předběžné informace o strukturním vzorci látky, o tenzi par, disociační konstantě a o hydrolýze (jako funkci pH).
Neexistuje jediná dostupná metoda pro celý rozsah rozpustností ve vodě.
Dvě níže popsané metody pokrývají celý rozsah rozpustnosti, nejsou však použitelné pro těkavé látky:
— první metoda, použitelná pro v podstatě čisté látky s malou rozpustností (< 10
-2
g*l
-1
), stálé ve vodě; tato metoda se označuje jako „sloupcová eluční metoda“,
— druhá metoda, použitelná pro v podstatě čisté látky s vyšší rozpustností (> 10
-2
g*l
-1
), stálé ve vodě; tato metoda se označuje jako „baňková metoda“.
Rozpustnost zkušební látky ve vodě může být značně ovlivněna přítomností nečistot.
VI.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
Rozpustnost látky ve vodě je definována hmotnostní koncentrací jejího nasyceného roztoku ve vodě při dané teplotě. Rozpustnost ve vodě se udává v jednotkách hmotnosti na objem roztoku. Jednotkou v soustavě SI je kg·m
-3
(může se také používat g*l
-1
).
VI.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Při zkoušení nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provedení metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami.
VI.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍCH METOD
Přibližné množství vzorku a doba nutná pro dosažení hmotnostní koncentrace nasyceného roztoku by měly být stanoveny jednoduchou předběžnou zkouškou.
VI.1.4.1 Sloupcová eluční metoda
Tato metoda je založena na vymývání zkušební látky vodou z mikrokolony, naplněné inertním nosičem, např. skleněnými kuličkami nebo pískem, pokrytým přebytkem zkušební látky. Rozpustnost ve vodě se stanoví, jsou-li hmotnostní koncentrace eluátu konstantní. To se projeví jako plató závislosti koncentrace na čase.
VI.1.4.2 Baňková metoda
V této metodě se látka (tuhé látky musí být ve formě prášku) rozpustí ve vodě při teplotě, která je o něco vyšší než teplota měření. Po dosažení nasycení se roztok ochladí a udržuje se při teplotě měření, za stálého míchání, dokud se nedosáhne rovnováhy. Jinou možností je provést měření přímo při zkušební teplotě, pokud je vhodným vzorkováním prokázáno, že je dosaženo rovnovážného nasycení. Hmotnostní koncentrace látky ve vodném roztoku, který nesmí obsahovat žádné nerozpuštěné částice, se následně stanoví vhodnou analytickou metodou.
VI.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI
VI.1.5.1 Opakovatelnost
Při sloupcové eluční metodě je dosažitelná opakovatelnost < 30 %; při baňkové metodě by mělo být dosaženo opakovatelnosti < 15 %.
VI.1.5.2 Citlivost
Závisí na analytické metodě, lze však stanovit hmotnostní koncentrace až do 10
-6
g*l
-1
.
VI.1.6 POPIS METOD
VI.1.6.1 Zkušební podmínky
Zkouška se provádí pokud možno při teplotě 20 +/- 0,5 st.C. Předpokládá-li se závislost rozpustnosti ve vodě na teplotě (> 3 % na 1 st.C), měla by být provedena měření při dvou dalších teplotách, které jsou nejméně o 10 st.C vyšší a nižší než původně zvolená teplota. V tomto případě by měla být teplota udržována v toleranci +/-0,1 st.C. Zvolenou teplotu je třeba udržovat ve všech důležitých částech aparatury konstantní.
VI.1.6.2 Předběžná zkouška
K přibližně 0,1 g vzorku (tuhé látky musí být v práškové formě) v 10ml odměrném válci uzavíratelném skleněnou zátkou se přidává vzrůstající objem destilované vody o laboratorní teplotě podle kroků uvedených v následující tabulce:.
-------------------------------------------------------------------------------         ---------------
0,1   g   rozpuštěno   0,1        0,5           1         2         10      100        > 100
v „x“ ml vody
------------------------------------------------------------------------------- ---------------
Přibližná            > 1 000 1 000 až 200  200 až 100 100 až 50  50 až 10 10 až 1       < 1
rozpustnost (g*l 
-1
) ------------------------------------------------------------------------------- ---------------
Po každém přidání množství vody uvedeného v tabulce se směsí intenzivně třepe po dobu 10 min a vizuálně se kontroluje obsah nerozpuštěných částic. Zůstane­li vzorek nebo jeho část po přidání 10 ml vody nerozpuštěný, experiment je nutno opakovat ve 100 ml odměrném válci s větším objemem vody. Při nízkých rozpustnostech může být doba potřebná k rozpuštění látky podstatně delší (je vhodné vyčkat alespoň 24 h *). Přibližná rozpustnost je uvedena v tabulce pod objemem vody potřebným k úplnému rozpuštění vzorku. Není-li látka ani poté úplně rozpuštěna, je vhodné vyčkat delší dobu než 24 h (maximálně 96 h), nebo ředit dále, aby se zjistilo, zda by měla být použita sloupcová eluční metoda nebo baňková metoda.
---
* Pozn. překl. V německém originálu: „... až 24 hodin“.
VI.1.6.3 Sloupcová eluční metoda
VI.1.6.3.1 Nosič, rozpouštědlo a eluent
Nosič pro sloupcovou eluční metodu by měl být inertní. Vhodnými materiály, které lze použít, jsou skleněné kuličky a písek. K nanesení zkušební látky na nosič by mělo být použito vhodné těkavé analyticky čisté rozpouštědlo. Jako eluent by měla být použita voda redestilovaná ve skleněné nebo křemenné aparatuře.
Poznámka:
Nesmí se použít voda získaná přímo z organického měniče iontů.
VI.1.6.3.2 Nanášení na nosič
Odváží se přibližně 600 mg nosiče a převede se do 50ml baňky s kulatým dnem.
Přiměřené odvážené množství zkušební látky se rozpustí ve zvoleném rozpouštědle. Dostatečný podíl tohoto roztoku se přidá k nosiči. Rozpouštědlo musí být dokonale odpařeno, např. v rotační odparce, jinak se nedosáhne úplného nasycení nosiče vodou kvůli rozdělovacím efektům na povrchu nosiče.
Nanášení zkušební látky na nosič může být problematické (chybné výsledky), sráží-li se zkušební látka na nosiči jako olej nebo krystalická fáze. Problém by měl být řešen experimentálně a podrobnosti by měly být zaznamenány.
Nosič s nanesenou látkou se nechá 2 h botnat v asi 5 ml vody a suspense se poté naplní do mikrokolony. Je také možné naplnit mikrokolonu, která byla předtím naplněna vodou, suchým nosičem s nanesenou látkou a poté nechat během dvou hodin ustavit rovnováhu.
Zkušební postup:
Vymývání látky z nosiče lze provádět dvěma různými způsoby:
— oběhovým čerpadlem (viz obrázek 1),
— vyrovnávací nádobou (viz obrázek 4).
VI.1.6.3.3 Vymývání kolony použitím oběhového čerpadla
Aparatura
Schematické uspořádání typického systému je znázorněno na obrázku 1. Vhodná mikrokolona je znázorněna na obrázku 2, přijatelná je ovšem i kterákoli jiná velikost za předpokladu, že budou splněna kritéria opakovatelnosti a citlivosti. Prostor hlavy kolony by měl mít obsah nejméně pěti objemů sloupce a měl by být schopný pojmout nejméně pět vzorků. Prostor hlavy kolony může být menší, pokud se počátečních pět objemů sloupce eluovaných s nečistotami nahradí čistým rozpouštědlem.
Kolona by měla být připojena k oběhovému čerpadlu, které zajišťuje konstantní průtok asi 25 ml·h
-1
. Čerpadlo se připojí hadičkami z polytetrafluorethylenu (PTFE), a/nebo skleněnými trubičkami. U aparatury složené z kolony a čerpadla musí být možnost odběru eluátu a vyrovnávání tlaku v hlavě kolony s atmosférickým tlakem. Materiál v koloně se fixuje malým (5 mm) smotkem skelné vaty, který současně slouží k odfiltrování částeček. Lze použít např. peristaltické nebo membránové čerpadlo (přitom je třeba dbát na to, aby nedošlo ke znečištění materiálem hadičky a/nebo aby nedošlo k absorpci tímto materiálem).
Postup měření
Zahájí se vymývání kolony. Doporučuje se průtok asi 25 ml·h
-1
(to odpovídá u popsané kolony desetinásobku objemu sloupce za hodinu). Nejméně prvních pět objemů sloupce obsahujících nečistoty rozpustné ve vodě se odstraní. Poté se nechá běžet oběhové čerpadlo až do ustavení rovnováhy, které je dosaženo, neliší-li se koncentrace pěti po sobě následujících vzorků při náhodném výběru o více než +/-30 %, přičemž rozdíly jsou nepravidelné. Tyto vzorky by se měly odebírat v intervalech, během kterých kolonou projde objem eluentu rovný nejméně desetinásobku objemu sloupce.
VI.1.6.3.4 Vymývání kolony pomocí vyrovnávací nádoby
Aparatura (viz obrázek 3 a 4)
Vyrovnávací nádoba: je připojena zabroušeným spojem, který je spojen hadičkou z PTFE. Doporučuje se použít rychlost průtoku přibližně 25 ml·h
-1
. Podíly eluátu následující po sobě se shromažďují a jejich koncentrace se analyzují zvolenou metodou.
Postup měření:
Pro stanovení rozpustnosti ve vodě se použijí prostřední podíly eluátu, ve kterých zůstávají koncentrace nejméně v pěti po sobě jdoucích vzorcích konstantní (+/-30 %).
V obou případech (při použití oběhového čerpadla nebo vyrovnávací nádoby) se druhé promytí provede při poloviční průtokové rychlosti. Shodují­li se výsledky obou pokusů, považuje se výsledek za uspokojivý; je­li zdánlivá rozpustnost při nižší průtokové rychlosti vyšší, je nutné průtok snižovat vždy na polovinu tak dlouho, dokud dva po sobě následující měření neposkytnou stejnou hodnotu rozpustnosti.
V obou případech (v případě oběhového čerpadla nebo vyrovnávací nádoby) je nutné vzorky podrobit zkoušce na koloidní částice pomocí Tyndallova jevu (rozptylem světla). Přítomností takových částic je výsledek znehodnocen a zkouška by měla být opakována po zlepšení filtrační funkce kolony.
Mělo by být zaznamenáno pH každého vzorku. Druhé měření je třeba provést při stejné teplotě.
VI.1.6.4 Baňková metoda
VI.1.6.4.1 Zařízení
Tato metoda vyžaduje následující vybavení:
— běžné laboratorní skleněné nádoby a pomůcky,
— zařízení pro třepání roztoků při regulovaných konstantních teplotách,
— odstředivka (nejlépe termostatovaná), je­li nezbytná v případě emulzí, a
— přístroje pro analytická stanovení.
VI.1.6.4.2 Postup měření
Množství materiálu potřebné pro nasycení požadovaného objemu vody se odhadne z předběžného pokusu. Potřebný objem vody závisí na analytické metodě a na rozsahu rozpustnosti. Do tří skleněných nádobek opatřených skleněnými zátkami (např. centrifugačních kyvet, baněk) se naváží asi pětinásobek odhadnutého množství materiálu. Do každé z nádobek se přidá zvolené množství vody a nádobky se těsně uzavřou. Uzavřené nádobky se poté třepou při 30 st.C. (K tomuto účelu by měla být použita třepačka nebo míchačka pracující při konstantní teplotě, např. magnetické míchání v termostatované vodní lázni.) Po jednom dnu se jedna z nádobek vyjme a nechá se za občasného míchání 24 h stát, aby se ustálila rovnováha při teplotě měření. Poté se obsah nádobky odstředí při teplotě měření a v čiré vodné fázi se vhodnou analytickou metodou stanoví koncentrace zkušební látky. Po dvou, resp. třech dnech se zbylé dvě nádobky po předchozím ustavení rovnováhy nasycení při 30 st.C zpracují podobným způsobem. Odpovídají-li hodnoty koncentrace alespoň u posledních dvou nádobek požadované reprodukovatelnosti, je stanovení uspokojivé. Pokud hodnoty koncentrací pro nádobky 1, 2 a 3 vykazují stoupající tendenci, mělo by být celé stanovení opakováno s prodloužením doby pro ustavení rovnováhy.
Měření může být provedeno i bez předběžné inkubace při 30 st.C. S cílem zjistit rychlost ustavení saturační rovnováhy se odebírají vzorky do té doby, dokud doba míchání ovlivňuje koncentraci měřeného roztoku.
Mělo by být zaznamenáno pH každého vzorku.
VI.1.6.5 Analýza
Pro tato stanovení se upřednostňuje analytická metoda specifická pro danou látku, protože malá množství rozpuštěných nečistot mohou způsobit velké chyby při stanovení rozpustnosti ve vodě. Příklady těchto analytických metod jsou plynová nebo kapalinová chromatografie, titrační metody, fotometrické metody, voltametrické metody.
VI.2 DATA
VI.2.1 SLOUPCOVÁ ELUČNÍ METODA
Pro každý pokus by měla být vypočtena střední hodnota z nejméně pěti po sobě následujících vzorků vybraných z oblasti po dosažení rovnovážného nasycení a rovněž by měla být vypočtena směrodatná odchylka. Výsledky by měly být uvedeny v jednotkách hmotnosti na jednotku objemu roztoku.
Porovnají se střední hodnoty dvou zkoušek provedených za různých rychlostí průtoku a jejich opakovatelnost by měla být menší než 30 %.
VI.2.2 BAŇKOVÁ METODA
Výsledky pro každou ze tří baněk se uvedou samostatně a jsou­li ustálené (opakovatelnost je lepší než 15 %), zprůměrují se a vyjádří se v jednotkách hmotnosti na jednotku objemu roztoku. Je­li rozpustnost velmi vysoká (> 100 g·l
-1
), může to vyžadovat přepočet hmotnostních jednotek na objemové jednotky s využitím hustoty roztoku.
VI.3 ZPRÁVY
VI.3.1 SLOUPCOVÁ ELUČNÍ METODA
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující zdaje:
— výsledky předběžné zkoušky,
— přesná specifikace látky (identita a nečistoty),
— jednotlivé koncentrace, hodnoty rychlosti průtoku a pH pro každý vzorek,
— střední hodnoty a směrodatné odchylky nejméně pro pět vzorků z rovnovážné oblasti křivky nasycení z každého pokusu,
— průměrná hodnota dvou po sobě následujících přijatelných měření,
— teplota vody během procesu tvorby nasyceného roztoku,
— použitá analytická metoda,
— druh použitého materiálu nosiče,
— způsob nanesení studované látky na nosič,
— použité rozpouštědlo,
— poznatky o jakékoli chemické nestálosti látky během zkoušky a při použité analytické metodě,
— všechny informace, které mají význam pro interpretaci výsledků, zvláště s ohledem na nečistoty a fyzikální stav látky.
VI.3.2 BAŇKOVÁ METODA
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:
— výsledky předběžné zkoušky,
— přesná specifikace látky (identita a nečistoty),
— výsledky jednotlivých analytických stanovení a průměrné hodnoty, pokud byla pro každou nádobku stanovena více než jedna hodnota,
— hodnota pH každého vzorku,
— průměrná hodnota pro dvě různé nádobky, jejichž výsledky jsou ve shodě,
— teplota při zkoušce,
— použitá analytická metoda,
— poznatky o jakékoli chemické nestabilitě látky během zkoušky a při použité analytické metodě,
— všechny informace, které mají význam pro interpretaci výsledků, zvláště s ohledem na nečistoty a fyzikální stav látky.
VI.4 LITERATURA
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final
(2) NF T 20­045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility – Column elution method
(3) NF T 20-046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility – Flask method
DODATEK
                           Obrázek 1
         Sloupcová eluční metoda s oběhovým čerpadlem




Obrázek 2 Typická mikrokolona (všechny rozměry v mm)


Obrázek 3 Typická mikrokolona (všechny rozměry v mm)


Obrázek 4 Sloupcová eluční metoda s vyrovnávací nádobou


1 = Vyrovnávací nádoba (např. baňka o obsahu 2,5 l) 2 = Kolona (viz obrázek 3) 3 = Sběrač frakcí 4 = Termostat 5 = Teflonová hadička 6 = Skleněný zabroušený spoj 7 = Hadice na vodu (mezi termostatem a kolonou, vnitřní průměr asi 8 mm)
VII. METODY PRO STANOVENÍ ROZDĚLOVACÍHO KOEFICIENTU – METODY UVEDENÉ V BODU A.8 PŘÍLOHY SMĚRNICE 92/69/EHS
VII.1. METODA
Popsaná metoda „třepací lahve“ je založena na Pokynech OECD pro zkoušení (1).
VII.1.1 ÚVOD
Před provedením této zkoušky je vhodné mít k dispozici předběžné informace o strukturním vzorci látky, disociační konstantě, rozpustnosti ve vodě, hydrolýze, rozpustnosti v n­oktanolu (oktan­1­olu) a o povrchovém napětí.
U disociujících látek by měla být měření prováděna pouze s nedisociovanou formou (volná kyselina nebo volná báze), získanou při použití vhodného pufru o pH nejméně o 1 nižším (volná kyselina) nebo vyšším (volná báze) než pK.
Tato zkušební metoda zahrnuje dva samostatné postupy: metodu třepací lahve a vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (HPLC). První metodu lze použít, leží­li hodnota log P
o/v
(definice viz níže) v rozmezí -2 až 4, a druhou metodu, leží-li hodnota log P
o/v
v rozmezí 0 až 6. Před provedením kteréhokoli z experimentálních postupů by měl být nejdříve získán předběžný odhad rozdělovacího koeficientu.
Metoda třepací lahve je použitelná pouze pro v podstatě čisté látky, které jsou rozpustné ve vodě a n­oktanolu.
Nelze ji použít pro povrchově aktivní látky (pro které by měly být uvedeny hodnota získaná výpočtem nebo odhad založený na příslušných rozpustnostech v n­oktanolu a vodě).
Metoda HPLC není použitelná pro silné kyseliny a zásady, komplexní sloučeniny kovů, povrchově aktivní látky a látky, které reagují s eluentem. Pro tyto látky by měly být uvedeny hodnota získaná výpočtem nebo odhad založený na individuálních rozpustnostech v n-oktanolu a vodě.
Metoda HPLC je méně citlivá na přítomnost nečistot ve zkušební látce než metoda třepací lahve. Někdy však mohou nečistoty ztížit interpretaci výsledků, protože přiřazení píků se stává nejistým. U směsí, které dávají nerozlišitelný pás, by měly být uvedeny spodní a horní mez hodnoty log P.
VII.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
Rozdělovací koeficient (P) je definován jako poměr rovnovážných koncentrací (ci) rozpuštěné látky ve dvoufázovém systému tvořeném dvěma prakticky nemísitelnými rozpouštědly. V případě n-oktanolu a vody platí:
              c
oktan-1-ol
P
o/v
= ------------ c
voda
Rozdělovací koeficient (P) je tedy podílem dvou koncentrací a udává se obvykle ve formě svého dekadického logaritmu (log P).
VII.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Metoda třepací lahve
Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provádění metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami.
Metoda HPLC
Za účelem korelace hodnot naměřených pro danou sloučeninu metodou HPLC s její hodnotou P je nutné sestrojit kalibrační graf závislosti log P na chromatografických datech tvořený nejméně šesti referenčními body. Vhodné referenční látky zvolí uživatel. Pokud je to možné, měla by mít alespoň jedna referenční látka P
o/v
vyšší než zkušební látka a jiná referenční látka P
o/v
nižší než zkušební látka. U hodnot log P nižších než 4 může být kalibrace založena na údajích získaných metodou třepací lahve. U hodnot log P vyšších než 4 může být kalibrace založena na ověřených hodnotách z literatury, pokud jsou v souladu s vypočtenými hodnotami. Za účelem dosažení vyšší přesnosti je vhodnější volit látky, které mají podobnou strukturu jako zkušební látka.
Rozsáhlé seznamy hodnot P
o/v
pro mnoho skupin chemických látek jsou dostupné v literatuře (2, 3). Nejsou-li k dispozici údaje o rozdělovacích koeficientech látek s podobnou strukturou, lze použít obecnější kalibraci s jinými referenčními látkami.
Seznam doporučených referenčních látek a jejich hodnot P
o/v
je uveden v doplňku 2.
VII.1.4 PODSTATA METOD
VII.1.4.1 Metoda třepací lahve
Pro stanovení rozdělovacího koeficientu musí být dosaženo rovnováhy mezi všemi vzájemně působícími složkami systému a musí být stanoveny koncentrace látek rozpuštěných v obou fázích. Ze studia literatury vztahující se k této otázce vyplývá, že k řešení tohoto problému lze použít několik různých postupů, např. důkladné promíchání obou fází a jejich následné oddělení za účelem stanovení rovnovážných koncentraci vyšetřované látky.
VII.1.4.2 Metoda HPLC
HPLC se provádí na analytických kolonách plněných komerčně dostupnou pevnou fází obsahující dlouhé uhlovodíkové řetězce (např. C
8
, C
18
) chemicky vázané na oxid křemičitý. Chemické látky nastříknuté do této kolony se v ní pohybují různou rychlostí v důsledku různých stupňů rozdělení mezi mobilní fázi a uhlovodíkovou stacionární fázi. Směsi chemikálií se eluují v pořadí své hydrofobnosti, přičemž se látky rozpustné ve vodě eluují jako první a látky rozpustné v olejích jako poslední, úměrně svému rozdělovacímu koeficientu uhlovodíky­voda. To umožňuje určit vztah mezi retenčním časem v této koloně (s reversními fázemi) a rozdělovacím koeficientem n­oktan/voda. Rozdělovací koeficient se odvodí z kapacitního faktoru k, daného výrazem:
                               
                      t
R
- t
o
k = ----------- t
o
v němž t
R
= retenční čas zkušební látky, to = průměrná doba, kterou molekula rozpouštědla potřebuje k průchodu kolonou (mrtvá doba).
Kvantitativní analytické metody nejsou zapotřebí, nezbytné je pouze stanovení elučních dob.
VII.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI
VII.1.5.1 Opakovatelnost
Metoda třepací lahve
S cílem zaručit správnost hodnoty rozdělovacího koeficientu se provedou opakovaná stanovení při třech různých zkušebních podmínkách, přičemž lze měnit jak množství dané látky, tak poměr objemů obou rozpouštědel. Dekadické logaritmy stanovených hodnot rozdělovacího koeficientu by měly ležet v rozmezí +/-0,3.
Metoda HPLC
S cílem zvýšit důvěryhodnost měření musí být provedena opakovaná stanovení. Hodnoty log P získané z jednotlivých měření by měly ležet v rozmezí +/-0,1.
VII.1.5.2 Citlivost
Metoda třepací lahve
Měřicí rozsah metody je určen mezí detekce analytické metody. Ta by měla umožnit stanovení hodnot log P
o/v
v oblasti od -2 do 4 (pokud to podmínky dovolí, lze tuto oblast rozšířit až do hodnoty log P
o/v
rovné 5), není-li koncentrace rozpuštěné látky v žádné z fází vyšší než 0,01 mol*l
-1
.
Metoda HPLC
Metoda HPLC umožňuje stanovení rozdělovacích koeficientů v rozsahu log P
o/v
od 0 do 6.
Obvykle je možné určit rozdělovací koeficient dané látky s přesností +/-1 řádu vzhledem k hodnotě získané metodou třepací lahve. Typické korelace lze nalézt v literatuře (4, 5, 6, 7, 8). Vyšší přesnosti lze obvykle dosáhnout, je­li korelační závislost založena na referenčních látkách podobné struktury (9).
VII.1.5.3 Specifičnost
Metoda třepací lahve
Nernstův rozdělovací zákon platí pro zředěné roztoky jen při konstantní teplotě a konstantním tlaku a pH. Platí pouze pro čistou látku rozdělenou mezi dvě čistá rozpouštědla. Je­li současně v jedné nebo obou fázích přítomno více rozpuštěných látek, může tím být výsledek ovlivněn.
Disociace nebo asociace rozpuštěných molekul vede k odchylkám od Nernstova rozdělovacího zákona. Tyto odchylky se projevují tím, že se rozdělovací koeficient stává závislým na koncentraci roztoku.
V důsledku existujících mnohonásobných rozdělovacích rovnováh by tato metoda neměla být použita bez korekcí na disociovatelné sloučeniny. Pro tyto sloučeniny by mělo být zváženo použití pufračních roztoků namísto vody; pH pufračního roztoku by se mělo lišit od pKa látky nejméně o 1, přičemž se zohlední význam tohoto pH s ohledem na životní prostředí.
VII.1.6 POPIS METODY
VII.1.6.1 Předběžný odhad rozdělovacího koeficientu
Hodnotu rozdělovacího koeficientu lze nejlépe odhadnout na základě výpočtu (viz doplněk 1) nebo popřípadě z poměru rozpustností zkušební látky v čistých rozpouštědlech (10).
VII.1.6.2 Metoda třepací lahve
VII.1.6.2.1 Příprava
n-Oktanol: Stanovení rozdělovacího koeficientu by mělo být provedeno s n-oktanolem (oktan­1­olem) čistoty p.a. Voda: měla by být použita destilovaná voda nebo redestilovaná voda ve skleněné nebo křemenné aparatuře. V případě potřeby by měly být u disociovatelných látek použity místo vody pufrační roztoky.
Poznámka:
Neměla by být použita voda pocházející přímo z měniče iontů.
VII.1.6.2.1.1 Předběžné nasycení rozpouštědel
Před stanovením rozdělovacího koeficientu se fáze rozpouštědlového systému vzájemně nasytí třepáním při teplotě experimentu. K dosažení tohoto cíle je vhodné 24 h třepat na mechanické třepačce ve dvou velkých zásobních lahvích vysoce čistý n-oktanol nebo vysoce čistou vodu, obojí s dostatečným množstvím druhého rozpouštědla, a poté nechat rozpouštědla stát tak dlouho, dokud se obě fáze neoddělí a dokud není dosaženo nasycení.
VII.1.6.2.1.2 Příprava zkoušky
Celkový objem dvoufázového systému by měl téměř naplňovat zkušební nádobu. Tím se zamezí ztrátám látek v důsledku odpařování. Poměry objemů a množství látek, které mají být použity, jsou dány
— předběžným odhadem rozdělovacího koeficientu (viz výše),
— minimálním množstvím zkušební látky nezbytným pro postup analýzy, a
— omezením maximální koncentrace v každé fázi na 0,01 mol*l
-1
.
Provedou se tři zkoušky. Při první se použije vypočtený poměr objemů n­oktanolu a vody; při druhé se tento poměr dělí dvěma a při třetí se tento poměr násobí dvěma (např. 1 : 1, 1 : 2, 2 : 1).
VII.1.6.2.1.3 Zkušební látka
Připraví se zásobní roztok v n-oktanolu předem nasyceném vodou. Koncentrace tohoto zásobního roztoku by měla být před jeho použitím ke stanovení rozdělovacího koeficientu přesně stanovena. Tento roztok by měl být uchováván za podmínek, které zajistí jeho stálost.
VII.1.6.2.2 Zkušební podmínky
Zkušební teplota by měla být konstantní (+/-1 st.C) a měla by ležet v rozmezí 20 a 25 st.C
.
VII.1.6.2.3 Postup měření
VII.1.6.2.3.1 Ustavení rovnováhy rozdělení
Pro každou ze zkušebních podmínek by měly být připraveny dvě zkušební nádoby obsahující potřebná přesně odměřená množství obou rozpouštědel spolu s nezbytným množstvím zásobního roztoku.
Fáze n-oktanolu je nutné odměřit objemově. Zkušební nádoby by měly být umístěny do vhodné třepačky, nebo by měly být třepány ručně. Při použití centrifugační kyvety spočívá doporučený postup v tom, že se kyveta rychle otáčí kolem své příčné osy o 180°, takže případný zachycený vzduch stoupá vzhůru oběma fázemi. Ze zkušenosti vyplývá, že k ustavení rovnovážného rozdělení obvykle stačí 50 takových otočení. Pro jistotu se doporučuje 100 otočení během pěti minut.
VII.1.6.2.3.2 Oddělení fází
V případě potřeby lze oddělení fází provést odstředěním směsi. Odstředění by mělo být provedeno laboratorní odstředivkou udržovanou při laboratorní teplotě, nebo, je­li použita odstředivka bez regulace teploty, by měly být centrifugační kyvety za účelem ustavení rovnováhy udržovány alespoň jednu hodinu před analýzou při zkušební teplotě.
VII.1.6.2.4 Analýza
Za účelem stanovení rozdělovacího koeficientu je nutné stanovit koncentrace zkušební látky v obou fázích. To lze provést odebráním alikvotního podílu každé z obou fází z každé kyvety a pro každou zkušební podmínku a jejich analýzou zvoleným postupem. Celkové množství látky přítomné v obou fázích by mělo být vypočteno a porovnáno s původně dodaným množstvím látky.
Odběr vzorku z vodné fáze je nutné provést postupem minimalizujícím riziko znečištění stopami n-oktanolu: k odběru vzorků vodné fáze lze použít skleněnou injekční stříkačku s vyměnitelnou jehlou. Stříkačka se nejprve částečně naplní vzduchem. Vzduch se při průchodu jehly vrstvou n-oktanolu opatrně vypudí. Do stříkačky se natáhne dostatečný objem vodné fáze.
Stříkačka se z roztoku rychle vytáhne a jehla se sejme. Obsah stříkačky lze poté použít jako vzorek vodné fáze. Koncentrace v obou od sebe oddělených fázích by měla být stanovena nejlépe metodou, která je specifická pro danou látku. Příklady možných vhodných analytických metod jsou
— fotometrické metody,
— plynová chromatografie,
— vysokoúčinná kapalinová chromatografie.
VII.1.6.3 Metoda HPLC
VII.1.6.3.1 Příprava
Aparatura
Nezbytným vybavením je kapalinový chromatograf vybavený bezpulzním čerpadlem a vhodným detekčním zařízením. Doporučuje se používat nástřikový ventil se vstřikovacími smyčkami. Přítomnost polárních skupin ve stacionární fázi může závažně zhoršit účinnost kolony HPLC. Stacionární fáze by proto měla mít minimální podíl polárních skupin (11). Lze použít komerční mikročásticové náplně s reversními fázemi nebo hotové kolony s náplní. Mezi nástřikem a analytickou kolonou může být umístěna ochranná předkolona.
Mobilní fáze
K přípravě elučního rozpouštědla se použije methanol čistoty pro HPLC a voda čistoty pro HPLC, které se před použitím odplyní. Měla by být provedena isokratická eluce. Doporučuje se použít směsi methanol/voda s minimálním obsahem vody 25 %. Obvykle vyhovuje pro eluci sloučenin o log P = 6 během jedné hodiny při průtokové rychlosti 1 ml·min
-1
směs methanol / voda 3 : 1 (obj.). U sloučenin s vysokou hodnotou log P může být nutné zkrátit eluční dobu (stejně tak u referenčních látek) snížením polarity mobilní fáze nebo délky kolony.
Látky s velmi nízkou rozpustností v n­oktanolu mají tendenci při použití metody HPLC vykazovat abnormálně nízké hodnoty log P
o/v
; píky těchto sloučenin někdy doprovázejí čelo rozpouštědla. Je to pravděpodobně způsobeno tím, že proces rozdělení je příliš pomalý, než aby bylo dosaženo rovnováhy za dobu, po kterou obvykle trvá dělení metodou HPLC. Pro dosažení spolehlivé hodnoty může být v takovém případě účinné snížení průtokové rychlosti nebo snížení poměru methanol/voda.
Zkušební i referenční látka by měly být rozpustné v mobilní fázi v dostatečných koncentracích umožňujících jejich detekci. Pouze ve výjimečných případech mohou být u směsi methanol/voda použita aditiva, neboť aditiva mění vlastnosti kolony. V případě chromatogramů získaných při použití aditiv, musí být použita samostatná kolona téhož typu. Nevyhovuje-li směs methanol­voda, lze použít směsi jiných organických rozpouštědel s vodou, např. ethanol­voda nebo acetonitril­voda.
Pro disociovatelné látky je kritické pH eluentu. Mělo by ležet v pracovní oblasti pH kolony, která je obvykle 2 až 8. Doporučuje se použití pufračních roztoků. Je nezbytné dbát na to, aby nedošlo ke srážení solí a narušení kolony, ke kterému dochází u některých směsí organické fáze s pufračním roztokem. Měření pomocí HPLC se stacionárními fázemi na bázi oxidu křemičitého při pH vyšším než 8 se nedoporučuje, neboť použití alkalické mobilní fáze může způsobit rychlé narušení činnosti kolony.
Rozpouštěné látky
Referenční látky by měly mít nejvyšší dostupnou čistotu. Sloučeniny, které se mají používat pro zkoušení nebo kalibraci, se pokud možno rozpustí v mobilní fázi.
Zkušební podmínky
Teplota by během měření neměla kolísat o více než +/-2 K.
VII.1.6.3.2 Měření
Výpočet mrtvé doby t
0
Mrtvou dobu t
0
je možné stanovit buď pomocí homologické řady (např. n­alkylmethylketonů) nebo nezadržovaných organických sloučenin (např. thiomočoviny nebo formamidu). Pro výpočet mrtvé doby t
0
s použitím homologické řady se nastříkne sada alespoň sedmi členů homologické řady a stanoví se příslušné retenční časy. Neupravené retenční časy t
r(nc+1)
se vynesou jako funkce a stanoví se absolutní člen a a směrnice b regresní rovnice:
       
       t
r(nc + 1)
= a +bt
r(nc)
(nc = počet atomů uhlíku). Mrtvá doba t0 je dána vztahem:
        
        t
0
= a/(1-b)
Kalibrační křivka
Následujícím krokem je sestrojení korelační závislosti
hodnot log k na log P pro příslušné referenční látky. V praxi se současně nastříkne soubor 5 až 10 standardních referenčních látek, jejichž log P leží v očekávané oblasti, a stanoví se retenční časy, nejlépe zapisovacím integrátorem napojeným na detekční systém. Vypočtou se příslušné logaritmy kapacitních faktorů, log k, a vynesou se jako funkce hodnot log P stanovených metodou třepací lahve. Kalibrace se provádí v pravidelných intervalech nejméně jednou denně, aby bylo možné zohlednit případné změny činnosti kolony.
Stanovení kapacitního faktoru zkušební látky
Zkušební látka se nastříkne v co nejmenším množství mobilní fáze. Stanoví se retenční čas (dvakrát), umožňující výpočet kapacitního faktoru k. Z korelační křivky referenčních látek je možné interpolací získat rozdělovací koeficient zkušební látky. U velmi nízkých a velmi vysokých rozdělovacích koeficientů je nutná extrapolace. V těchto případech je nutno věnovat zvláštní pozornost intervalům spolehlivosti regresní křivky.
VII.2 DATA
Metoda třepací lahve
Spolehlivost stanovených hodnot P je možné prověřit srovnáním středních hodnot z opakovaných stanovení s celkovou střední hodnotou.
VII.3 ZPRÁVY
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:
— přesnou specifikaci látky (identitu a nečistoty),
— nejsou-li metody použitelné (např. u povrchově aktivní látky), měla by být uvedena vypočtená hodnota nebo odhad založený na individuálních rozpustnostech látky v n­oktanolu a vodě,
— všechny informace a poznámky, které mají význam pro interpretaci výsledků, zvláště s ohledem na nečistoty a fyzikální stav látky.
Pro metodu třepací lahve:
— výsledek předběžného odhadu, pokud existuje,
— teplotu stanovení,
— údaje o analytických postupech použitých ke stanovení koncentrací,
— dobu a rychlost odstřeďování, pokud se použilo,
— koncentrace naměřené při každém stanovení v obou fázích (tzn. uvede se celkem 12 koncentrací),
— hmotnost zkušební látky, objem každé fáze použité v každé zkušební nádobě a vypočtené celkové množství zkušební látky, obsažené v jednotlivých fázích po dosažení rovnováhy,
— vypočtené hodnoty rozdělovacího koeficientu (P) a střední hodnotu je nutné uvést pro každý soubor zkušebních podmínek, stejně tak střední hodnotu ze všech stanovení. Pokud existují náznaky závislosti rozdělovacího koeficientu na koncentraci, mělo by to být uvedeno ve zprávě,
— měla by být uvedena směrodatná odchylka jednotlivých hodnot P od střední hodnoty,
— měl by být také uveden dekadický logaritmus střední hodnoty P ze všech stanovení,
— vypočtená teoretická hodnota P
o/v
, byla-li stanovena nebo je­li naměřená hodnota > 10
4
,
— pH použité vody a vodné fáze během experimentu,
— pokud byly použity pufry, zdůvodnění jejich použití místo vody, jejich složení, koncentrace a pH, pH vodné fáze před a po experimentu.
Pro metodu HPLC:
— výsledek předběžného odhadu, pokud existuje,
— zkušební látka a referenční látky, jejich čistota,
— teplotní rozmezí při stanoveních,
— pH, při kterém se prováděla stanovení,
— podrobnosti o analytické a ochranné koloně, o mobilní fázi a o způsobu detekce,
— retenční data a hodnoty log P z literatury pro referenční látky použité ke kalibraci,
— podrobnosti o proložené regresní přímce (log k versus log P),
— průměrná retenční data a interpolovaná hodnota log P pro zkušební sloučeninu,
— popis zařízení a pracovních podmínek,
— eluční křivky,
— množství zkušební látky a referenčních látek zavedených do kolony,
— mrtvý čas a způsob jeho měření.
VII.4 LITERATURA
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107. Decision of the Council C(81) 30 final.
(2) C. Hansch, A. J. Leo. Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Wiley, New York, 1979.
(3) Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A. J. Leo, dir.): Dostupné: Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.
(4) L. Renberg, G. Sundström, K. Sundh­Nygärd. Chemosphere, 1980, 80, 683.
(5) H. Ellgehausen, C. D' Hondt, R. Fuerer. Pestic. Sci., 1981, 12, 219 (1981).
(6) B. McDuffie. Chemosphere, 1981, vol 10, 73.
(7) W. E. Hammers et al., J. Chromatogr. 1982, 247, 1.
(8) J. E. Haky, A. M. Young. J. Liq. Chromat., 1984, 7. 675.
(9) S. Fujisawa, E. Masuhara. J. Biomed. Mat. Res., 1981, 15, 787.
(10) O. Jubermann. Verteilen und Extrahieren. V: Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumspraxis (ed. E. Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, 223-339.
(11) R. F. Rekker, H. M. de Kort. Euro. J. Med. Chem. 1979, vol 14, 479.
(12) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins. Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, 71, 525.
(13) R. F. Rekker. The Hydrophobic Fragmental Constant. Elsevier, Amsterdam, 1977.
(14) NF T 20­043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial use – Determination of partition coefficient – Flask shaking method.
(15) C. V. Eadsforth, P. Moser. Chemosphere, 1983, 12, 1459.
(16) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins. Chem. Rev., 1971, 71, 525.
(17) C. Hansch, A. Leo, S. H. Unger, K. H. Kim, D. Nikaitani, E. J. Lien, J. Med Chem. 1973, 16, 1207.
(18) W. B. Neely, D. R. Branson, G. E. Blau. Environ. Sci. Technol. 1974, 8, 1113.
(19) D. S. Brown, E. W. Flagg. J. Environ. Qual. 1981, 10, 382.
(20) J. K. Seydel, K. J. Schaper. Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen. Verlag Chemie, Weinheim, New York 1979.
(21) R. Franke. Theoretical Drug Design Methods. Elsevier, Amsterdam 1984.
(22) Y. C. Martin. Quantitative Drug Design. Marcel Dekker, New York, Basel 1978.
(23) N. S. Nirrlees, S. J. Noulton, C. T. Murphy, P. J. Taylor. J. Med. Chem. 1976, 19, 615.
DODATEK 1
Metody výpočtu nebo odhadu
ÚVOD
Obecný úvod do výpočtových metod, data a příklady jsou uvedeny v příručce Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a).
Vypočtené hodnoty P
o/v
lze použít
— k rozhodnutí, která z experimentálních metod je vhodná (rozsah u třepací lahve: log P
o/v
:
-2
až 4, rozsah u HPLC: log P
o/v
: 0 až 6),
— k volbě vhodných zkušebních podmínek (např. referenčních látek pro postupy HPLC, poměr objemů n­oktanol/voda pro metodu třepací lahve),
— jako vnitřní laboratorní kontrolu možných experimentálních chyb,
— k získání odhadu P
o/v
v případech, kdy zkušební metody nelze z technických důvodů použít.
METODA ODHADU Předběžný odhad rozdělovacího koeficientu Hodnotu rozdělovacího koeficientu je možné odhadnout s použitím rozpustnosti zkušební látky v čistých rozpouštědlech:
Pro tento případ platí:

                  nasycení c
oktan-1-ol
P
odhad
= ----------------------- nasycení c
voda
VÝPOČTOVÉ METODY
Podstata výpočtových metod
Všechny výpočtové metody jsou založeny na formálním dělení molekul do vhodných podstruktur, pro něž jsou známy spolehlivé hodnoty přírůstků log P
o/v
. Hodnota log P
o/v
celé molekuly se poté vypočte jako součet hodnot pro příslušné fragmenty plus součet korekčních členů pro intramolekulární interakce. Existují seznamy konstant fragmentů a korekčních členů (b, c, d, e). Některé se pravidelně aktualizují (b).
Kritéria jakosti
Spolehlivost výpočtové metody obecně klesá s rostoucí složitostí zkoumané sloučeniny. V případě jednoduchých molekul s nízkou molekulovou hmotností a jednou nebo dvěma funkčními skupinami lze očekávat, že odchylky hodnot log P
o/v
získaných různými fragmentačními metodami od naměřené hodnoty budou v rozmezí od 0,1 do 0,3. U složitějších molekul může být rozpětí chyby větší. Závisí to na spolehlivosti a dostupnosti konstant pro fragmenty a rovněž na schopnosti zjistit intramolekulární interakce (např. vodíkové vazby) a na správném používání korekčních členů (což není obtížné při použití počítačového programu CLOGP­3) (b). V případě disociujících látek je důležité správně zohlednit náboj nebo stupeň disociace.
Postupy výpočtu
Hanschova pí­metoda
Původní konstanta hydrofobnosti substituentu pí zavedená Fujitou et al. (f) je definována jako
x
= log P
o/v
(PhX) - log P
o/v
(PhH)
kde P
o/v
(PhX) je rozdělovací koeficient aromatického derivátu a P
o/v
(PhH) rozdělovací koeficient výchozí sloučeniny (např. pí Cl = log P
o/v
(C
6
H
5
Cl) - log P
o/v
(C
6
H
6
) = 2,84 - 2,13 = 0,71).
Ze své definice je pí­metoda použitelná především u aromatických substituentů. Hodnoty pí byly pro velký počet substituentů uspořádány do tabulek (b, c, d). Používají se k výpočtu log P
o/v
aromatických molekul nebo substruktur.
Rekkerova metoda
Podle Rekkera (g) se hodnota log P
o/v
vypočte takto:
log P
o/v
= suma a
i
f
i
+ suma (interakční člen) i j
kde f
i
představuje konstanty různých molekulárních fragmentů a ai četnost jejich výskytu ve vyšetřované molekule. Korekční členy je možné vyjádřit jako souhrnný násobek jediné konstanty Cm (tzv. „magické konstanty“). Konstanty pro molekulární fragmenty fi a Cm byly stanoveny ze seznamu 1 054 experimentálních hodnot P
o/v
(pro 825 sloučenin) pomocí vícenásobné regresní analýzy (c, h). Interakční členy se určí podle stanovených pravidel popsaných v literatuře (e, h, i).
Hanschova-Leova metoda
Podle Hansche a Lea (c) se hodnota log P
o/v
vypočte z výrazu:
   
   logP
o/v
= suma a
i
f
i
+ suma b
j
F
j
i j
kde f
i
představuje konstanty různých molekulárních fragmentů, F
j
korekční členy a a
i
, b
j
odpovídající četnosti výskytů. Na základě experimentálních hodnot P
o/v
byl pokusně sestaven seznam hodnot pro atomové a skupinové fragmenty a seznam korekčních členů F
j
(tzv. „faktorů“). Korekční členy byly setříděny do několika různých tříd (a, c). Zohlednění všech pravidel a korekčních členů je poměrně složité a časově náročné. Byly vyvinuty sady softwaru (b).
Kombinovaná metoda
Výpočet log P
o/v
složitých molekul lze značně zdokonalit, jestliže se molekula rozdělí do větších podstruktur, pro něž existují spolehlivé hodnoty pocházející buď z tabulek (b, c), nebo z vlastních měření. Tyto fragmenty (např. heterocykly, antrachinon, azobenzen) lze poté kombinovat s Hanschovými - hodnotami nebo s Rekkerovými nebo Leovými konstantami pro fragmenty.
Poznámky
i) Výpočetní metody lze použít pro částečně nebo úplně disociované sloučeniny pouze tehdy, lze­li vzít v úvahu nezbytné korekční faktory.
ii) Pokud lze předpokládat přítomnost intramolekulárních vodíkových vazeb, je nutné přičíst odpovídající korekční členy (přibližně 0,6 až 1,0 logaritmu P
o/v
) (a). O přítomnosti těchto vazeb lze usuzovat z prostorových modelů nebo ze spektroskopických dat molekuly.
iii) Může-li existovat několik tautomerních forem, měla by být jako základ pro výpočet použita nejpravděpodobnější forma.
iv) Pečlivě by měly být sledovány přepracované seznamy konstant fragmentů.
Protokol o zkoušce
Při použití výpočtové metody nebo metody odhadu by měl protokol o zkoušce pokud možno obsahovat následující údaje:
— popis látky (směs, nečistoty atd.),
— známky přítomnosti intramolekulárních vodíkových vazeb, disociace, nábojů a dalších neobvyklých efektů (např. tautomerie),
— popis výpočtové metody,
— označení nebo uvedení databáze,
— zvláštnosti při volbě fragmentů,
— vyčerpávající dokumentaci výpočtů.
LITERATURA
(a) W. J. Lyman, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt (ed). Handbook of Chemical Property Estimation Methods. McGraw-Hill, New York, 1983.
(b) Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3). Pomona College. Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA.
(c) C. Hansch, A. J. Leo. Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Wiley, New York, 1979.
(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins. Chem. Rev. 1971, 71, 525
(e) R. F. Rekker, H. M. de Kort. Eur. S. Med. Chem. – Chim. Ther. 1979, 14, 479.
(f) T. Fujita, J. Iwasa, C. Hansch. J. Amer. Chem. Soc., 1964, 86, 5175.
(g) R. F. Rekker. The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library. Elsevier, New York, 1977, 1.
(h) C. V. Eadsforth, P. Moser. Chemosphere, 1983, 12, 1459.
(i) R. A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, 225.
DODATEK 2
Doporučené referenční látky pro metodu HPLC
------------------------------------- -----------------------------------
Číslo Referenční látka                 log P
o/v
pK
a
------------------------------------- ----------------------------------- 1 butan­2­on 0,3 2 4­acetylpyridin 0,5 3 anilin 0,9 4 acetanilid 1,0 5 benzylalkohol 1,1 6 4-methoxyfenol 1,3 pK
a
= 10,26 7 kyselina fenoxyoctová 1,4 pK
a
= 3,12 8 fenol 1,5 pK
a
= 9,92 9 2,4­dinitrofenol 1,5 pK
a
= 3,96 10 benzonitril 1,6 11 fenylacetonitril 1,6 12 4­methylbenzylalkohol 1,6 13 acetofenon 1,7 14 2­nitrofenol 1,8 pK
a
= 7,17 15 kyselina 3­nitrobenzoová 1,8 pK
a
= 3,47 16 4­chloranilin 1,8 pK
a
= 4,15 17 nitrobenzen 1,9 18 3­fenylpropan­2­ol 1,9 19 kyselina benzoová 1,9 pK
a
= 4,19 20 p­kresol 1,9 pK
a
= 10,17 21 kyselina skořicová 2,1 pK
a
= 3,89 cis 4,44 trans 22 anisol 2,1 23 methyl­benzoát 2,1 24 benzen 2,1 25 kyselina 3­methylbenzoová 2,4 pK
a
= 4,27 26 4­chlorfenol 2,4 pK
a
= 9,1 27 trichlorethylen 2,4 28 atrazin 2,6 29 ethyl­benzoát 2,6 30 2,6­dichlorbenzonitril 2,6 31 kyselina 3­chlorbenzoová 2,7 pK
a
= 3,82 32 toluen 2,7 33 naftalen­1­ol 2,7 pK
a
= 9,34 34 2,3­dichloranilin 2,8 35 chlorbenzen 2,8 36 allylfenylether 2,9 37 brombenzen 3,0 38 ethylbenzen 3,2 39 benzofenon 3,2 40 4­fenylfenol 3,2 pK
a
= 9,54 41 thymol 3,3 42 1,4­dichlorbenzen 3,4 43 difenylamin 3,4 pK
a
= 0,79 44 naftalen 3,6 45 fenyl­benzoát 3,6 46 isopropylbenzen 3,7 47 2,4,6­trichlorfenol 3,7 pK
a
= 6 48 bifenyl 4,0 49 benzyl­benzoát 4,0 50 2,4­dinitro­6­sek­butylfenol 4,1 51 1,2,4­trichlorbenzen 4,2 52 kyselina dodekanová 4,2 53 difenylether 4,2 54 n­butylbenzen 4,5 55 fenanthren 4,5 56 fluoranthen 4,7 57 dibenzyl 4,8 58 2,6­difenylpyridin 4,9 59 trifenylamin 5,7 60 DDT 6,2 ------------------------------------- ----------------------------------- Jiné referenční látky s nízkou hodnotou log P
o/v
------------------------------------- ----------------------------------- 1 kyselina nikotinová -0,07 ------------------------------------- -----------------------------------
VIII. METODA PRO STANOVENÍ VÝBUŠNÝCH VLASTNOSTÍ – METODA A.14 PODLE PŘÍLOHY SMĚRNICE 92/69/EHS
VIII.1 METODA
VIII.1.1 ÚVOD
Metoda pro zjišťování výbušnosti látky stanovuje zkušební postup pro zjištění, zda látka je z hlediska výbuchu citlivá na působení tepla, na náraz nebo na tření, a to za podmínek uvedených v této metodě.
Metoda poskytuje údaje pro ohodnocení možnosti vyvolání výbuchu působením uvedených podnětů; neslouží však ke zjištění, zda je látka schopna vybuchovat za jakýchkoliv podmínek.
Látka se podrobí následujícím zkouškám
a) zkoušce citlivosti na působení tepla,
b) zkoušce citlivosti na náraz,
c) zkoušce citlivosti na tření,
Při uvedených zkouškách lze použít i alternativní přístroje, a to za podmínky, že jsou mezinárodně uznávané a že jimi získané výsledky odpovídají výsledkům získaným na přístrojích uvedených v příloze. Zkoušky se neprovádějí, lze-li u látky na základě odborného posouzení vyslovit jednoznačný závěr, že se látka nemůže rychle rozkládat za vývoje plynů a uvolňování tepla a nepředstavuje tedy nebezpečí výbuchu.
VIII.1.2 DEFINICE A REFERENČNÍ LÁTKY
Pro účely této vyhlášky se považuje za výbušnou látku taková chemická látka nebo chemický přípravek, která je schopna vybuchnout působením tepla nebo která z hlediska možnosti vybuchnout je citlivá na náraz nebo na tření v přístroji uvedeném v příloze nebo je citlivější na náraz nebo na tření než 1,3-dinitrobenzen v alternativním přístroji,
Za referenční látku se považuje
a) krystalický 1,3-dinitrobenzen, který prochází sítem o velikosti oka 0,5 mm, a to pro zkoušení citlivosti na náraz a na tření,
b) perhydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (označovaný jako RDX nebo hexogen nebo cyklonit - CAS 121-82-4) rekrystalovaný z vodného cyklohexanonu, prosátý za mokra na sítě 250 mikrom a zachycený na sítě 150 mikrom, sušený při 103 +/- 2 st. C po dobu 4 hodin, pro druhou sérii zkoušek.
VIII.1.3 PRINCIP METODY
VIII.1.3.1 Předběžná zkouška
Před provedením zkoušek se pro zajištění bezpečnosti provádí předběžná zkouška.
Předběžná zkouška se provádí s velmi malými vzorky látky, přibližně 10 mg, a to zahříváním neuzavřené látky v plameni plynového hořáku, nárazem v jakémkoliv zařízení a třením za použití paličky proti podložce nebo v jiném zařízení pro zkoušení citlivosti na tření. Účelem předběžné zkoušky je zjistit, zda látka není tak citlivá a výbušná, že předepsanou zkoušku citlivosti, zvláště zkoušku citlivosti na působení tepla, je nutné provádět za použití ochranných opatření, která by zamezila poranění osoby provádějící zkoušku.
Výsledky předběžné zkoušky neslouží k hodnocení výbušnosti látky.
VIII.1.3.2 Zkouška citlivosti na působení tepla
Při této zkoušce se látka zahřívá v ocelové trubce uzavřené clonami. Při této zkoušce se zjišťuje, zda je látka náchylná k výbuchu za podmínek intenzivního zahřívání a předepsaného utěsnění.
VIII.1.3.3 Zkouška citlivosti na náraz
Při této zkoušce se látka zkouší závažím předepsané hmotnosti, které se spouští z předepsané výšky.
VIII.1.3.4 Zkouška citlivosti na tření
Při této zkoušce se pevná nebo pastovitá látka zkouší třením mezi standardními povrchy za předepsaných podmínek zatížení a vzájemného pohybu. U kapalin se zkouška třením neprovádí.
VIII.1.4 POPIS METODY
VIII.1.4.1 Zkouška citlivosti na působení tepla
VIII.1.4.1.1 Zařízení
Zařízení je tvořeno ocelovou trubkou k jednomu použití se znovupoužitelným uzavíracím zařízením (obrázek 1) instalovanou v ohřívacím a ochranném zařízení. Každá trubka je hlubokotažená z ocelového plechu. Její vnitřní průměr je 24 mm, délka 75 mm a tloušťka stěny 0,5 mm. Na otevřeném konci trubky je příruba sloužící k uzavření trubky sestavou clony. Sestava je tvořena clonou se středovým otvorem odolnou vůči tlaku připevněnou k trubce pomocí dvoudílného šroubového spoje (matice a závitová příruba). Matice a závitová příruba jsou zhotoveny z chrom-manganové oceli, která je do 800 st. C nejiskřivá. Clony mají tloušťku 6 mm, jsou vyrobeny ze žáruvzdorné oceli a tvoří řadu podle velikosti otvorů.
VIII.1.4.1.2 Podmínky zkoušky
Látka se obvykle zkouší ve stavu, v jakém je dodána. V některých případech, např. když je lisovaná, litá nebo jiným způsobem zhutněná, může být zkoušena po rozdrcení.
U pevných látek se hmotnost látky použité v každé zkoušce určí ve dvou etapách. V první etapě se zvážená trubka naplní 9 cm
3
látky a po celém průřezu trubky se látka stlačí silou 80 N. Z bezpečnostních důvodů nebo v případech, kdy stlačováním může dojít ke změně fyzikální formy vzorku, lze použít jiný způsob plnění; například je-li látka velmi citlivá na tření, není vhodné její stlačování. Je-li látka stlačitelná, přidá se další množství této látky a stlačuje se, až je trubka zaplněna do vzdálenosti 55 mm od horního okraje. Zjistí se celkové množství látky použité pro naplnění do úrovně 55 mm od horního okraje a přidají se další 2 podíly látky, přičemž každý se stlačí silou 80 N. Látka se pak podle potřeby bud' přidá a stlačí, nebo odebere tak, aby trubka byla naplněna do úrovně 15 mm od horního okraje. Zjištěná celková hmotnost látky je základem pro provedení druhé etapy. Při ní se nejprve vnese do trubky třetina z hmotnosti zjištěné v první etapě a stlačí se. Vnesou se další 2 podíly, stlačí se silou 80 N a podle potřeby se přidá nebo odebere látka v trubce na úroveň 15 mm od horního okraje trubky. Množství pevné látky zjištěné ve druhé etapě se použije pro každý pokus; naplnění se provede se 3 stejnými množstvími a každé z nich se stlačí na objem 9 cm
3
bez ohledu na to, jaké síly bude zapotřebí. Pro usnadnění lze k tomu použít rozpěrné kroužky.
Kapaliny a gely se naplní do trubky do výšky 60 mm. Zvláštní pozornost je třeba věnovat gelům, aby nedošlo k tvorbě dutin. Zezdola se na trubku navleče závitová příruba, vloží se vhodná clona a po nanesení mazadla na bázi disulfidu molybdeničitého se matice utáhne. Je nutné se přesvědčit, zda nějaká látka nezůstala zachycena mezi přírubou a clonou nebo v závitech.
Naplněná a uzavřená trubka se zahřívá propanem odebíraným přes průtokoměr z průmyslové tlakové láhve s regulátorem tlaku seřízeným na rozmezí 6 až 7 kPa. Propan se rozděluje rozdělovacím potrubím stejnoměrně do 4 hořáků, což se ověří vizuálně pozorováním plamenů hořáků. Hořáky jsou umístěny kolem zkušební trubky (obrázek 1). 4 hořáky mají celkovou spotřebu přibližně 43,2 dm
3
propanu za minutu. Lze použít alternativní palivo a hořáky, avšak rychlost ohřevu musí být stejná, jak je uvedeno na obrázku 3. U všech zařízení se musí pravidelně kontrolovat rychlost ohřevu za použití trubek naplněných dibutylftalátem (obrázek 3).
VIII.1.4.1.3 Provedení zkoušky
Každá zkouška se provádí do roztržení trubky nebo až doba ohřevu dosáhne 5 minut. Nejprve se provede série 3 zkoušek s clonou o průměru otvoru 6 mm, a pokud nedojde k výbuchu, provede se druhá série 3 zkoušek s clonou o průměru otvoru 2 mm. Dojde-li k výbuchu u kterékoliv zkušební série, nevyžadují se další zkoušky.
Projevem výbuchu je roztržení trubky na 3 nebo více částí, z nichž některé mohou být vzájemně spojeny úzkými proužky kovu (obrázek 2). Zkouška, při níž se vytvoří méně částí nebo nevzniknou žádné části, se považuje za zkoušku, při níž nedošlo k výbuchu.
VIII.1.4.1.4 Vyhodnocení zkoušky
Zkouška se považuje za pozitivní, pokud dojde k výbuchu u kterékoliv zkušební série.
VIII.1.4.2 Zkouška citlivosti na náraz
VIII.1.4.2.1 Zařízení
Základními částmi obvyklých zařízení s padacím kladivem je blok z šedé litiny s podstavcem, podložka (kovadlina), sloup, vodicí lišty, padací závaží (kladivo), zadržovací a uvolňovací zařízení a držák vzorku (obrázek 4). Ocelová podložka (kovadlina) o průměru 100 mm a výšce 70 mm je přišroubována k horní straně ocelo-litinového bloku o délce 230 mm, šířce 250 mm a výšce 200 mm se základovou (litinovou) deskou o délce 450 mm, šířce 450 mm a výšce 60 mm. Sloup tvořený bezešvou taženou ocelovou trubkou je připevněn držákem přišroubovaným na zadní stranu ocelo-litinového bloku. 4 šrouby ukotvují zařízení k betonovému bloku o rozměrech 60 x 60 x 60 cm takovým způsobem, že vodicí lišty jsou přesně kolmo a padací závaží padá volně. Vhodné je použít závaží o hmotnosti 5 a 10 kg z pevné oceli. Úderová hlava každého závaží je z tvrzené oceli HRC 60 až 63 o minimálním průměru 25 mm.
Zkoušený vzorek se uzavře do zkušebního přípravku tvořeného 2 souosými ocelovými válci umístěnými nad sebou a vodicím pouzdrem tvořeným dutým ocelovým válcem. Plné ocelové válce o průměru mezi 10 - 0,003 mm a 10 - 0,005 mm a výšce 10 mm mají vyleštěné plochy, zakulacené hrany s poloměrem zakřivení 0,5 mm a tvrdost HRC 58 až 65. Dutý válec musí mít vnější průměr 16 mm, vyleštěný vyvrtaný otvor o průměru mezi 10 + 0,005 mm a 10 + 0,010 mm a výšku 13 mm. Sestavený zkušební přípravek se umístí na výměnnou mezipodložku o průměru 26 mm a výšce 26 mm, který je vystředěn středícím kroužkem s otvory pro odvod dýmů.
VIII.1.4.2.2 Podmínky zkoušky
Objem vzorku činí 40 mm
3
nebo takový objem, který je vhodný pro alternativní zařízení. Pevné látky se zkoušejí v suchém stavu a připravují se následujícím způsobem:
a) práškové látky se prosejí sítem o velikosti oka 0,5 mm; ke zkoušení se použije veškerý podíl, který projde sítem,
b) lisované, lité nebo jiným způsobem zhutněné látky se rozdrtí na malé kousky a prosejí; pro zkoušení látky se jako reprezentativní vzorek původní látky použije prosetý podíl o velikosti částic od 0,5 mm do 1 mm.
Látky dodávané ve formě pasty se zkoušejí pokud možno v suchém stavu nebo po odstranění nejvýše možného množství ředidla. Kapalné látky se zkoušejí s mezerou 1 mm mezi horním a dolním ocelovým válcem.
VIII.1.4.2.3 Provedení zkoušky
U série 6 zkoušek se pustí závaží o hmotnosti 10 kg z výšky 0,40 m (40 J). Dojde-li během těchto 6 zkoušek při 40 J k výbuchu, musí se provést další série 6 zkoušek s puštěním závaží o hmotnosti 5 kg z výšky 0,15 m (7,5 J). V jiných zařízeních se vzorek porovnává se zvolenou referenční látkou za použití stanoveného postupu (např. postup up-and-down).
VIII.1.4.2.4 Vyhodnocení zkoušky
Výsledek se považuje za pozitivní, jestliže se při kterékoliv zkoušce nejméně jednou zaznamená výbuch (třesk nebo plamen), nebo při zkouškách v jiných zařízeních je zkoušená látka citlivější než 1,3- dinitrobenzen nebo RDX.
VIII.1.4.3 Zkouška citlivosti na tření
VIII.1.4.3.1 Provedení
Třecí zařízení (obrázek 5) je tvořeno základovou deskou z lité oceli, na které je upevněno třecí zařízení. To je tvořeno nepohyblivým porcelánovým kolíkem a pohyblivou porcelánovou destičkou. Porcelánová destička je upevněna na saních vedených 2 vodícími lištami. Saně jsou připojeny k elektromotoru ojnicí, excentrickou vačkou a vhodným ozubeným převodem tak, že porcelánová destička vykonává pod porcelánovým kolíkem pohyb tam a zpět na délce dráhy 10 mm. Porcelánový kolík se může zatížit silou buď 120 N, nebo 360 N.
Rovné porcelánové destičky jsou vyrobeny z bílého technického porcelánu o drsnosti 9 až 32 mikrom o délce 25 mm, šířce 25 mm a výšce 5 mm. Válcový porcelánový kolík je rovněž vyroben z bílého technického porcelánu a má délku 15 mm a průměr 10 mm a zdrsněné kulové plochy s poloměrem zakřivení 10 mm.
VIII.1.4.3.2 Podmínky zkoušky
Objem vzorku činí 10 mm
3
nebo takový objem, který je vhodný pro alternativní zařízení. Pevné látky se zkoušejí v suchém stavu a připravují se následujícím způsobem:
a) práškové látky se prosejí sítem o velikosti oka 0,5 mm; ke zkoušení se použije veškerý podíl, který projde sítem,
b) lisované, lité nebo jiným způsobem zhutněné látky se rozdrtí na malé kousky a prosejí; pro zkoušení látky se použije prosetý podíl o velikosti částic menší než 0,5 mm.
Látky dodávané ve formě pasty se zkoušejí pokud možno v suchém stavu. Není-li možné připravit látku v suchém stavu, zkouší se pasta, a to po odstranění nejvýše možného množství ředidla, ve formě proužku o tloušťce 0,5 mm, šířce 2 mm a délce 10 mm připraveného v tvarovací formě.
VIII.1.4.3.3 Provedení zkoušky
Porcelánový kolík se přiloží na zkoušený vzorek a zatíží se. Při provádění zkoušky musí být rýhy v porcelánové destičce příčně ke směru pohybu. Je nutné dbát na to, aby kolík zůstal na vzorku, aby pod kolíkem zůstalo ležet dostatečné množství vzorku a také aby se destička pohybovala správně pod kolíkem. U pastovitých látek se pro nanesení látky na destičku používá měrka 0,5 mm silná s otvorem 2 x 10 mm. Porcelánová destička se musí pohybovat pod porcelánovým kolíkem po dráze 10 mm tam a zpět za 0,44 s. Každá část povrchu destičky a kolíku se smí použít pouze jednou; 2 konce každého kolíku slouží pro 2 pokusy a každá ze 2 stran destičky slouží pro 3 pokusy.
Série 6 zkoušek se provádí se zatížením 360 N. Získá-li se pozitivní výsledek během těchto 6 zkoušek, musí se provést další série 6 zkoušek se zatížením 120 N. U jiných zařízení se vzorek porovnává se zvolenou referenční látkou za použití stanoveného postupu (např. postup up-and-down).
VIII.1.4.3.4 Vyhodnocení zkoušky.
Výsledek se považuje za pozitivní, jestliže se nejméně jednou zaznamená výbuch (třesk, praskání, jiskření nebo plamen) při kterékoliv zkoušce nebo zkoušená látka splňuje ekvivalentní kritéria v jiných zkouškách.
VIII.2 DATA
Zkoušená látka se považuje za výbušnou ve smyslu zákona, pokud se při její zkoušce citlivosti na působení tepla, náraz nebo tření získá pozitivní výsledek.
VIII.3 ZPRÁVA
Zpráva o zkoušce obsahuje, pokud je to možné, zejména následující informace:
a) identifikaci, chemické složení, čistotu a vlhkost zkoušené látky,
b) fyzikální formu vzorku a informace, zda se vzorek drtil, mlel nebo proséval,
c) údaje zjištěné při zkoušce citlivosti na působení tepla, například hmotnost vzorku a počet úlomků,
d) pozorované jevy při zkoušce citlivosti na náraz nebo při zkoušce citlivosti na tření, například tvorba značného množství dýmu nebo úplný rozklad, plameny, jiskry, třesk nebo praskání,
e) výsledky každého typu zkoušky,
f) zdůvodnění použití alternativního přístroje a důkaz srovnatelnosti získaných výsledků s výsledky získanými s přístrojem uvedeným v této metodě,
g) poznámky, které mohou mít význam pro správné hodnocení výsledků, například odkazy na zkoušky podobných látek,
h) další poznámky, které mají vztah k interpretaci výsledků.
Ve zprávě o zkoušce se uvádí také všechny výsledky, které jsou považovány za chybné, anomální nebo nereprezentativní. Jestliže byly některé hodnoty vyřazeny, je nutné podat vysvětlení a uvést všechny výsledky náhradních nebo doplňkových zkoušek. Pokud není možno anomální výsledek kvalifikovaně vysvětlit, je třeba jej přijmout tak, jak byl dosažen, a látku ohodnotit způsobem odpovídajícím dosaženému výsledku.
VIII.4 LITERATURA
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and criteria, 1990, United Nations, New York.
(2) Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Butterworths, London, ISBN 0- 750-60103-5, 1990.
(3) Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, vol. 3, 6 – 13 a 30 – 42.
(4) NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of explosive risk.
                                Obrázek 1
               Zařízení na zkoušku citlivosti na působení tepla
                           (všechny rozměry v mm)
                 



Obrázek 2 Zkoušku citlivosti na působení tepla Příklady roztržení trubky


Obrázek 3 Kalibrace rychlosti ohřevu pro zkoušku citlivosti na působení tepla


Obrázek 4 Přístroj pro zkoušku citlivosti na náraz (všechny rozměry v mm)





Obrázek 5 Přístroj pro zkoušku citlivosti na tření


IX. METODA PRO STANOVENÍ ČÍSELNĚ STŘEDNÍ MOLEKULOVÉ HMOTNOSTI A DISTRIBUCE MOLEKULOVÉ HMOTNOSTI POLYMERŮ – METODA A.18 PODLE PŘÍLOHY SMĚRNICE KOMISE 98/73/ES ZE DNE 18. ZÁŘÍ 1998, KTEROU SE PO ČTYŘIADVACÁTÉ PŘIZPŮSOBUJE TECHNICKÉMU POKROKU SMĚRNICI RADY 67/548/EHS O SBLIŽOVÁNÍ PRÁVNÍCH A SPRÁVNÍCH PŘEDPISŮ TÝKAJÍCÍCH SE KLASIFIKACE, BALENÍ A OZNAČOVÁNÍ NEBEZPEČNÝCH LÁTEK (DÁLE JEN „SMĚRNICE 98/73/ES“)
IX.1. METODA
Tato metoda gelové permeační chromatografie je replikou metody OECD TG 118 (1996). Základní principy a další technické informace jsou uvedeny v odkaze 1.
IX.1.1 Úvod
Vlastnosti polymerů jsou tak rozdílné, že je nemožné popsat jedinou metodu a stanovit přesně podmínky separace a hodnocení, které by pokryly všechny eventuality a specifika vyskytující se při separaci polymerů. Zejména pro komplexní polymerní systémy není gelová permeační chromatografie (GPC) vždy vhodná. Není­li GPC použitelná, může být molekulová hmotnost stanovena jinými metodami (viz příloha). V takových případech by měly být uvedeny veškeré podrobnosti a zdůvodnění použité metody.
Popsaná metoda je založena na normě DIN 55672 (1). Podrobné informace o provádění experimentů a o hodnocení dat lze nalézt v uvedené normě DIN. V případě, že jsou nezbytné úpravy experimentálních podmínek, musí být změny zdůvodněny. Mohou být použity jiné normy, jsou­li uvedeny kompletní odkazy na ně. V popsané metodě jsou ke kalibraci použity vzorky polystyrenu o známé polydisperzitě a metoda může být upravena tak, aby byla vhodná pro určité polymery, např. vodorozpustné větvené polymery s dlouhým řetězcem.
IX.1.2 Definice a jednotky Číselně střední molekulová hmotnost M
n
a hmotnostně střední molekulová hmotnost M
w
se stanoví pomocí následujících rovnic:
                            



kde H
i
je výška signálu detektoru nad základnou pro retenční objem V
i
, M
i
je molekulová hmotnost frakce polymeru pro retenční objem Vi, a n je počet dat.
Šířka distribuce molekulové hmotnosti, která je mírou disperzity systému, je dána poměrem M
w
/M
n
.
IX.1.3 Referenční látky
Vzhledem k tomu, že GPC je relativní metoda, musí být provedena kalibrace. K tomuto účelu se obvykle používá lineární polystyrenový standard s úzkou distribucí se známými středními molekulovými hmotnostmi M
n
a M
w
a se známým rozdělením molekulové hmotnosti. Kalibrační křivka může být pro stanovení molekulové hmotnosti neznámého vzorku použita pouze tehdy, byly­li podmínky separace vzorku a standardů identické. Pevný vztah mezi molekulovou hmotností a elučním objemem je platný pouze za specifických podmínek určitého experimentu. Podmínky zahrnují především teplotu, rozpouštědlo (nebo směs rozpouštědel), chromatografické podmínky a separační kolonu nebo systém separačních kolon.
Molekulové hmotnosti stanovené tímto způsobem jsou relativními hodnotami a označují se jako „molekulární hmotnosti polystyrenového ekvivalentu“. To znamená, že se molekulová hmotnost bude v závislosti na strukturních a chemických rozdílech mezi vzorkem a standardem od absolutní hodnoty více či méně lišit. Použijí­li se jiné standardy, např. polyethylenglykol, polyethylenoxid, polymethylmethakrylát, polyakrylová kyselina, musí být použití zdůvodněno.
IX.1.4 Princip zkušební metody
Rozdělení molekulové hmotnosti vzorku i střední molekulové hmotnosti (M
n
, M
w
) lze stanovit metodou GPC. GPC je speciální typ kapalinové chromatografie, při němž je vzorek rozdělen podle hydrodynamických objemů jeho jednotlivých složek (2).
Separace probíhá při průchodu vzorku kolonou naplněnou porézním materiálem, obvykle organickým gelem. Malé molekuly proniknou póry, zatímco velké molekuly jsou zadrženy. Průchod velkých molekul je tedy kratší a jsou eluovány nejdříve. Středně velké molekuly pronikají některými póry a jsou eluovány později. Nejmenší molekuly se středním hydrodynamickým poloměrem menším než velikost pórů gelu pronikají všemi póry. Tyto molekuly jsou eluovány nakonec.
V ideálním případě závisí separace pouze na velkosti molekul, ale v praxi je obtížné vyhnout se alespoň některým rušivým absorpčním jevům. Nestejnoměrná náplň kolony a mrtvé objemy mohou situaci zhoršit (2).
Detekce se provádí například prostřednictvím měření indexu lomu nebo absorpce UV a dává jednoduchou distribuční křivku. Má­li být však křivce přiřazena skutečná molekulová hmotnost, je nezbytné kalibrovat kolonu průchodem polymerů o známé molekulové hmotnosti a v ideálním případě s v podstatě podobnou strukturou, např. různé polystyrenové standardy. Křivka má zpravidla gaussovský tvar, někdy deformovaný prodloužením na straně nízké molekulové hmotnosti, přičemž svislá osa udává hmotnostní podíl různých molekulových hmotnostní a na vodorovné ose jsou vynesen logaritmus molekulové hmotnosti.
IX.1.5 Kritéria kvality
Opakovatelnost (relativní směrodatná odchylka: RSD) elučního objemu by měla být lepší než 0,3 %. Požadovaná opakovatelnost musí být zajištěna korekcí prostřednictvím standardů, je­li chromatogram hodnocen jako funkce času a neodpovídá výše uvedenému kritériu (1).
       Polydisperzity   jsou  závislé   na   molekulových
       hmotnostech  standardů. V případě  polystyrenových
       standardů jsou typickými hodnotami

       M
p
< 2 000 M
w
/M
n
< 1,20 2 000 = Mp = 10
6
M
w
/M
n
< 1,05 M
p
> 10
6
M
w
/M
n
< 1,20 (M
p
je molekulová hmotnost standardu v maximu píku)
IX.1.6 Popis zkušební metody
IX.1.6.1 Příprava standardních roztoků polystyrénu
Polystyrenové standardy se rozpustí opatrným smícháním se zvoleným elučním činidlem. Při přípravě roztoků se musí zohlednit doporučení výrobce.
Koncentrace zvolených standardů závisí na různých faktorech, např. na vstřikovaném objemu, viskozitě roztoku a citlivosti analytického detektoru. Maximální vstřikovaný objem musí být přizpůsoben délce kolony, aby nedošlo k přesycení. Typické vstřikované objemy pro analytickou separaci pomocí GPC s kolonou o rozměrech 30×7,8 mm jsou obvykle 40 až 100 µl. Větší objemy jsou možné, ale neměly by překročit 250 µl. Optimální poměr mezi vstřikovaným objemem a koncentrací musí být stanoven před vlastní kalibrací kolony.
IX.1.6.2 Příprava roztoku vzorku
Stejné požadavky platí v zásadě pro přípravu roztoků vzorku. Vzorek se opatrným protřepáním rozpustí ve vhodném rozpouštědle, např. v tetrahydrofuranu (THF). V žádném případě by neměl být rozpuštěn pomocí ultrazvukové lázně. Je­li to nezbytné, přečistí se roztok vzorku filtrací přes membránový filtr o velikosti pórů 0,2 až 2 µm.
Přítomnost nerozpuštěných částic musí být zaznamenána v konečném protokolu, neboť mohou pocházet z frakcí s vysokou molekulovou hmotností. Pro stanovení hmotnostního podílu nerozpuštěných částic vyjádřeného v procentech by měla být použita vhodná metoda. Roztoky by měly být použity do 24 hodin.
IX.1.6.3 Přístroje a pomůcky
— zásobník rozpouštědla,
— odplynovací zařízení (podle potřeby),
— čerpadlo,
— tlumič rázů (podle potřeby),
— vstřikovací systém,
— chromatografické kolony,
— detektor,
— průtokoměr (podle potřeby),
— zapisovač,
— nádoba na odpad.
Musí být zajištěno, aby byl GPC systém inertní k použitým rozpouštědlům (např. použitím ocelových kapilár pro THF).
IX.1.6.4 Vstřikování a systém dávkování rozpouštědla
Definovaný objem roztoku vzorku se nanáší na kolonu buď ručně, nebo dávkovačem do ostře ohraničené zóny. Příliš rychlý pohyb pístu vzad nebo vpřed (při ručním nanášení) může způsobit změny v pozorovaném rozdělení molekulové hmotnosti. Dávkovač rozpouštědla by pokud možno neměl působit rázy a v ideálním případě by měl být osazen tlumičem rázů. Průtok je řádově 1 ml/min.
IX.1.6.5 Kolona
Podle typu vzorku se polymer charakterizuje použitím jednoduché kolony nebo několika za sebou řazenými kolonami. Komerčně je dostupná řada porézních materiálů definovaných vlastností (např. velikost pórů, meze zadržení).Výběr separačního gelu nebo délky kolony závisí jak na vlastnostech vzorku (hydrodynamický objem, distribuce molekulové hmotnosti), tak na specifických podmínkách separace, jako jsou rozpouštědlo, teplota a průtok (1), (2), (3).
IX.1.6.6 Teoretická patra Použitá kolona nebo kombinace kolon musí být charakterizována počtem teoretických pater. V případě použití THF jako elučního činidla to znamená nanesení roztoku ethylbenzenu nebo jiného vhodného nepolárního roztoku na kolonu známé délky. Počet teoretických pater je dán následující rovnicí
        




kde N je počet teoretických pater, V
e
je eluční objem v maximu píku, W šířka základny píku, W
1/2
šířka píku v polovině výšky.
IX.1.6.7 Separační účinnost
Vedle počtu teoretických pater, který je veličinou určující šířku pásu, hraje roli také separační účinnost, která se stanoví ze strmosti kalibrační křivky. Separační účinnost kolony se získá z následujícího vztahu:
                            




kde V
e
,M
x
je eluční objem pro polystyren s molekulovou hmotností Mx, V
e
,(10M
x
) je eluční objem pro polystyren s 10krát větší molekulovou hmotností. Rozlišení systému je obecně definováno tímto vztahem: kde Ve
1
, V
e2
jsou eluční objemy dvou standardů polystyrénu v maximu píku, W
1
, W
2
jsou šířky základen píků, M
1
, M
2
molekulové hmotnosti odpovídající maximu píků (měly by se lišit faktorem 10). Hodnota R pro kolonový systém by měla být větší než 1,7 (4).
IX.1.6.8 Rozpouštědla
Všechna rozpouštědla musí mít vysokou čistotu (v případě THF 95% čistoty). Zásobník rozpouštědla (v případě potřeby pod inertní atmosférou) musí být dostatečně velký pro kalibraci kolony a pro několik analýz vzorku. Z rozpouštědla musí být před jeho nanesením čerpadlem na kolonu odstraněny plyny.
IX.1.6.9 Kontrola teploty
Teplota kritických vnitřních součástí (vstřikovací smyčky, kolon, detektoru a potrubí) by měla být konstantní a měla by být sladěna s volbou rozpouštědla.
IX.1.6.10 Detektor
Detektor slouží ke kvantitativnímu zaznamenávání koncentrace vzorku eluovaného z kolony. Nemá­li dojít ke zbytečnému rozšíření píků, musí být objem kyvety detekční cely co nejmenší. Neměl by být větší než 10 µl, s výjimkou detektorů k měření rozptylu světla a viskozity. K detekci se obvykle používají diferenciální refraktometry. Vyžadují­li si to však specifické vlastnosti vzorku nebo elučního rozpouštědla, lze použít jiné typy detektorů, např. UV/VIS, IR detektory a detektory viskozity atd.
IX.2 DATA A ZPRÁVY
IX.2.1 Data
Pokud jde o podrobná kritéria hodnocení a o požadavky týkající se registrace a zpracování dat, měla by být použita norma DIN (1). Pro každý vzorek musí být provedeny dva nezávislé experimenty. Analýzy musí být provedeny samostatně.
Pro každé měření musí být uvedeny hodnoty M
n
, M
w
, M
w
/M
n
a M
p
. Je nezbytné výslovně uvést, že naměřené hodnoty jsou relativními hodnotami odpovídajícími molekulové hmotnosti použitého standardu.
Po stanovení retenčních objemů nebo retenčních časů (případně korigovaných za použití vnitřního standardu) se proti těmto veličinám vynesou do grafu hodnoty log M
p
(přičemž M
p
je výška maxima píku kalibračního standardu). Na jednu dekádu hodnot molekulární hmotnosti jsou nezbytné alespoň dva kalibrační body a pro celou křivku, která by měla pokrýt odhadovanou molekulovou hmotnost vzorku, se požaduje alespoň pět naměřených bodů. Poslední bod kalibrační křivky na straně nízkých molekulových hmotností se definuje n­hexylbenzenem nebo jiným vhodným nepolárním rozpouštědlem. Číselně střední a hmotnostně střední molekulová hmotnost se obecně stanoví elektronickým zpracováním dat založeným na vzorcích v bodě 1.2. V případě manuálního hodnocení lze použít metodu ASTM D 3536­91 (3).
Distribuční křivka musí být vyvedena ve formě tabulky nebo graficky (diferenciální četnost nebo kumulativní četnost v procentech proti log M). V případě grafické prezentace by měla mít jedna dekáda molekulární hmotnosti délku 4 cm a výška maxima píku by měla být asi 8 cm. V případě integrálních distribučních křivek by měla být vzdálenost mezi 0 a 100 % na ordinátě přibližně 10 cm.
IX.2.2 Protokol o zkoušce
Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:
IX.2.2.1 Zkušební látka
— dostupné informace o zkušební látce (identita, přísady, nečistoty),
— popis zpracování vzorku, pozorované skutečnosti, problémy.
IX.2.2.2 Vybavení
— zásobník elučního činidla, inertní plyn, odstranění plynu z elučního činidla, složení elučního činidla, nečistoty,
— čerpadlo, tlumič rázů, vstřikovací systém,
— separační kolony (výrobce, všechny informace o charakteristikách kolon, jako jsou velikost pórů, druh separačního materiálu atd., počet, délka a pořadí použitých kolon),
— počet teoretických pater kolony (nebo kombinace kolon), separační účinnost (rozlišení systému),
— informace o symetrii píků,
— teplota kolony, způsob kontroly teploty,
— detektor (princip měření, typ, objem kyvety),
— průtokoměr, je­li použit (výrobce, princip měření),
— systém pro zaznamenávání a zpracování dat (hardware a software).
IX.2.2.3 Kalibrace systému
— podrobný popis metody použité pro sestrojení kalibrační křivky,
— informace o kritériích kvality této metody (např. korelační koeficient, chyba součtu čtverců atd.),
— informace o všech extrapolacích, předpokladech a aproximacích provedených během experimentálního postupu a při hodnocení a zpracování dat,
— všechny naměřené hodnoty použité při konstrukci kalibrační křivky musí být dokumentovány v tabulce, která musí pro každý kalibrační bod obsahovat následující informace:
— název vzorku,
— výrobce vzorku,
— charakteristické hodnoty standardů M
p
, M
n
, M
w
a M
w
/M
n
, jak jsou poskytnuty výrobcem nebo jak jsou zjištěny z následných měření, společně s podrobnostmi o metodě stanovení,
— vstříknutý objem a vstříknutá koncentrace,
— hodnota M
p
použitá po kalibraci,
— eluční objem nebo korigovaný retenční čas měřený v maximu píku,
— hodnota M
p
vypočtená pro maximum píku,
— chyba vypočtené hodnoty M
p
a kalibrační hodnoty M
p
vyjádřená v procentech.
IX.2.2.4 Hodnocení
— hodnocení na základě časové závislosti: metody použité pro zajištění požadované reprodukovatelnosti (metoda korekce, vnitřní standard atd.),
— informace o tom, zda hodnocení bylo provedeno na základě elučního objemu nebo retenčního času,
— informace o omezeních hodnocení v případě, že pík nebyl kompletně analyzován,
— popis metody hlazení, bylo­li použito,
— příprava a postupy předběžné úpravy vzorku,
— popřípadě přítomnost nerozpuštěných částic,
— vstříknutý objem (µl) a vstříknutá koncentrace (mg/ml),
— pozorované skutečnosti, které vedou k odchylkám od ideálních charakteristik metody GPC,
— podrobný popis všech změn zkušebních postupů,
— podrobnosti o rozsahu chyb,
— jakékoliv další informace a pozorování relevantní pro interpretaci výsledků.
IX.3 LITERATURA
(1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.
(2) Yau, W. W., Kirkland, J. J., Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.
(3) ASTM D 3536­91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography­GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
(4) ASTM D 5296­92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size­Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
PŘÍLOHA
Příklady jiných metod stanovení číselně střední molekulové hmotnosti (M
n
) polymerů
Gelová permeační chromatografie (GPC) je přednostní metodou stanovení Mn, zejména tehdy, je­li k dispozici sada standardů, jejichž struktura je srovnatelná se strukturou polymeru. Vyskytnou­li se praktické obtíže při použití GPC nebo očekává­li se, že látka nevyhoví regulačním kritériím na Mn (což je třeba potvrdit), jsou k dispozici alternativní metody, jako jsou:
1. Použití koligativních vlastností
1.1 Ebulioskopie/kryoskopie: spočívá v měření zvýšení bodu varu (ebulioskopie) nebo snížení bodu tuhnutí (kryoskopie) rozpouštědla po přidání polymeru. Metoda je založena na skutečnosti, že vliv rozpuštěného polymeru na bod varu/bod tuhnutí závisí na molekulové hmotnosti polymeru (1), (2). Použitelnost: M
n
< 20 000.
1.2 Snížení tlaku par: spočívá v měření tlaku par zvolené referenční kapaliny před přidáním a po přidání známého množství polymeru (1), (2). Použitelnost: M
n
< 20 000 (teoretická; v praxi však má omezený význam).
1.3 Membránová osmometrie: spočívá na principu osmózy, tj. přirozené snahy molekul rozpouštědla proniknout polopropustnou membránou ze zředěného do koncentrovaného roztoku a ustavit rovnováhu. Při zkoušce je koncentrace zředěného roztoku nulová, zatímco koncentrovaný roztok obsahuje polymer. Pronikáním rozpouštědla membránou dochází ke tlakovému rozdílu, který závisí na koncentraci a molekulové hmotnosti polymeru (1), (3), (4). Použitelnost: M
n
od 20 000 do 200 000.
1.4 Osmometrie ­ tlak páry: spočívá ve srovnání rychlosti vypařování čistého rozpouštědla s alespoň třemi aerosoly obsahujícími polymer v různých koncentracích (1), (5), (6). Použitelnost: M
n
< 20 000.
2. Analýza koncových skupin
Použití této metody vyžaduje znalost jak celkové struktury polymeru, tak povahy koncových skupin řetězce (které musí být odlišitelné od hlavního řetězce například metodou NMR nebo titrací/derivatizací). Stanovení počtu koncových skupin polymeru může vést k hodnotě molekulové hmotnosti (7), (8), (9).
Použitelnost: M
n
až do 50 000 (s klesající spolehlivostí).
LITERATURA
(1) Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd Edn, John Wiley, New York.
(2) Glover C.A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York.
(3) ASTM D 3750­79, (1979). Standard Practice for Determination of Number­Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
(4) Coll, H. (1989). Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R.Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 25 to 52.
(5) ASTM 3592­77, (1977). Standard Recomended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
(6) Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R.Cooper ed., J. Wiley and Sons.
(7) Schröder, E., Müller, G., Arndt, K­F., (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich.
(8) Garmon, R.G., (1975). End­Group Determinations, Chapter 3. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York.
(9) Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139­2146.
X. METODA PRO STANOVENÍ OBSAHU MOLEKUL O NÍZKÉ HMOTNOSTI V POLYMERECH – METODA A.19 PODLE PŘÍLOHY SMĚRNICE 98/73/ES
X.1 METODA
Tato metoda gelové permeační chromatografie je replikou metody OECD TG 119 (1996). Základní principy a další technické informace jsou uvedeny v odkazech.
X.1.1 Úvod
Vlastnosti polymerů jsou tak rozdílné, že je nemožné popsat jedinou metodu a stanovit přesně podmínky separace a hodnocení, které by pokryly všechny eventuality a specifika vyskytující se při separaci polymerů. Zejména pro komplexní polymerní systémy není gelová permeační chromatografie (GPC) vždy vhodná. Není­li GPC použitelná, může být molekulová hmotnost stanovena jinými metodami (viz příloha). V takových případech by měly být uvedeny veškeré podrobnosti a zdůvodnění použité metody.
Popsaná metoda je založena na normě DIN 55672 (1). Podrobné informace o provádění experimentů a o hodnocení dat lze nalézt v uvedené normě DIN. V případě, že jsou nezbytné úpravy experimentálních podmínek, musí být změny zdůvodněny. Mohou být použity jiné normy, jsou­li uvedeny kompletní odkazy na ně. V popsané metodě jsou ke kalibraci použity vzorky polystyrenu o známé polydisperzitě a metoda může být upravena tak, aby byla vhodná pro určité polymery, např. vodorozpustné větvené polymery s dlouhým řetězcem.
X.1.2 Definice a jednotky
Nízká molekulová hmotnost je účelově definována jako molekulová hmotnost pod 1 000 daltonů.
  
     Číselně   střední   molekulová   hmotnost   M
n
a hmotnostně střední molekulová hmotnost M
w
se stanoví pomocí následujících rovnic:


kde H
i
je výška signálu detektoru nad základnou pro retenční objem V
i
, M
i
je molekulová hmotnost frakce polymeru pro retenční objem V
i
, a n je počet dat. Šířka distribuce molekulové hmotnosti, která je mírou disperzity systému, je dána poměrem M
w
/M
n
.
X.1.3 Referenční látky
Vzhledem k tomu, že GPC je relativní metoda, musí být provedena kalibrace. K tomuto účelu se obvykle používá lineární polystyrenový standard s úzkou distribucí se známými středními molekulovými hmotnostmi M
n
a M
w
a se známým rozdělením molekulové hmotnosti. Kalibrační křivka může být pro stanovení molekulové hmotnosti neznámého vzorku použita pouze tehdy, byly­li podmínky separace vzorku a standardů identické. Pevný vztah mezi molekulovou hmotností a elučním objemem je platný pouze za specifických podmínek určitého experimentu. Podmínky zahrnují především teplotu, rozpouštědlo (nebo směs rozpouštědel), chromatografické podmínky a separační kolonu nebo systém separačních kolon.
Molekulové hmotnosti stanovené tímto způsobem jsou relativními hodnotami a označují se jako „molekulární hmotnosti polystyrenového ekvivalentu“. To znamená, že se molekulová hmotnost bude v závislosti na strukturních a chemických rozdílech mezi vzorkem a standardem od absolutní hodnoty více či méně lišit. Použijí­li se jiné standardy, např. polyethylenglykol, polyethylenoxid, polymethylmethakrylát, polyakrylová kyselina, musí být použití zdůvodněno
.
X.1.4 Princip zkušební metody
Rozdělení molekulové hmotnosti vzorku i střední molekulové hmotnosti (M
n
, M
w
) lze stanovit metodou GPC. GPC je speciální typ kapalinové chromatografie, při němž je vzorek rozdělen podle hydrodynamických objemů jeho jednotlivých složek (2).
Separace probíhá při průchodu vzorku kolonou naplněnou porézním materiálem, obvykle organickým gelem. Malé molekuly proniknou póry, zatímco velké molekuly jsou zadrženy. Průchod velkých molekul je tedy kratší a jsou eluovány nejdříve. Středně velké molekuly pronikají některými póry a jsou eluovány později. Nejmenší molekuly se středním hydrodynamickým poloměrem menším než velikost pórů gelu pronikají všemi póry. Tyto molekuly jsou eluovány nakonec.
V ideálním případě závisí separace pouze na velkosti molekul, ale v praxi je obtížné vyhnout se alespoň některým rušivým absorpčním jevům. Nestejnoměrná náplň kolony a mrtvé objemy mohou situaci zhoršit (2).
Detekce se provádí například prostřednictvím měření indexu lomu nebo absorpce UV a dává jednoduchou distribuční křivku. Má­li být však křivce přiřazena skutečná molekulová hmotnost, je nezbytné kalibrovat kolonu průchodem polymerů o známé molekulové hmotnosti a v ideálním případě s v podstatě podobnou strukturou, např. různé polystyrenové standardy. Křivka má zpravidla gaussovský tvar, někdy deformovaný prodloužením na straně nízké molekulové hmotnosti, přičemž svislá osa udává hmotnostní podíl různých molekulových hmotnostní a na vodorovné ose jsou vynesen logaritmus molekulové hmotnosti.
X.1.5 Kritéria kvality Opakovatelnost (relativní směrodatná odchylka: RSD) elučního objemu by měla být lepší než 0,3 %. Požadovaná opakovatelnost musí být zajištěna korekcí prostřednictvím standardů, je­li chromatogram hodnocen jako funkce času a neodpovídá výše uvedenému kritériu (1).
  
     Polydisperzity   jsou  závislé   na   molekulových
       hmotnostech  standardů. V případě  polystyrenových
       standardů jsou typickými hodnotami
       M
p
< 2 000 M
w
/M
n
< 1,20 2 000 = M
p
= 10
6
M
w
/M
n
< 1,05 M
p
> 10
6
M
w
/M
n
< 1,20 (M
p
je molekulová hmotnost standardu v maximu píku)
X.1.6 Popis zkušební metody
X.1.6.1 Příprava standardních roztoků polystyrénu
Polystyrenové standardy se rozpustí opatrným smícháním se zvoleným elučním činidlem. Při přípravě roztoků se musí zohlednit doporučení výrobce.
Koncentrace zvolených standardů závisí na různých faktorech, např. na vstřikovaném objemu, viskozitě roztoku a citlivosti analytického detektoru. Maximální vstřikovaný objem musí být přizpůsoben délce kolony, aby nedošlo k přesycení. Typické vstřikované objemy pro analytickou separaci pomocí GPC s kolonou o rozměrech 30×7,8 mm jsou obvykle 40 až 100 µl. Větší objemy jsou možné, ale neměly by překročit 250 µl. Optimální poměr mezi vstřikovaným objemem a koncentrací musí být stanoven před vlastní kalibrací kolony.
X.1.6.2 Příprava roztoku vzorku
Stejné požadavky platí v zásadě pro přípravu roztoků vzorku. Vzorek se opatrným protřepáním rozpustí ve vhodném rozpouštědle, např. v tetrahydrofuranu (THF). V žádném případě by neměl být rozpuštěn pomocí ultrazvukové lázně.
Je­li to nezbytné, přečistí se roztok vzorku filtrací přes membránový filtr o velikosti pórů 0,2 až 2 µm.
Přítomnost nerozpuštěných částic musí být zaznamenána v konečném protokolu, neboť mohou pocházet z frakcí s vysokou molekulovou hmotností. Pro stanovení hmotnostního podílu nerozpuštěných částic vyjádřeného v procentech by měla být použita vhodná metoda. Roztoky by měly být použity do 24 hodin.
X.1.6. 3 Korekce na obsah nečistot a přísad
Korekce obsahu frakce s M < 1 000 v důsledku příspěvku od přítomných nepolymerních specifických složek (např. nečistot a/nebo přísad) je obvykle nezbytná, není­li naměřený obsah < 1 %. Dosáhne se toho přímou analýzou roztoku polymeru nebo eluátu GPC.
V případech, kdy je eluát po průchodu kolonou pro další analýzu příliš zředěný, musí být zkoncentrován. Může být nezbytné odpařit eluát do sucha a opět jej rozpustit. Zkoncentrování eluátu musí být provedena za podmínek, při nichž je zajištěno, že nedojde ke změnám v eluátu.
Zpracování eluátu po GPC závisí na analytické metodě použité ke kvantitativnímu stanovení.
X.1.6.4Přístroje a pomůcky
Aparatura pro GPC sestává z následujících součástí:
— zásobník rozpouštědla,
— odplynovací zařízení (podle potřeby),
— čerpadlo,
— tlumič rázů (podle potřeby),
— vstřikovací systém,
— chromatografické kolony,
— detektor,
— průtokoměr (podle potřeby),
— zapisovač,
— nádoba na odpad.
Musí být zajištěno, aby byl GPC systém inertní k použitým rozpouštědlům (např. použitím ocelových kapilár pro THF).
X.1.6.5 Vstřikování a systém dávkování rozpouštědla
Definovaný objem roztoku vzorku se nanáší na kolonu buď ručně, nebo dávkovačem do ostře ohraničené zóny. Příliš rychlý pohyb pístu vzad nebo vpřed (při ručním nanášení) může způsobit změny v pozorovaném rozdělení molekulové hmotnosti. Dávkovač rozpouštědla by pokud možno neměl působit rázy a v ideálním případě by měl být osazen tlumičem rázů. Průtok je řádově 1 ml/min.
X.1.6.6 Kolona
Podle typu vzorku se polymer charakterizuje použitím jednoduché kolony nebo několika za sebou řazenými kolonami. Komerčně je dostupná řada porézních materiálů definovaných vlastností (např. velikost pórů, meze zadržení).Výběr separačního gelu nebo délky kolony závisí jak na vlastnostech vzorku (hydrodynamický objem, distribuce molekulové hmotnosti), tak na specifických podmínkách separace, jako jsou rozpouštědlo, teplota a průtok (1), (2), (3).
X.1.6.7 Teoretická patra
Použitá kolona nebo kombinace kolon musí být charakterizována počtem teoretických pater.
       V  případě  použití THF jako elučního  činidla  to
       znamená nanesení roztoku ethylbenzenu nebo  jiného
       vhodného  nepolárního  roztoku  na  kolonu   známé
       délky.    Počet   teoretických   pater   je    dán
       následující rovnicí




kde N je počet teoretických pater, V
e
je eluční objem v maximu píku, W šířka základny píku, W
1/2
šířka píku v polovině výšky.
X.1.6.8 Separační účinnost
Vedle počtu teoretických pater, který je veličinou určující šířku pásu, hraje roli také separační účinnost, která se stanoví ze strmosti kalibrační křivky. Separační účinnost kolony se získá z následujícího vztahu:
                        




kde V
e
, M
x
je eluční objem pro polystyren s molekulovou hmotností Mx, V
e,(10Mx)
je eluční objem pro polystyren s 10krát větší molekulovou hmotností. Rozlišení systému je obecně definováno tímto vztahem:


kde V
e1
, V
e2
jsou eluční objemy dvou standardů polystyrénu v maximu píku, W
1,
W
2
jsou šířky základen píků, M
1,
M
2
molekulové hmotnosti odpovídající maximu píků (měly by se lišit faktorem 10). Hodnota R pro kolonový systém by měla být větší než 1,7 (4).
X.1.6.9 Rozpouštědla
Všechna rozpouštědla musí mít vysokou čistotu (v případě THF 95% čistoty). Zásobník rozpouštědla (v případě potřeby pod inertní atmosférou) musí být dostatečně velký pro kalibraci kolony a pro několik analýz vzorku. Z rozpouštědla musí být před jeho nanesením čerpadlem na kolonu odstraněny plyny.
X.1.6.10 Kontrola teploty
Teplota kritických vnitřních součástí (vstřikovací smyčky, kolon, detektoru a potrubí) by měla být konstantní a měla by být sladěna s volbou rozpouštědla.
X.1.6.11 Detektor
Detektor slouží ke kvantitativnímu zaznamenávání koncentrace vzorku eluovaného z kolony. Nemá­li dojít ke zbytečnému rozšíření píků, musí být objem kyvety detekční cely co nejmenší. Neměl by být větší než 10 µl, s výjimkou detektorů k měření rozptylu světla a viskozity. K detekci se obvykle používají diferenciální refraktometry. Vyžadují­li si to však specifické vlastnosti vzorku nebo elučního rozpouštědla, lze použít jiné typy detektorů, např. UV/VIS, IR detektory a detektory viskozity atd.
X.2 DATA A ZPRÁVY
X.2.1 Data
Pokud jde o podrobná kritéria hodnocení a o požadavky týkající se registrace a zpracování dat, měla by být použita norma DIN (1).
Pro každý vzorek musí být provedeny dva nezávislé experimenty. Analýzy musí být provedeny samostatně. Ve všech případech je důležité stanovit také data ze slepých pokusů zpracovaných za stejných podmínek jako vzorek.
Je nezbytné výslovně uvést, že naměřené hodnoty jsou relativními hodnotami odpovídajícími molekulové hmotnosti použitého standardu.
Po stanovení retenčních objemů nebo retenčních časů (případně korigovaných za použití vnitřního standardu) se proti těmto veličinám vynesou do grafu hodnoty log M
p
(přičemž M
p
je výška maxima píku kalibračního standardu). Na jednu dekádu hodnot molekulární hmotnosti jsou nezbytné alespoň dva kalibrační body a pro celou křivku, která by měla pokrýt odhadovanou molekulovou hmotnost vzorku, se požaduje alespoň pět naměřených bodů. Poslední bod kalibrační křivky na straně nízkých molekulových hmotností se definuje n­hexylbenzenem nebo jiným vhodným nepolárním rozpouštědlem. Při stanovení se část křivky odpovídající molekulovým hmotnostem nižším než 1 000 podle potřeby koriguje na nečistoty a přísady. Eluční křivky se obvykle hodnotí pomocí elektronického zpracování dat. V případě manuálního hodnocení lze použít metodu ASTM D 3536­91 (3).
Jestliže je v koloně zachycen nerozpustný polymer, je jeho molekulová hmotnost pravděpodobně vyšší než molekulová hmotnost rozpuštěné frakce a pokud by to nebylo zohledněno, vedlo by to k nadhodnocení obsahu molekul o nízké hmotnosti. Návod na korigování obsahu molekul o nízké hmotnosti na obsah nerozpuštěného polymeru je uveden v příloze. Distribuční křivka musí být vyvedena ve formě tabulky nebo graficky (diferenciální četnost nebo kumulativní četnost v procentech proti log M).
V případě grafické prezentace by měla mít jedna dekáda molekulární hmotnosti délku 4 cm a výška maxima píku by měla být asi 8 cm. V případě integrálních distribučních křivek by měla být vzdálenost mezi 0 a 100 % na ordinátě přibližně 10 cm.
X.2.2 Protokol o zkoušce
Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:
X.2.2.1 Zkušební látka
— dostupné informace o zkušební látce (identita, přísady, nečistoty),
— popis zpracování vzorku, pozorované skutečnosti, problémy.
X.2.2.2 Vybavení
— zásobník elučního činidla, inertní plyn, odstranění plynu z elučního činidla, složení elučního činidla, nečistoty,
— čerpadlo, tlumič rázů, vstřikovací systém,
— separační kolony (výrobce, všechny informace o charakteristikách kolon, jako jsou velikost pórů, druh separačního materiálu atd., počet, délka a pořadí použitých kolon),
— počet teoretických pater kolony (nebo kombinace kolon), separační účinnost (rozlišení systému),
— informace o symetrii píků,
— teplota kolony, způsob kontroly teploty,
— detektor (princip měření, typ, objem kyvety),
— průtokoměr, je­li použit (výrobce, princip měření),
— systém pro zaznamenávání a zpracování dat (hardware a software).
X.2.2.3 Kalibrace systému
— podrobný popis metody použité pro sestrojení kalibrační křivky,
— informace o kritériích kvality této metody (např. korelační koeficient, chyba součtu čtverců atd.),
— informace o všech extrapolacích, předpokladech a aproximacích provedených během experimentálního postupu a při hodnocení a zpracování dat,
— všechny naměřené hodnoty použité při konstrukci kalibrační křivky musí být dokumentovány v tabulce, která musí pro každý kalibrační bod obsahovat následující informace:
— název vzorku,
— výrobce vzorku,
— charakteristické hodnoty standardů M
p
, M
n
, M
w
a M
w
/M
n
, jak jsou poskytnuty výrobcem nebo jak jsou zjištěny z následných měření, společně s podrobnostmi o metodě stanovení,
— vstříknutý objem a vstříknutá koncentrace,
— hodnota M
p
použitá po kalibraci,
— eluční objem nebo korigovaný retenční čas měřený v maximu píku,
— hodnota M
p
vypočtená pro maximum píku,
— chyba vypočtené hodnoty M
p
a kalibrační hodnoty M
p
vyjádřená v procentech.
X.2.2.4 Informace o obsahu podílu s nízkou molekulovou hmotností v polymeru
— popis metod použitých v analýze a způsobu, jakým byly experimenty provedeny,
— informace o obsahu podílu s nízkou molekulovou hmotností vyjádřeném v procentech celkového vzorku (m/m),
— informace o nečistotách, přísadách a jiných nepolymerních podílech vyjádřených v procentech celkového vzorku (m/m).
X.2.2.5 Hodnocení
— hodnocení na základě časové závislosti: metody použité pro zajištění požadované reprodukovatelnosti (metoda korekce, vnitřní standard atd.),
— informace o tom, zda hodnocení bylo provedeno na základě elučního objemu nebo retenčního času,
— informace o omezeních hodnocení v případě, že pík nebyl kompletně analyzován,
— popis metody hlazení, bylo­li použito,
— příprava a postupy předběžné úpravy vzorku,
— popřípadě přítomnost nerozpuštěných částic,
— vstříknutý objem (µl) a vstříknutá koncentrace (mg/ml),
— pozorované skutečnosti, které vedou k odchylkám od ideálních charakteristik metody GPC,
— podrobný popis všech změn zkušebních postupů,
— podrobnosti o rozsahu chyb,
— jakékoliv další informace a pozorování relevantní pro interpretaci výsledků.
X.3 LITERATURA
(1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.
(2) Yau, W. W., Kirkland, J. J., Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.
(3) ASTM D 3536­91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography­GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
(4) ASTM D 5296­92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size­Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
PŘÍLOHA
Návod na korigování obsahu molekul o nízké hmotnosti na obsah nerozpuštěného polymeru
Je­li ve vzorku přítomen nerozpuštěný polymer, vede to ke ztrátě hmotnosti během analýzy GPC. Nerozpuštěné polymery jsou nevratně zachyceny v koloně nebo na filtru při filtrování vzorku, zatímco rozpustný podíl vzorku kolonou projde. V případě, že lze odhadnout nebo změřit přírůstek indexu lomu (dn/dc) polymeru, lze odhadnou ztrátu hmotnosti vzorku na koloně. V takovém případě se korekce provede pomocí externí kalibrace standardním materiálem o známé koncentraci a známé hodnotě dn/dc, čímž se provede kalibrace refraktometru. V příkladě uvedeném dále je jako standard použit polymethylmethakrylát (pMMA).
Při externí kalibraci pro analýzu polyakrylátů se analyzuje metodou GPC standard pMMA známé koncentrace v tetrahydrofuranu a výsledná data se použijí pro nalezení konstanty refraktometru podle rovnice:

                  K = R/(C × V × dn/dc)

kde
K      je konstanta refraktometru (µVs/ml),
R      je odečet pro standard pMMA (µVs),
C      je koncentrace standardu pMMA (mg/ml),
V      je nastříknutý objem (ml) a
dn/dc  je přírůstek indexu lomu pro pMMA
       v tetrahydrofuranu (ml/mg).

Pro standard pMMA jsou typická následující data:

R        = 2 937 891
C        = 1,07 mg/ml
V        = 0,1 ml
dn/dc    = 9×10
-5
ml/mg.
Výsledná hodnota K, 3,05×10
11
se =poté použije pro výpočet teoretické odezvy detektoru v případě, že detektorem prošlo 100 % vstřiknutého polymeru.
XI. METODA PRO STANOVENÍ CHOVÁNÍ POLYMERŮ PŘI ROZPOUŠTĚNÍ / EXTRAKCI VE VODĚ – METODA A.20 PODLE PŘÍLOHY SMĚRNICE 98/73/ES
XI.1. METODA
Popsaná metoda je replikou revidované verze metody OECD TG 120 (1997). Další technické informace jsou uvedeny v odkaze (1).
XI.1.1 Úvod
V případě určitých polymerů, např. emulzních polymerů, může být před použitím dále popsané metody nezbytná předběžná úprava. Tato metoda není použitelná pro kapalné polymery a pro polymery, které za zkušebních podmínek reagují s vodou.
Není­li metoda použitelná nebo proveditelná, je možné zkoumat chování polymerů při rozpouštění a extrakci jinými metodami. V takových případech by měly být uvedeny všechny podrobnosti použité metody a její zdůvodnění.
XI.1.2 Referenční látky
Nejsou.
XI.1.3 Princip zkušební metody
Chování polymerů při rozpouštění/extrakci ve vodném prostředí se zjišťuje baňkovou metodou (viz A.6, rozpustnost ve vodě, baňková metoda) s úpravou uvedeno dále.
XI.1.4 Kritéria kvality
Nejsou.
XI.1.5 Popis zkušební metody
XI.1.5.1 Zařízení
Pro provedení metody je nezbytné následující zařízení:
— drticí zařízení, např. mlýnek pro přípravu částic o známé velikosti,
— třepačka s možností kontroly teploty,
— membránový filtrační systém,
— vhodné analytické vybavení,
— normalizovaná síta.
XI.1.5.2 Příprava vzorku
Reprezentativní vzorek musí být nejdříve omezen za použití vhodného síta na velikost částic 0,125 až 0,25 mm. Kvůli stálosti vzorku nebo kvůli procesu drcení může být nezbytné chlazení. Gumovité materiály mohou být drceny při teplotě kapalného dusíku (1).
Nelze­li požadované velikosti částic dosáhnout, mělo by se postupovat tak, aby byla velikost částic zmenšena co nejvíce, a výsledky by měly být uvedeny. Ve zprávě je nezbytné uvést, jak byl nadrcený vzorek uchován do provedení zkoušky.
XI.1.5.3 Postup
Do každé ze tří nádob opatřených skleněnými zátkami se naváží po 10 gramech zkušební látky a přidá se po 1 000 ml vody. Ukáže­li se zpracování 10 g polymeru neschůdným, mělo by být použito nejbližší vyšší množství, které lze zpracovat, a objem vody by měl být odpovídajícím způsobem upraven. Nádoby se těsně zazátkují a poté se třepou při 20 st.C. Měly by být použita třepačka nebo míchačka schopná pracovat při konstantní teplotě. Po 24 hodinách se obsah každé nádoby odstředí nebo zfiltruje a v čiré vodné fázi se vhodnou analytickou metodou stanoví koncentrace polymeru. Nejsou­li k dispozici vhodné analytické metody pro vodnou fázi, lze celkovou rozpustnost/extrahovatelnost zhodnotit z hmotnosti suchého zbytku na filtru nebo ze usazeniny po odstředění.
Obvykle je nezbytné kvantitativně rozlišit nečistoty a přísady na jedné straně, a podíl o nízké molekulové hmotnosti na druhé straně. V případě vážkového stanovení je také důležité provést slepý pokus bez použití zkušební látky, s cílem zohlednit zbytky pocházející z experimentálního postupu.
Chování při rozpouštění/extrakci polymerů ve vodě při 37 st.C a pH 2 a 9 může být stanoveno způsobem popsaným v případě provádění experimentu při 20 st.C. Hodnot pH lze dosáhnout přidáním buď vhodných tlumivých roztoků, nebo vhodných kyselin nebo zásad, např. kyseliny chlorovodíkové, kyseliny octové, hydroxidu sodného nebo draselného analytické čistoty nebo NH
3
.
V závislosti na použité metodě by měla být provedena jedna nebo dvě zkoušky. jsou­li k dispozici dostatečně specifické metody pro přímou analýzu vodné fáze na obsah polymeru, měla by stačit jedna zkouška, jak je uvedena výše. Nejsou­li však takové metody k dispozici a zjištění chování polymeru při rozpouštění/extrakci je omezeno na přímou analýzu stanovením celkového obsahu organického uhlíku (TOC) ve vodném extraktu, měla by být provedena dodatečná zkouška. Zkouška by měla být rovněž provedena třikrát, přičemž se použije 10krát menší množství vzorků polymeru a stejné množství vody jako v první zkoušce.
XI.1.5.4 Analýza
XI.1.5.4.1 Zkouška s jednou velikostí vzorku
Je možné, že jsou k dispozici metody pro přímou analýzu složek polymeru ve vodné fázi. V opačném případě lze také zvážit nepřímou analýzu rozpuštěných/extrahovaných složek polymeru stanovením celkového obsahu rozpustných složek a provedením korekce na obsah složek, které nejsou specifické pro polymer.
Analýza vodné fáze na obsah celkového polymerního podílu je možná buď dostatečně citlivou metodou, např.
— stanovením celkového obsahu organického uhlíku (TOC) rozkladem peroxodisíranem nebo dichromanem za účelem uvolnění CO
2
a následnou IR analýzou nebo chemickou analýzou,
— atomovou absorpční spektrometrií (AAS) nebo jejím protějškem spektrometrií s indukčně vázanou plazmou (ICP) v případě silikonu nebo polymerů obsahujících kov,
— UV absorpcí nebo spektrofluorimetrií v případě arylových polymerů,
— kapalinovou chromatografií s hmotovým spektrometrem (LC­MS) v případě vzorků s nízkou molekulovou hmotností,
nebo vakuovým odpařením vodného extraktu do sucha a spektroskopickou (IR nebo UV atd.) nebo AAS/ICP analýzou zbytku.
Není­li analýza vodné fáze jako takové možná, měl by být vodný extrakt extrahován s vodou nemísitelným organickým rozpouštědlem, např. chlorovaným uhlovodíkem. Rozpouštědlo se poté odpaří a zbytek se analyzuje způsobem popsaným výše pro obsah polymeru. Jakékoliv složky, které jsou identifikovány jako nečistoty nebo přísady se odečtou, aby byl stanoven stupeň rozpustnosti samotného polymeru.
Jsou­li přítomny relativně velká množství takových materiálů, může být nezbytné analyzovat zbytek například HPLC nebo GC, aby se odlišily nečistoty od přítomného monomeru nebo derivátů monomeru a aby tak mohl být stanoven skutečný obsah monomeru nebo jeho derivátů.
V některých případech může být dostačující pouhé odpaření organického rozpouštědla do sucha a zvážení suchého zbytku.
XI.1.5.4.2 Zkouška se dvěma různými velikostmi vzorku
Všechny vodné extrakty se analyzují na celkový obsah organického uhlíku.
Provede se vážkové stanovení nerozpuštěného/neextrahovaného podílu vzorku. Zůstávají­li po odstředění nebo filtraci obsahu každé nádoby usazeny na stěnách nádoby zbytky polymeru, měla by být nádoba oplachována filtrátem, dokud není vyčištěna od všech viditelných zbytků. Poté se filtrát opět odstředí nebo zfiltruje. Zbytky, které zůstanou na filtru nebo v centrifugační kyvetě se vysuší za vakua při 40 st.C a zváží. Sušení se provádí do konstantní hmotnosti.
XI.2 DATA
XI.2.1 Zkouška s jednou velikostí vzorku
Po každou ze tří baněk by měly být uvedeny jednotlivé výsledky a průměrné hodnoty vyjádřené v jednotkách hmotnosti vztažené na objem roztoku (obvykle mg/l) nebo v jednotkách hmotnosti vztažené na hmotnost vzorku polymeru (obvykle mg/g). Kromě toho by měla být uvedena ztráta hmotnosti vzorku (vypočtená jako hmotnost rozpuštěné látky dělená hmotností výchozího vzorku). Měly by být vypočteny relativní směrodatné odchylky (RSD). Měla by být uvedena jednotlivá čísla pro celkovou látku (polymer + hlavní přísady atd.) a pro samotný polymer (tj. po odečtení příspěvku od těchto přísad).
XI.2.2 Zkouška se dvěma různými velikostmi vzorku
Pro každý experiment by měly být uvedeny jednotlivé hodnoty TOC ve vodných extraktech obou trojitých experimentů a průměrné hodnoty vyjádřené v jednotkách hmotnosti vztažené na objem roztoku (obvykle mg C/l) a rovněž v jednotkách hmotnosti vztažené na hmotnost výchozího vzorku (obvykle mg C/g).
Není­li mezi výsledky pro vysoké a nízké poměry vzorek/voda rozdíl, může to znamenat, že všechny extrahovatelné složky byly skutečně vyextrahovány. V takovém případě nebývá přímá analýza obvykle nezbytná.
Měly by být uvedeny jednotlivé hmotnosti zbytků vyjádřené v procentech výchozích hmotností vzorků. Měly by být vypočteny průměrné hodnoty za celý experiment Rozdíly mezi 100 % a zjištěnými hodnotami v procentech představují množství rozpustného a extrahovatelného materiálu v původním vzorku vyjádřené v procentech.
XI.3 ZPRÁVY
XI.3.1 Protokol o zkoušce
Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:
XI.3.1.1 Zkušební látka
— dostupné informace o zkušební látce (identita, přísady, nečistoty, obsah podílu o nízké molekulové hmotnosti).
XI.3.1.2 Experimentální podmínky
— popis použitých postupů a experimentálních podmínek,
— popis analytických a detekčních metod.
XI.3.1.3 Výsledky
— výsledky rozpustnosti/extrahovatelnosti v mg/l; jednotlivé a střední hodnoty pro extrakční zkoušky v různých rozpouštědlech, rozepsané podle obsahu polymeru, nečistot, přísad atd.,
— výsledky rozpustnosti/extrahovatelnosti v mg/g polymeru,
— hodnoty TOC ve vodných extraktech, hmotnost rozpuštěné látky a vypočtené procentuální hodnoty (byla­li stanovena),
— hodnota pH každého vzorku,
— informace o hodnotách pro slepý pokus,
— podle potřeby upozornění na chemickou nestabilitu zkušební látky během zkušebních postupů a analytických postupů,
— všechny informace, které jsou důležité pro interpretaci výsledků.
XI.4 LITERATURA
(1) DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke.
 
Příl.2
METODY PRO ZKOUŠENÍ VLASTNOSTÍ NEBEZPEČNÝCH PRO ŽIVOTNÍ PROSTŘEDÍ
I. METODA PRO STANOVENí AKUTNÍ TOXICITY PRO RYBY – metoda c.1 podle přílohy směrnice komise 92/69/EHS ze dne 31. července 1992, kterou se po sedmnácté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování správních a právních púředpúsů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (dále jen „směrnice 92/69/EHS“)
I.1. METODA
I.1.1 ÚVOD
Účelem této zkoušky je stanovit akutní letální toxicitu látek pro sladkovodní ryby. Pro usnadnění výběru nejvhodnější zkušební metody (statické, semistatické nebo průtokové) s cílem zajistit dostatečně konstantní koncentrace zkušební látky po celou dobu experimentu je žádoucí mít pokud možno k dispozici údaje o rozpustnosti látky ve vodě, o tenzi par, chemické stabilitě, disociačních konstantách a o biologické rozložitelnosti látky.
Další informace (např. strukturní vzorec, stupeň čistoty, povaha a podíl významných nečistot v procentech, přítomnost a množství přísad a rozdělovací koeficient n­oktanol/voda) je třeba vzít v úvahu při plánování zkoušky i při interpretaci výsledků.
I.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
Akutní toxicitou se rozumí zřetelný nepříznivý účinek, který je v krátké době (řádově ve dnech) v organismu vyvolán expozicí látce. V této zkoušce se akutní toxicita vyjadřuje prostřednictvím střední letální koncentrace (LC
50
), tj. takové koncentrace látky ve vodě, která během nepřetržité expozice po určitou dobu způsobí úhyn 50 % jedinců ve zkušební skupině ryb.
Všechny koncentrace zkušební látky se udávají v hmotnosti na jednotku objemu (mg·l
­1
). Mohou se také vyjádřit v hmotnostních podílech (mg*kg
­1
).
I.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Zkoušky s referenčními látkami mohou být provedeny s cílem prokázat, že se reakce zkušebních druhů za laboratorních zkušebních podmínek podstatně nezměnila.
Referenční látky nejsou pro tuto zkoušku stanoveny.
I.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l
­1
, s cílem prokázat, že LC
50
je vyšší než tato koncentrace.
Ryby se vystaví účinku různým koncentracím zkušební látky přidané do vody po dobu 96 h. Úhyn se zaznamenává nejméně každých 24 h a je-li to možné, vypočtou se při každém pozorování koncentrace, které způsobí úhyn 50 % ryb (LC
50
).
I.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI
Kritéria jakosti se vztahují jak na limitní zkoušku, tak na úplný zkušební postup.
Mortalita v kontrolních skupinách nesmí být na konci zkoušky větší než 10 % (nebo jednu rybu, pokud se použije méně než deset ryb).
Koncentrace rozpuštěného kyslíku musí být po celou dobu zkoušky vyšší než 60 % hodnoty nasycení vzduchem.
Koncentrace zkušební látky nesmí po celou zkoušky klesnout pod 80 % původních hodnot koncentrací. U látek, které se ve zkušebním médiu lehce rozpouštějí a dávají stabilní roztoky, tj. v podstatné míře netěkají, nerozkládají se, nehydrolyzují nebo se neadsorbují, lze počáteční koncentraci pokládat za ekvivalentní s nominální koncentrací. Musí být potvrzeno, že byly koncentrace po celou zkoušku udrženy a že kritéria jakosti byla dodržena.
U látek, které
i) jsou ve zkušebním médiu špatně rozpustné, nebo
ii) mohou vytvářet stabilní emulze nebo disperse, nebo
iii) jsou ve vodných roztocích nestabilní,
musí být počáteční koncentrace brána jako koncentrace naměřená v roztoku (nebo, není­li to technicky možné, ve vodním sloupci) na začátku zkoušky. Koncentrace se stanoví po určité době jejího ustálení, avšak před nasazením testovacích ryb.
Ve všech uvedených případech musí být během zkoušky provedena další měření s cílem potvrdit skutečné expoziční koncentrace nebo dodržení kritérií jakosti.
pH by se nemá změnit o více než 1.
I.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
Mohou být použity tři postupy:
Statická zkouška:
Zkouška, při níž zkušební roztok neprotéká. (Roztoky se během celé zkoušky nemění.)
Semistatická metoda:
Zkouška, při níž zkušební roztok neprotéká, ale je pravidelně po delších časových úsecích (např. po 24 h) zcela vyměňován.
Průtoková metoda:
Zkouška toxicity, při níž se voda ve zkušebních nádržích neustále obměňuje, přičemž se zkušební látka přivádí s vodou, kterou se zkušební médium obnovuje.
I.1.6.1 Činidla
I.1.6.1.1 Roztoky zkušebních látek
Zásobní roztoky o požadované koncentraci se připraví rozpuštěním látky v deionizované vodě nebo ve vodě podle bodu 1.6.1.2. Zvolené zkušební koncentrace se připraví ředěním zásobního roztoku. Jsou­li zkoušeny vysoké koncentrace látky, lze látku rozpustit přímo v ředicí vodě.
Látky se obvykle zkouší až do meze jejich rozpustnosti. U některých látek (např. u látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo vysokou hodnotou P
o/v
, nebo u látek, které ve vodě vytvářejí spíše stabilní disperse než pravé roztoky) je možné provést zkoušku při koncentraci vyšší, než je mez rozpustnosti, aby bylo zajištěno, že je dosaženo maximální koncentrace odpovídající maximální rozpustnosti/stabilitě. Je ovšem nutné, aby tato koncentrace jinak nenarušovala zkušební systém (např. vytvořením filmu na hladině bránícímu okysličení vody atd.). Pro přípravu zásobních roztoků látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo pro usnadnění rozptýlení látky ve zkušebním médiu lze použít ultrazvukovou dispergaci, organická rozpouštědla či emulgátory nebo dispergátory. Použijí­li se takové pomocné látky, měly by všechny zkušební koncentrace obsahovat stejné množství těchto pomocných látek a stejné koncentraci pomocné látky jako ve zkušebních sériích by měly být exponovány další kontrolní ryby. Koncentrace pomocných látek by měla být minimální a v žádném případě by neměla překročit 100 mg na l zkušebního média.
Zkouška se provede bez úpravy pH. Existují­li známky toho, že dochází k výrazné změně pH, doporučuje se zkoušku opakovat s úpravou pH a výsledky zaznamenat. V takovém případě se upraví pH zásobního roztoku na pH vody k ředění, pokud proti tomu neexistuji specifické důvody. Při úpravě pH se dává přednost HCl a NaOH. Úprava pH se provede tak, aby nebyla koncentrace zkušební látky v zásobním roztoku v podstatné míře změněna. Dojde­li úpravou ve zkušebním médiu k chemické reakci nebo ke srážení, skutečnosti se zaznamenají.
I.1.6.1.2 Voda pro chov ryb a ředění
Může být použita pitná voda (nekontaminovaná potenciálně škodlivými koncentracemi chloru, těžkých kovů nebo jiných látek), kvalitní přírodní voda nebo upravená voda (viz doplněk 1). Upřednostňuje se voda o celkové tvrdosti od 10 do 250 mg·l
-1
(vztaženo na CaCO
3
) a pH od 6,0 do 8,5.
I.1.6.2 Přístroje
Veškeré přístroje musí být vyrobeny z chemicky inertního materiálu:
— systém pro automatické ředění (pro průtokovou metodu),
— přístroj pro měření koncentrace kyslíku,
— vybavení pro stanovení tvrdosti vody,
— vhodný přístroj pro měření teploty,
— pH­metr.
I.1.6.3 Testovací ryby
Ryby by měly být zdravé a bez zjevných malformací.
Použitý druh by měl být zvolen podle praktických kritérií, jako je jejich dostupnost po celý rok, snadný chov, vhodnost pro zkoušení, relativní citlivost k chemickým látkám a jakékoli další významné ekonomické a biologické faktory. Při výběru druhu ryb by měla být také zohledněna potřeba srovnatelnosti získaných dat a mezinárodní harmonizace (1).
Seznam doporučených druhů ryb pro provedení této zkoušky je uveden v doplňku 2; dává se přednost druhům danio pruhované a pstruh duhový.
I.1.6.3.1 Chov
Ryby by měly pocházet pokud možno z jednoho chovu a měly by být stejné délky a stejného stáří. Ryby musí být chovány nejméně 12 dní v následujících podmínkách:
Obsádka:
Vhodná vzhledem k metodě (metoda s recirkulací nebo průtoková metoda) a druhu ryb.
Voda:
Viz 1.6.1.2.
Osvětlení:
Osvětlení 12 až 16 h denně.
Koncentrace rozpuštěného kyslíku:
Nejméně 80 % hodnoty nasycení vzdušným kyslíkem.
Krmení:
Třikrát týdně nebo jednou za den; vysazení krmení 24 h před začátkem zkoušky.
I.1.6.3.2 Mortalita
Po 48hodinové aklimatizaci se zaznamená mortalita a použijí se následující kritéria:
— mortalita vyšší než 10 % populace za 7 dní: celá obsádka ryb se vyřadí,
— mortalita 5 až 10 % populace: v chovu se pokračuje dalších 7 dní. Nedojde­li k dalším případům úhynu, obsádka se použije, v opačném případě musí být vyřazena,
— mortalita menší než 5 % populace: obsádka je pro zkoušku použitelná.
I.1.6.4 Aklimatizace
Všechny ryby musí být nejméně na 7 dnů před použitím ve zkoušce nasazeny do vody stejné kvality a stejné teploty, jaká se použije při zkoušce.
I.1.6.5 Zkušební postup
Před vlastní zkouškou může být provedena předběžná zkouška s cílem získat informace o rozsahu koncentrací, které mají být použity v hlavní zkoušce.
Kromě sérií zkoušek se provede kontrolní zkouška bez zkušební látky a podle potřeby kontrolní zkouška s pomocnou látkou.
V závislosti na fyzikálních a chemických vlastnostech zkušební látky se zvolí statická, semistatická nebo průtoková zkouška, aby byla splněna kritéria jakosti.
Ryby se exponují zkušební látce za níže uvedených podmínek:
— délka expozice: 96 h;
— počet ryb: nejméně 7 na každou koncentraci;
— nádrže: vhodný objem vzhledem k doporučené obsádce;
— obsádka: pro statickou a semistatickou zkoušku se doporučuje 1,0 g na litr; v průtokovém systému je přijatelná vyšší obsádka;
— zkušební koncentrace: nejméně pět koncentrací, které jsou odstupňovány faktorem nepřevyšujícím 2,2 a které pokrývají rozsah mortality od 0 % do 100 %;
— voda: viz 1.6.1.2;
— osvětlení: osvětlení 12 až 16 h denně;
— teplota: podle druhu ryb (doplněk 2), avšak v rámci dané zkoušky kolísající v toleranci +/-1 st.C;
— koncentrace rozpuštěného kyslíku: ne nižší než 60 % hodnoty nasycení vzdušným kyslíkem při dané teplotě;
— krmení: žádné.
Ryby se kontrolují po prvních 2 až 4 h a dále nejméně každých 24 h. Ryby se považují za mrtvé, jestliže při dotyku ocasní ploutve nedochází k žádné reakci a nejsou-li patrné žádné dýchací pohyby. Mrtvé ryby se odstraní, jakmile jsou zpozorovány, a úhyn se zaznamená.
Zaznamenají se všechny zjevné abnormality (např. ztráta rovnováhy, změny v plavání, chování, v dýchací funkci, v pigmentaci atd.).
Měření pH, obsahu rozpuštěného kyslíku a teploty se provádí denně.
Limitní zkouška
S využitím postupů popsaných v této metodě může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l
­1
s cílem prokázat, že LC
50
je vyšší než tato koncentrace.
Je­li povaha zkušební látky taková, že ve vodě nelze dosáhnout koncentrace 100 mg·l
-1
, provede se limitní zkouška při koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky v použitém médiu (nebo při maximální koncentraci, kdy látka vytváří stabilní disperzi) (viz také bod 1.6.1.1).
Limitní zkouška se provede se 7 až 10 rybami a se stejným počtem ryb v kontrole (kontrolách). (Podle teorie binomického rozdělení je při použití 10 ryb a při nulové mortalitě 99,9% pravděpodobnost, že je LC
50
větší než 100 mg*l
­1
. Při 7, 8 nebo 9 rybách znamená nulová mortalita nejméně 99% pravděpodobnost, že je LC
50
větší než koncentrace použitá v limitní zkoušce.)
Dojde­li k úhynům, musí se provést celá studie. Jsou-li pozorovány subletální účinky, zaznamenají se.
I.2 DATA A HODNOCENÍ
Na pravděpodobnostní logaritmický papír se pro každé období, kdy byla prováděna pozorování (24, 48, 72 a 96 h), vynese pro každou expoziční dobu mortalita v procentech proti koncentraci.
Pokud je to možné, odhadnou se standardními postupy pro každou délku expozice hodnoty LC
50
a meze spolehlivosti (p = 0,05); tyto hodnoty se zaokrouhlí na jednu, nebo nejvýše na dvě platné číslice (příklad zaokrouhlení na dvě platné číslice: 173,5 se zaokrouhlí na 170, 0,127 na 0,13, 1,21 na 1,2).
V případech, kdy je sklon křivky závislosti mortality v procentech na koncentraci látky příliš strmý, aby umožnil výpočet hodnoty LC
50
, postačuje grafický odhad této hodnoty. Jestliže dvě po sobě jdoucí koncentrace lišící se faktorem 2,2 vyvolají mortalitu 0 a 100 %, jsou dostatečnou informací o tom, že se LC
50
nachází mezi těmito hodnotami.
Zjistí­li se, že není možné udržet stabilitu nebo homogenitu zkušební látky, uvede se to ve zprávě a výsledky se interpretují s opatrností.
I.3 ZPRÁVY
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:
— údaje o testovacích rybách (vědecký název, kmen, dodavatel, veškerá předchozí ošetření, velikost a počet ryb použitých při každé zkušební koncentraci);
— zdroj ředicí vody a hlavní chemické charakteristiky (pH, tvrdost, teplota);
— u látek s malou rozpustností ve vodě údaj o metodě přípravy zásobních a zkušebních roztoků;
— koncentrace všech pomocných látek;
— přehled použitých koncentrací a veškeré dostupné informace o stabilitě zkušební látky ve zkušebním roztoku při použitých koncentracích;
— jestliže byly provedeny chemické analýzy, údaje o použitých metodách a získané výsledky;
— výsledek limitní zkoušky, pokud byla provedena;
— důvody pro volbu použitého zkušebního postupu a podrobnosti o něm (např. statický, semistatický, dávkování, průtoková rychlost, zda byla voda provzdušňována obsádka ryb atd.);
— popis zkušebního zařízení;
— světelný režim;
— koncentrace rozpuštěného kyslíku, hodnoty pH, teplota zkušebních roztoků každých 24 h;
— důkaz, že byla splněna kritéria jakosti;
— tabulka kumulativních hodnot mortality při každé koncentraci a při kontrolní zkoušce (a popřípadě při kontrolní zkoušce s pomocnou látkou) při každé z doporučených dob pozorování;
— graf křivky závislosti účinku, vyjádřeného v procentech, na koncentraci na konci zkoušky;
— podle možnosti hodnoty LC
50
při každé z doporučených dob pozorování (při 95% intervalu spolehlivosti);
— použité statistické metody stanovení hodnot LC
50
;
— při použití referenční látky a údaj o získaných výsledcích;
— nejvyšší zkušební koncentrace, která nevyvolala za dobu zkoušky úhyn ryb;
— nejnižší zkušební koncentrace, která vyvolala za dobu zkoušky 100 % mortalitu.
I.4 LITERATURA
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the Council C(81) 30 final and updates.
(2) AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to Brachydanio rerio – Static and Flow Through methods –NFT 90­303, June 1985.
(3) AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to Salmo gairdneri – Static and Flow­Through methods – NFT 90­305, June 1985.
(4) ISO 7346/1, /2, /3 – Water Quality – Determination of the acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan – Teleostei, Cyprinidae). Part 1: Static method. Part : Semi-static method. Part 3: Flow­through method.
(5) Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien für Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmethoden – Part II 1974.
(6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) und L (15).
(7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.
(8) NEN 6506 – Water – Bepaling van de akute toxiciteit met behulp van Poecilia reticulata, 1980.
(9) Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxicity tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Organisms, Ecological Research Series EPA­660­75­009, 1975.
(10) Environmental Protection Agency, Environmental monitoring and support laboratory, Office of Research and Development, EPA­600/4­78­012, January 1978.
(11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, Part IV, 16 March 1979.
(12) Standard methods for the examination of water and wastewater, 14th ed., APHA­AWWA­WPCF, 1975.
(13) Commission of the European Communities, Inter­laboratory test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. EEC Study D.8368, 22 March 1979.
(14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Fisch-Test. Rudolph, P., Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen für die ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.
(15) Litchfield, J. T., Wilcoxon, F. A simplified method for evaluating dose effects experiments. J. Pharm, Exp. Therap., 1949, 96, 99.
(16) Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U.K., 1978.
(17) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, 3, 793- 821.
(18) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, 4, 3-32.
(19) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC
50
. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (F. I. Mayer, J. L. Hamelink (eds.)). American Society for Testing and Materials, ASTM STP 634, 1977, 65-84.
(20) Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J., Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC
50
. US EPA.
DODATEK 1
Upravená voda
Příklad vhodné ředicí vody
Všechny chemikálie musí být čistoty p.a.
Voda musí být kvalitní destilovaná nebo deionizovaná s vodivostí menší než 5 µS*cm
-1
.
Destilační přístroj nesmí obsahovat žádné měděné části.
Zásobní roztoky:
CaCl
2
*2H
2
O (chlorid vápenatý dihydrát) 11,76 g se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.
MgSO
4
*7H
2
O (síran hořečnatý heptahydrát) 4,93 g se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.
NaHCO
3
(hydrogenuhličitan sodný) 2,59 g se rozpustí ve vodě a doplní vodou na l litr.
KCl (chlorid draselný) 0,23 g se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.
Upravená ředicí voda
Smísí se po 25 ml všech čtyř zásobních roztoků a doplní vodou na 1 litr.
Provzdušňuje se, dokud koncentrace rozpuštěného kyslíku neodpovídá koncentraci nasycení vzdušným kyslíkem.
pH musí být 7,8 +/- 0,2.
Podle potřeby se pH upraví pomocí NaOH (hydroxid sodný) nebo HCl (kyselina chlorovodíková).
Tato ředicí voda se nechá 12 h stát a nesmí být dále provzdušňována.
Koncentrace úhrnu iontů Ca a Mg v tomto roztoku je 2,5 mmol*l
-1
. Poměr množství iontů Ca : Mg je 4 : 1 a poměr množství iontů Na : K je 10 : 1. Celková koncentrace alkalických kovů v tomto roztoku je 0,8 mmol*l
-1
.
Jakákoli odchylka v přípravě vody k ředění nesmí změnit složení ani vlastnosti vody.
DODATEK 2
Druhy ryb doporučené pro zkoušení
=================================================================== =============================
                  Doporučený druh                    Doporučený     Doporučená celková délka ryb
                                                    rozsah teplot               (cm)
                                                     při zkoušce
                                                        (st.C)
===================================================================         =============================
Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae)             20 až 24               3,0 +/- 0,5
(Hamilton - Buchanan), danio pruhované

Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae)           20 až 24               5,0 +/- 2,0
(Rafinesque), střevle

Cyprinus carpio (Teleostei Cyprinidae) (Linneanus     20 až 24               6,0 +/- 2,0
1758), kapr obecný

Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) (Tomminck    20 až 24               3,0 +/- 1,0
a Schlegel 1850), halančík japonský

Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae)          20 až 24               3,0 +/- 1,0
(Peters 1859), živorodka duhová

Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae)        20 až 24               5,0 +/- 2,0
(Rafinesque, Linneanus 1758), slunečnice modrá

Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae)          12 až 17               6,0 +/- 2,0
(Walbaum 1988), pstruh duhový

Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae) (Linneanus     20 až 24               6,0 +/- 2,0
1758), jelec jesen
=================================================================== =============================
Opatřování ryb
Ryby uvedené v seznamu se snadno chovají nebo jsou dobře dostupné po celý rok. Lze je množit a chovat buď v rybích farmách, nebo v laboratoři za kontrolovaných zdravotních a parazitologických podmínek tak, aby ryby byly zdravé a byly známého původu. Tyto ryby jsou dostupné v mnoha částech světa.
DODATEK 3
Příklad křivky závislosti úmrtnosti, vyjádřené v procentech, na koncentraci
Příklad stanovení LC
50
na pravděpodobnostním logaritmickém papíru



II. METODA PRO STANOVENÍ AKUTNÍ TOXICITY PRO DAFNIE – METODA C.2 PODLE PŘÍLOHY SMĚRNICE 92/69/EHS
II.1 METODA
II.1.1 ÚVOD
Účelem této zkoušky je stanovit střední účinnou koncentraci látky pro imobilizaci (EC
50
) dafnií ve sladkovodním prostředí. Před započetím zkoušky je žádoucí mít pokud možno k dispozici údaje o rozpustnosti látky ve vodě, o tenzi par, chemické stabilitě, disociačních konstantách a o biologické rozložitelnosti látky.
Další informace (např. strukturní vzorec, stupeň čistoty, povaha a podíl významných nečistot v procentech, přítomnost a množství přísad a rozdělovací koeficient n­oktanol/voda) je třeba vzít v úvahu při plánování zkoušky i při interpretaci výsledků.
II.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
Požadavek směrnice stanovit LC
50
pro dafnie se považuje za splněný stanovením EC
50
, jak je popsáno v této zkušební metodě.
Akutní toxicita se v této zkoušce vyjadřuje střední účinnou koncentrací látky pro imobilizaci (EC
50
) dafnií. Je to koncentrace (rozumí se výchozí koncentrace), která během nepřetržité expozice po určitou stanovenou dobu imobilizuje 50 % dafnií ve zkušební skupině během doby působení (doby expozice).
Imobilizace:
Dafnie, které nejsou schopné do 15 s po lehkém zatřepání zkušební nádrží začít plavat, se považují za imobilizované.
Všechny koncentrace zkušební látky se udávají v hmotnosti na jednotku objemu (mg·l
­1
). Mohou se také vyjádřit v hmotnostních podílech (mg*kg
­1
).
II.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Zkoušky s referenčními látkami mohou být provedeny s cílem prokázat, že se reakce zkušebních druhů za laboratorních zkušebních podmínek podstatně nezměnila.
Souhrn výsledků okružního testu laboratoří EHS s použitím čtyř různých látek je uveden v doplňku 2.
II.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l
­1
, s cílem prokázat, že EC
50
je vyšší než tato koncentrace.
Dafnie se 48 h exponují zkušební látce přidané v různých koncentracích do vody. Použije-li se kratší doba, zdůvodní se ve zprávě.
Za jinak stejných experimentálních podmínek a v přiměřeném rozmezí koncentrací zkušební látky působí různé koncentrace zkušební látky na schopnost plavání dafnií rozdílně. Různé koncentrace mají za následek skutečnost, že na konci zkoušky ztrácí různý procentuální podíl dafnií schopnost plavat. Koncentrace, které nezpůsobují žádnou imobilizaci nebo způsobují 100% imobilizaci, se zjistí přímo pozorováním, zatímco hodnota 48hodinová EC
50
se stanoví podle možnosti výpočtem.
Při této metodě se používá statický systém, zkušební roztoky se tedy během doby expozice neobnovují.
II.1.5. KRITÉRIA JAKOSTI
Kritéria jakosti se vztahují jak na limitní zkoušku, tak na úplný zkušební postup. Imobilizace v kontrolních zkouškách nesmí být na konci zkoušky větší než 10 %.
Dafnie se v kontrolních zkouškách nesmí trvale zdržovat u hladiny.
Koncentrace rozpuštěného kyslíku ve zkušební nádrži musí být po celou dobu zkoušky vyšší než 3 mg·l
­1
. Koncentrace kyslíku však nesmí v žádném případě klesnout pod 2 mg*l
­1
.
Koncentrace zkušební látky nesmí po celou zkoušky klesnout pod 80 % původní hodnoty koncentrace.
U látek, které se ve zkušebním médiu lehce rozpouštějí a dávají stabilní roztoky, tj. v podstatné míře netěkají, nerozkládají se, nehydrolyzují nebo se neadsorbují, lze počáteční koncentraci pokládat za ekvivalentní s nominální koncentrací. Musí být potvrzeno, že byly koncentrace po celou zkoušku udrženy a že kritéria jakosti byla dodržena.
U látek, které
i) jsou ve zkušebním médiu špatně rozpustné, nebo
ii) mohou vytvářet stabilní emulze nebo disperse, nebo
iii) jsou ve vodných roztocích nestabilní,
musí být počáteční koncentrace brána jako koncentrace naměřená v roztoku (nebo, není­li to technicky možné, ve vodním sloupci) na začátku zkoušky. Koncentrace se stanoví po určité době jejího ustálení, avšak před nasazením testovacích organismů.
Ve všech uvedených případech musí být během zkoušky provedena další měření s cílem potvrdit skutečné expoziční koncentrace nebo dodržení kritérií jakosti.
pH by se nemělo změnit o více než 1.
II.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
II.1.6.1 Činidla
II.1.6.1.1 Roztoky zkušebních látek
Zásobní roztoky o požadované koncentraci se připraví rozpuštěním látky v deionizované vodě nebo ve vodě podle bodu 1.6.1.2.
Zvolené zkušební koncentrace se připraví ředěním zásobního roztoku. Jsou­li zkoušeny vysoké koncentrace látky, lze látku rozpustit přímo v ředicí vodě.
Látky se obvykle zkoušejí až do meze jejich rozpustnosti. U některých látek (např. u látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo vysokou hodnotou P
o/v
, nebo u látek, které ve vodě vytvářejí spíše stabilní disperse než pravé roztoky) je možné provést zkoušku při koncentraci vyšší, než je mez rozpustnosti, aby bylo zajištěno, že je dosaženo maximální koncentrace odpovídající maximální rozpustnosti/stabilitě. Je ovšem nutné, aby tato koncentrace jinak nenarušovala zkušební systém (např. vytvořením filmu na hladině bránícímu okysličení vody atd.).
Pro přípravu zásobních roztoků látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo pro usnadnění rozptýlení látky ve zkušebním médiu lze použít ultrazvukovou dispergaci, organická rozpouštědla či emulgátory nebo dispergátory. Použijí­li se takové pomocné látky, měly by všechny zkušební koncentrace obsahovat stejné množství těchto pomocných látek a stejné koncentraci pomocné látky jako ve zkušebních sériích by měly být exponovány další kontrolní dafnie. Koncentrace pomocných látek by měly být minimální a v žádném případě by neměla překročit 100 mg/l zkušebního média.
Zkouška se provede bez úpravy pH. Existují­li známky toho, že dochází k výrazné změně pH, doporučuje se zkoušku opakovat s úpravou pH a výsledky zaznamenat. V takovém případě se upraví pH zásobního roztoku na pH vody k ředění, pokud proti tomu neexistuji specifické důvody. Při úpravě pH se dává přednost HCl a NaOH. Úprava pH se provede tak, aby nebyla koncentrace zkušební látky v zásobním roztoku v podstatné míře změněna. Dojde­li úpravou ve zkušebním médiu k chemické reakci nebo ke srážení, skutečnosti se zaznamenají ve zprávě.
II.1.6.1.2 Zkušební voda
Pro tuto zkoušku se použije upravená voda (viz doplněk 1 a odkaz (2): ISO 6341).
Aby nebylo nutné aklimatizovat dafnie před zkouškou, doporučuje se, aby byla voda pro kultivaci podobné jakosti (pH, tvrdost), jako voda pro zkoušku.
II.1.6.2 Přístroje
Použijí se běžné laboratorní přístroje a zařízení. Zařízení, které přijde do styku se zkušebními roztoky, by mělo být nejlépe skleněné:
— přístroj pro měření koncentrace kyslíku (s mikroelektrodou, nebo jiný vhodný přístroj na měření koncentrace rozpuštěného kyslíku ve vzorcích malého objemu),
— vhodný přístroj pro měření teploty,
— pH­metr,
— vybavení pro stanovení tvrdosti vody.
II.1.6.3 Testovací organismy
Přednost se dává druhu Daphnia magna, ačkoliv se připouští také druh Daphnia pulex. Testovací dafnie musí být na začátku zkoušky mladší než 24 h, musí být laboratorně odchované, bez zjevných nemocí a musí být známého původu (např. chov, předchozí ošetření, atd.).
II.1.6.4 Zkušební postup
Před vlastní zkouškou může být provedena předběžná zkouška s cílem získat informace o rozsahu koncentrací, které mají být použity v hlavní zkoušce.
Kromě sérií zkoušek se provede kontrolní zkouška bez zkušební látky a podle potřeby kontrolní zkouška s pomocnou látkou.
Dafnie se exponují zkušební látce následujícím způsobem:
— délka expozice: 48 h,
— počet dafnií: nejméně 20 na každou zkušební koncentraci, nejlépe rozdělených na čtyři skupiny po pěti dafniích nebo na dvě skupiny po 10 dafniích,
— obsádka: na každou dafnii by měly připadat 2 ml zkušebního roztoku,
— zkušební koncentrace: zkušební roztok se připraví bezprostředně před nasazením dafnií, nejlépe bez použití jiného rozpouštědla než vody. Připraví se koncentrace tvořící geometrickou řadu, přičemž poměr mezi koncentracemi nesmí být vyšší než 2,2. Zároveň s kontrolami se zkoušejí koncentrace dostatečné pro to, aby po 48 h vyvolaly nulovou nebo a 100% imobilizaci, a dále mezilehlé koncentrace umožňující výpočet 48hodinové EC
50
,
— voda: viz 1.6.1.2,
— osvětlení: střídání světla a tmy je libovolné,
— teplota: zkušební teplota by měla být 18 až 22 st.C, avšak v rámci dané zkoušky kolísající v tomto rozmezí maximálně o +/- 1 st.C,
— provzdušňování: zkušební roztok nesmí být provzdušňován probubláváním,
— krmení: žádné.
Měření pH a obsahu rozpuštěného kyslíku v kontrolních skupinách a u všech zkušebních koncentrací se provede na konci zkoušky; pH zkušebního roztoku nesmí být měněno.
Těkavé sloučeniny se zkoušejí v hermeticky uzavřených nádobách naplněných po okraj, dostatečně velkých, aby nedošlo k nedostatku kyslíku.
Prohlídka dafnií se provede nejpozději po 24 h a znovu po 48 h.
Limitní zkouška
S využitím postupů popsaných v této metodě může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l
­1
s cílem prokázat, že EC
50
je vyšší než tato koncentrace.
Je­li povaha zkušební látky taková, že ve vodě nelze dosáhnout koncentrace 100 mg·l
-1
, provede se limitní zkouška při koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky v použitém médiu (nebo při maximální koncentraci, kdy látka vytváří stabilní disperzi) (viz také bod 1.6.1.1).
Limitní zkouška se provede s 20 dafniemi rozdělenými do dvou nebo čtyř skupin a se stejným počtem v kontrolní skupině (v kontrolních skupinách). Dojde­li k imobilizaci, musí se provést celá studie.
II.2 DATA A HODNOCENÍ
Na pravděpodobnostní logaritmický papír se pro každé období, kdy byla prováděna pozorování (24 a 48 h), vynese mortalita v procentech proti koncentraci.
Pokud je to možné, odhadnou se pro každé pozorovací období EC
50
a meze spolehlivosti (p = 0,05); tyto hodnoty se zaokrouhlí na jednu, nebo nejvýše na dvě platné číslice (příklad zaokrouhlení na dvě platné číslice: 173,5 se zaokrouhlí na 170, 0,127 na 0,13, 1,21 na 1,2).
V případech, kdy je sklon křivky závislosti mortality v procentech na koncentraci látky příliš strmý, aby umožnil výpočet hodnoty EC
50
, postačuje grafický odhad této hodnoty. Jestliže dvě po sobě jdoucí koncentrace lišící se faktorem 2,2 vyvolají nulovou a 100% imobilizaci, jsou dostatečnou informací o rozpětí, ve kterém EC
50
leží.
Zjistí­li se, že není možné udržet stabilitu nebo homogenitu zkušební látky, uvede se to ve zprávě a výsledky se interpretují s opatrností.
II.3 ZPRÁVY
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:
— údaje o testovacím organismu (vědecký název, kmen, dodavatel nebo původ, veškerá předchozí ošetření, metoda chovu – včetně původu, druhu a množství potravy, frekvence krmení);
— zdroj ředicí vody a hlavní chemické charakteristiky (pH, teplota, tvrdost);
— u látek s malou rozpustností ve vodě údaj o metodě přípravy zásobních a zkušebních roztoků;
— koncentrace všech pomocných látek;
— přehled použitých koncentrací a veškeré dostupné informace o stabilitě zkušební látky ve zkušebním roztoku při použitých koncentracích;
— jestliže byly provedeny chemické analýzy, údaje o použitých metodách a získané výsledky;
— výsledek limitní zkoušky, pokud byla provedena;
— popis zkušebního zařízení;
— světelný režim;
— koncentrace rozpuštěného kyslíku, hodnoty pH, teplota zkušebních roztoků;
— důkaz, že byla splněna kritéria jakosti;
— tabulka kumulativních hodnot imobility při každé koncentraci a při kontrolní zkoušce (a popřípadě při kontrolní zkoušce s pomocnou látkou) při každé z doporučených dob pozorování (24 a 48 h);
— graf křivky závislosti účinku, vyjádřeného v procentech, na koncentraci na konci zkoušky;
— podle možnosti hodnoty EC
50
při každé z doporučených dob pozorování (při 95% intervalu spolehlivosti)
— použité statistické metody stanovení hodnot EC
50
;
— při použití referenční látky údaj o získaných výsledcích;
— nejvyšší zkušební koncentrace, která nevyvolala za dobu zkoušky imobilizaci;
— nejnižší zkušební koncentrace, která vyvolala za dobu zkoušky 100% imobilizaci.
II.4 LITERATURA
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guidelines 202, Decision of the Council C(81) 30 final and updates.
(2) International Standard ISO, Water Quality – Determination of inhibition of mobility of Daphnia magna Straus, ISO 6341-1989.
(3) AFNOR Inhibition of mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera – crustacea) NFT 90 301 (January 1983).
(4) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Daphnien-Test. Rudolph, P., Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen für die ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.
(5) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen 38412 (L1) und (L11).
(6) Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U.K., 1978.
(7) Litchfield, J. T., Wilcoxon, F. A simplified method of evaluating dose­effect experiments. J. Pharmacol. Exper. Ther., 1949, 96, 99-113.
(8) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. I Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, 3, 793­821.
(9) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, 4, 3-32.
(10) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC
50
. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (F. I. Mayer, J. L. Hamelink (eds.)). American Society for Testing and Materials. ASTM, 1977, STP 634, 65-84.
(11) Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J., Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC
50
. US EPA.
DODATEK 1
Upravená voda
Příklad vhodné ředicí vody (podle ISO 6341)
Všechny chemikálie musí být čistoty p.a.
Voda musí být kvalitní destilovaná nebo deionizovaná s vodivostí menší než 5 µS*cm
-1
.
Destilační přístroj nesmí obsahovat žádné měděné části.
Zásobní roztoky:
CaCl
2
*2H
2
O (chlorid vápenatý dihydrát) 11,76 g se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.
MgSO
4
*7H
2
O (síran hořečnatý heptahydrát) 4,93 g se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.
NaHCO
3
(hydrogenuhličitan sodný) 2,59 g se rozpustí ve vodě a doplní vodou na l litr.
KCl (chlorid draselný) 0,23 g se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.
Upravená ředicí voda
Smísí se po 25 ml všech čtyř zásobních roztoků a doplní vodou na 1 litr.
Provzdušňuje se, dokud koncentrace rozpuštěného kyslíku neodpovídá koncentraci nasycení vzdušným kyslíkem.
pH musí být 7,8 +/- 0,2.
Podle potřeby se pH upraví pomocí NaOH (hydroxid sodný) nebo HCl (kyselina chlorovodíková). Tato ředicí voda se nechá 12 h stát a nemusí být dále provzdušňována.
Koncentrace úhrnu iontů Ca a Mg v tomto roztoku je 2,5 mmol*l
-1
. Poměr množství iontů Ca : Mg je 4 : 1 a poměr množství iontů Na : K je 10 : 1. Celková koncentrace alkalických kovů v tomto roztoku je 0,8 mmol*l
-1
.
Jakákoli odchylka v přípravě vody k ředění nesmí změnit složení ani vlastnosti vody.
DODATEK 2
Souhrn výsledků kruhového testu EHS provedeného v roce 1978 (citovaného také v (2)).
Upozornění: účelem tohoto kruhového testu bylo stanovení 24hodinové hodnoty EC
50
.
Použité látky:
1) Dichroman draselný
2) Kyselina tetrapropylbenzensulfonová
3) Kyselina tetrapropylbenzensulfonová, sodná sůl
4) Kyselina 2,4,5­trichlorfenoxyoctová, draselná sůl
     -----------------------------------------------------
      Látka            Počet        Počet      Střední
                    zúčastněných   výsledků     hodnota
                     laboratoří       pro     24hodinové
                                    výpočet      EC
50
mg/l ----------------------------------------------------- 1 46 129 1,5 2 36 108 27 3 31 84 27 4 32 72 770 -----------------------------------------------------
DODATEK 3
Příklad závislosti imobilizace, vyjádřené v procentech, na koncentraci
Příklad stanovení EC
50
s použitím pravděpodobnostního logaritmického papíru
Imobilizace v %
    


III. METODA PRO STANOVENÍ INHIBICE RŮSTU ŘAS – METODA C.3 PODLE PŘÍLOHY SMĚRNICE 92/69/EHS
III.1 METODA
III.1.1 ÚVOD
Účelem této zkoušky je stanovit účinky látky na růst jednobuněčných zelených řas. Relativně krátkodobými zkouškami (72 h) lze posoudit účinky na několik generací řas. Tato metoda může být upravena pro použití s několika druhy řas, přičemž musí být v protokolu o zkoušce uveden popis metody.
Použití metody je nejsnadnější v případě látek rozpustných ve vodě, které za podmínek zkoušky pravděpodobně zůstávají ve vodě.
Metodu lze použít pro látky, které přímo neovlivňují měření růstu řas.
Je žádoucí mít před započetím zkoušky k dispozici co nejúplnější údaje o rozpustnosti látky ve vodě, o tenzi par, chemické stabilitě, disociačních konstantách a o biologické rozložitelnosti látky.
Další informace (např. strukturní vzorec, stupeň čistoty, druh a podíl významných nečistot v procentech, přítomnost a množství přísad a rozdělovací koeficient n­oktanol/voda) je třeba vzít v úvahu při plánování zkoušky i při interpretaci výsledků.
III.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
Hustota buněk: počet buněk na jeden mililitr.
Růst: zvyšování hustoty buněk během doby trvání zkoušky.
Růstová rychlost: nárůst hustoty buněk za jednotku času.
EC
50
: v této metodě jde o koncentraci zkušební látky, která má za následek 50% snížení růstu (E
b
C
50
) nebo růstové rychlosti (E
r
C
50
) vzhledem ke kontrole.
NOEC (no observed effect concentration): v této metodě jde o je nejvyšší zkoušenou koncentraci, při níž není pozorováno žádné významné snížení růstu nebo růstové rychlosti ve srovnání s kontrolou.
Všechny koncentrace zkušební látky se udávají v hmotnosti na jednotku objemu (mg·l
­1
). Mohou se také vyjádřit v hmotnostních podílech (mg*kg
­1
).
III.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Zkoušky s referenčními látkami mohou být provedeny s cílem prokázat, že se reakce zkušebních druhů za laboratorních zkušebních podmínek podstatně nezměnila.
Při použití referenční látky musí být výsledky uvedeny do protokolu o zkoušce. Jako referenční látka může být použit dichroman draselný, ale jeho barva může ovlivnit kvalitu a intenzitu světla dostupného buňkám a také spektrofotometrická měření, pokud se použijí. Dichroman draselný byl použit v mezinárodních mezilaboratorních testech (viz (3) a doplněk 2).
III.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l
­1
, s cílem prokázat, že EC
50
je vyšší než tato koncentrace.
Exponenciálně rostoucí kultury vybraných zelených řas jsou po několik generací vystaveny za definovaných podmínek různým koncentracím zkušební látky.
Zkušební roztoky se kultivují 72 h, během nichž se alespoň každých 24 h měří hustota buněk v každém roztoku. Stanoví se snížení růstu ve srovnání s kontrolní kulturou.
III.1.5. KRITÉRIA JAKOSTI
Kritéria jakosti se vztahují jak na limitní zkoušku, tak na celý zkušební postup.
Hustota buněk v kontrolních kulturách by se měla za 3 dny zvýšit alespoň šestnáctkrát.
Koncentrace zkušební látky nesmí po celou zkoušky klesnout pod 80 % původní hodnoty koncentrace.
U látek, které se ve zkušebním médiu lehce rozpouštějí a dávají stabilní roztoky, tj. v podstatné míře netěkají, nerozkládají se, nehydrolyzují nebo se neadsorbují, lze počáteční koncentraci pokládat za ekvivalentní s nominální koncentrací. Musí být potvrzeno, že byly koncentrace po celou zkoušku udrženy a že kritéria jakosti byla dodržena.
U látek, které
i) jsou ve zkušebním médiu špatně rozpustné, nebo
ii) mohou vytvářet stabilní emulze nebo disperse, nebo
iii) jsou ve vodných roztocích nestabilní,
musí být počáteční koncentrace brána jako koncentrace naměřená v roztoku na začátku zkoušky. Koncentrace se stanoví po určité době jejího ustálení.
Ve všech uvedených případech musí být během zkoušky provedena další měření s cílem potvrdit skutečné expoziční koncentrace nebo dodržení kritérií jakosti.
Je známo, že podstatná část zkušební látky může být během zkoušky zabudována do biomasy řas. Proto by se za účelem prokázání dodržení kritérií jakosti mělo brát v úvahu jak množství látky zabudované do biomasy řas, tak látka v roztoku (nebo, není­li to technicky možné, ve vodním sloupci). Protože však stanovení koncentrace látky v biomase řas může představovat technické obtíže, může být dodržení kritérií jakosti prokázáno zkouškou s nejvyšší koncentrací látky, ale bez řas, a měřením koncentrací v roztoku (nebo, není­li to technicky možné, ve vodním sloupci) na začátku a na konci zkoušky.
III.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍHO POSTUPU
III.1.6.1 Činidla
III.1.6.1.1 Roztoky zkušebních látek
Zásobní roztoky o požadované koncentraci se připraví rozpuštěním látky v deionizované vodě nebo ve vodě podle bodu 1.6.1.2. Zvolené zkušební koncentrace se připraví přidáním vhodného alikvotního podílu k předkulturám řas (viz doplněk 1).
Látky se obvykle zkoušejí až do meze jejich rozpustnosti. U některých látek (např. u látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo vysokou hodnotou P
o/v
nebo u látek, které ve vodě vytvářejí spíše stabilní disperse než pravé roztoky) je možné provést zkoušku při koncentraci vyšší, než je mez rozpustnosti, aby bylo zajištěno, že je dosaženo maximální koncentrace odpovídající maximální rozpustnosti/stabilitě. Je ovšem nutné, aby tato koncentrace jinak nenarušovala zkušební systém (např. vytvořením filmu na hladině bránícímu okysličení vody atd.). Pro přípravu zásobních roztoků látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo pro usnadnění rozptýlení látky ve zkušebním médiu lze použít ultrazvukovou dispergaci, organická rozpouštědla či emulgátory nebo dispergátory. Použijí­li se takové pomocné látky, měly by všechny zkušební koncentrace obsahovat stejné množství těchto pomocných látek a stejné koncentraci pomocné látky jako ve zkušebních sériích by měly být exponovány další kontroly. Koncentrace pomocných látek by měla být minimální a v žádném případě by neměla překročit 100 mg na l zkušebního média.
Zkouška se provede bez úpravy pH. Existují­li známky toho, že dochází k výrazné změně pH, doporučuje se zkoušku opakovat s úpravou pH a výsledky zaznamenat. V takovém případě se upraví pH zásobního roztoku na pH vody k ředění, pokud proti tomu neexistuji specifické důvody. Při úpravě pH se dává přednost HCl a NaOH. Úprava pH se provede tak, aby nebyla koncentrace zkušební látky v zásobním roztoku v podstatné míře změněna. Dojde­li úpravou ve zkušebním médiu k chemické reakci nebo ke srážení, skutečnosti se zaznamenají.
III.1.6.1.2 Zkušební médium
Voda musí být kvalitní destilovaná nebo deionizovaná s vodivostí menší než 5 µS·cm
-1
. Destilační přístroj nesmí obsahovat žádné měděné části.
Je doporučeno následující médium:
Podle následující tabulky se připraví čtyři zásobní roztoky. Tyto roztoky se sterilizují membránovou filtrací nebo v autoklávu a skladují se v temnu při 4 st.C. Zásobní roztok č. 4 by se měl sterilizovat pouze membránovou filtrací. Ředěním těchto roztoků se získají konečné živné koncentrace zkušebních roztoků.
---------------------------------------------------------------------
           Živina             Koncentrace    Konečná koncentrace ve
                               v zásobním       zkušebním roztoku
                                roztoku
---------------------------------------------------------------------
Zásobní roztok č. 1: makroživiny

NH
4
Cl 1,5 15 mg*l
-1
MgCl
2
*6H
2
O 1,2 12 mg*l
-1
CaCl
2
*2H
2
O 1,8 18 mg*l
-1
MgSO
4
*7H
2
O 1,5 15 mg*l
-1
KH
2
PO
4
0,16 1,6 mg*l
-1
Zásobní roztok č. 2: Fe - EDTA FeCl
3
*6H
2
O 80 0,08 mg*l
-1
Na
2
EDTA*2H
2
O 100 0,1 mg*l
-1
Zásobní roztok č. 3: stopové prvky H
3
BO
3
185 0,18 mg*l
-1
MnCl
2
*4H
2
O 415 0,415 mg*l
-1
ZnCl
2
3 3×10
-3
mg*l
-1
CoCl
2
*6H
2
O 1,5 1,5×10?3 mg*l
-1
CuCl
2
*2H
2
O 0,01 1×10
-5
mg*l
-1
Na
2
MoO
4
*2H
2
O 7 7×10
-3
mg*l
-1
Zásobní roztok č. 4: NaHCO
3
NaHCO
3
50 g*l
-1
50 mg*l
-1
---------------------------------------------------------------------
Po ustálení a po provzdušnění by mělo mít médium hodnotu pH přibližně 8.
III.1.6.2 Přístroje a pomůcky
— Běžné laboratorní vybavení.
— Kultivační baňky o vhodném objemu (např. Erlenmeyerovy baňky na 250 ml jsou vhodné v případě zkušebního roztoku o objemu 100 ml). Všechny zkušební baňky by měly být identické, pokud jde o materiál a rozměry.
— Kultivační zařízení: místnost nebo komora, v nichž lze udržovat teplotu 21 – 25 st.C +/- 2 st.C a stálé rovnoměrné osvětlení v rozsahu vlnových délek od 400 do 700 nm. Jestliže všechny řasy v kontrolních kulturách dosáhly doporučené růstové rychlosti, lze předpokládat, že podmínky pro jejich růst, včetně intenzity světla, jsou vyhovující.
U zkušebních roztoků s průměrnými koncentracemi se doporučuje použít světelnou intenzitu od 60 do 120 µE·m
­2
*s
­1
(35 – 70*1018 fotonů m
­2
*s
­1
) při měření v rozsahu 400 – 700 nm vhodným detektorem. Při měření intenzity luxmetry je přijatelný rozsah odpovídající 6000 – 10 000 lx.
Této světelné intenzity lze dosáhnout umístěním čtyř až sedmi univerzálních bílých 30W zářivek (teplota chromatičnosti přibližně 4 300 K) ve vzdálenosti 0,35 m od kultury řas.
— Měření hustoty buněk by se mělo provádět přímým počítáním živých buněk, např. pod mikroskopem s počítacími komůrkami. Za předpokladu dostatečné citlivosti a prokázané dobré korelace s buněčnou hustotou mohou být použity i jiné postupy (fotometrie, turbidimetrie,...).
III.1.6.3 Testovací organismy
Je doporučeno použít rychle rostoucí druhy zelených řas vhodné pro kultivaci a zkoušení.
Dává se přednost následujícím druhům:
— Selenastrum capricornutum, např. ATCC 22662 nebo CCAP 278/4,
— Scenedesmus subspicatus, např. 86.81 SAG.
Poznámka:
ATCC = American Type Culture Collection (USA)
CCAP = Culture Centre of Algae and Protozoa (VB)
SAG = Collection of algal culture (Göttingen, SRN)
Použití jiného druhu řas musí být uvedeno ve zprávě.
III.1.6.4 Zkušební postup
Koncentrační rozmezí, ve kterém lze očekávat účinky, se určí na základě výsledků orientačních zkoušek.
Dva parametry, jež jsou mírou růstu (biomasa a růstová rychlost), mohou poskytovat zcela rozdílné hodnoty snížení růstu; v orientační zkoušce by měly být použity oba parametry, aby mohlo zajištěno, že geometrická řada koncentrací umožní odhadnout jak E
b
C
50
, tak E
r
C
50
.
Počáteční hustota buněk
Doporučuje se, aby byla počáteční hustota buněk řasy Selenastrum capricornutum a řasy Scenedesmus subspicatus ve zkušebních roztocích přibližně 104 buněk na ml. Použije-li se jiný druh řasy, měla by být biomasa srovnatelná.
Koncentrace zkušební látky
Pro zkoušku se připraví geometrická řada nejméně pěti koncentrací lišících se od sebe vždy faktorem nepřekračujícím 2,2. Nejnižší zkoušená koncentrace by neměla vykazovat žádný pozorovatelný účinek na růst řas. Nejvyšší zkoušená koncentrace by měla omezit růst ve srovnání s kontrolní zkouškou nejméně o 50 %, nejlépe by měla růst zcela zastavit.
Opakování a kontroly
Plán zkoušky by měl zahrnovat tři opakování s každou zkušební koncentrací. Dále se provedou tři kontroly bez zkušební látky, a je-li použita pomocná látka, též tři kontroly s touto látkou. Je-li pro to důvod, může být plán zkoušky upraven tak, že se použije více koncentračních úrovní a sníží se počet opakování zkoušky s každou koncentrací.
Provedení zkoušky
Zkušební roztoky o požadované koncentraci zkušební látky a požadovaném množství inokula řas se připraví přidáním alikvotních podílů zásobního roztoku zkušební látky k vhodnému množství prekultury řas (viz doplněk 1).
Kultivační baňky se protřepou a umístí se do kultivačního zařízení. Buňky řas se udržují v suspensi třepáním, mícháním nebo probubláváním vzduchem, aby se zlepšila výměna plynů a zmenšilo se kolísání pH ve zkušebních roztocích. Kultury se udržují při teplotě 21 – 25 st.C udržované s přesností na +/- 2 st.C.
Hustota buněk v každé baňce se stanoví nejméně po 24, 48 a 72 h po zahájení zkoušky. Používá-li se měření hustoty buněk jiná metoda, než je jejich přímé počítání, použije se ke stanovení pozadí filtrované médium pro kultivaci řas obsahující odpovídající koncentraci zkušební chemické látky. pH se měří na začátku zkoušky a po 72 h.
Hodnota pH by se neměla během zkoušky změnit víc než o 1,5.
Zkoušení těkavých látek
V současné době neexistuje obecně přijatý způsob zkoušení těkavých látek. Je-li o látce známo, že se snadno vypařuje, mohou být použity uzavřené kultivační nádoby se zvětšeným mrtvým objemem. Při plánování objemu horní části kultivačních baněk se musí zohlednit eventuální nedostatek CO
2
. Byly navrženy varianty této metody (4).
Měl by být učiněn pokus stanovit množství zkušební látky, které v roztoku zůstalo; při interpretaci výsledků zkoušek s těkavými látkami v uzavřených systémech je doporučeno postupovat mimořádně opatrně.
Limitní zkouška
S využitím postupů popsaných v této metodě může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l
­1
s cílem prokázat, že EC
50
je vyšší než tato koncentrace.
Je­li povaha zkušební látky taková, že nelze ve vodě dosáhnout koncentrace 100 mg·l
-1
, provede se limitní zkouška při koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky v použitém médiu (nebo při maximální koncentraci, kdy látka vytváří stabilní disperzi) (viz také bod 1.6.1.1).
Limitní zkouška se provede alespoň třikrát, se stejným počtem kontrol. V limitní zkoušce se stanoví oba parametry, jež jsou mírou růstu (biomasa a růstová rychlost).
Zjistí­li se v limitní zkoušce pokles růstu biomasy nebo růstové rychlosti ve srovnání s kontrolami o 25 % nebo více, provede se úplná zkouška.
III.2 DATA A HODNOCENÍ
Naměřené hustoty buněk ve zkušební kultuře a v kontrolách se spolu s koncentracemi zkušební látky a dobami měření shrnou do tabulky. Střední hodnota hustoty buněk pro každou zkušební koncentraci a pro kontroly se vynese proti času (0 – 72 h) a sestrojí se růstová křivka.
Vztah koncentrace/účinek se stanoví dvěma následujícími postupy. Některé látky mohou růst při nízkých koncentracích stimulovat. V úvahu by měla být vzata pouze data udávající potlačení růstu mezi 0 a 100 %.
III.2.1 POROVNÁNÍ PLOCH POD RŮSTOVÝMI KŘIVKAMI
Plocha mezi růstovou křivkou a vodorovnou linií N = N0 se vypočte podle následujícího vzorce:
       
           N
1
- N
2
N
1
+ N
2
- 2N
o
N
n-1
+ N
n
- 2N
o
A = --------- . t
1
+ ------------- . (t
2
- t
1
) + ... + ---------------- . (tn - t
n-1
) 2 2 2
kde
A = plocha,
N
0
= počet buněk v ml v čase t0 (na počátku zkoušky),
N
1
= naměřený počet buněk v 1 ml v čase t1,
N
n
= naměřený počet buněk v 1 ml v čase tn,
t
1
= doba prvního měření od počátku zkoušky,
t
n
= doba n-tého měření od počátku zkoušky,
n = počet měření od počátku zkoušky.
Potlačení růstu vyjádřené v % (I
A
) se pro každou koncentraci zkušební látky vypočte podle vzorce:

                           A
c
- A
t
I
A
= ----------- x 100 A
c
kde
A
c
= plocha mezi růstovou křivkou kontrolní zkoušky a horizontální linií N = N
0
,
At = plocha mezi růstovou křivkou při koncentraci t a horizontální linií N = N
0
.
Hodnoty IA se nanesou na semilogaritmický nebo na pravděpodobnostní semilogaritmický papír proti odpovídajícím koncentracím. Vynesou­li se body na pravděpodobnostní papír, proloží se body přímka, a to ručně nebo regresním výpočtem.
Hodnota EC
50
se odhadne odečtením z regresní přímky jako koncentrace odpovídající 50% snížení růstu (I
A
= 50 %). Pro jednoznačné označení této hodnoty v rámci této metody výpočtu se doporučuje použít symbol E
b
C
50
. Je důležité, aby byla s hodnotou E
b
C
50
uvedena příslušná expoziční doba, např. E
b
C
50
(0 – 72 h)
.
III.2.2 POROVNÁNÍ RŮSTOVÝCH RYCHLOSTÍ
Průměrnou specifickou růstovou rychlost (µ) pro exponenciálně rostoucí kultury lze vypočítat jako:
      

          1nN
n
- 1nN
0
µ = ------------ t
n
- t
0
kde t
0
je čas začátku zkoušky.
Průměrnou specifickou růstovou rychlost lze také odvodit ze sklonu regresní přímky v závislosti ln N na čase.
Snížení specifické růstové rychlosti vyjádřené v procentech pro každou koncentraci zkušební látky (I
µt
) se vypočte podle vzorce:
                            
                     µ
c
- µ
t
I
µt
= ----------- x 100 µ
c
kde
µc = střední specifická růstová rychlost v kontrole,
µt = střední specifická růstová rychlost pro zkušební koncentraci t.
Snížení střední specifické růstové rychlosti v procentech při všech koncentracích zkušební látky ve srovnání s kontrolní hodnotou se vynese proti logaritmu koncentrace. Hodnotu EC
50
lze odečíst z výsledného grafu. Pro jednoznačné označení EC
50
odvozené touto metodou se doporučuje použít symbol E
r
C
50
. Musí být uvedeny okamžiky měření, např. vztahuje­li se hodnota k času 0 a k 72 h, označí se symbolem E
r
C
50
(0 – 72 h):
Poznámka: Ve výrazu pro specifickou růstovou rychlost vystupují logaritmy, tzn. malé změny růstové rychlosti mohou odpovídat velkým změnám biomasy. Hodnoty E
b
C a E
r
C tedy nejsou číselně srovnatelné.
III.2.3 VÝPOČET NOEC
Hodnota koncentrace nezpůsobující žádné pozorovatelné účinky (NOEC) se stanoví vhodnou statistickou metodou pro srovnávání více vzorků (např. analýza rozptylu a Dunnettův test) s využitím jednotlivých hodnot ploch pod růstovými křivkami A (viz bod 2.1) nebo specifických růstových rychlostí µ (viz bod 2.2).
III.3 ZPRÁVY
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:
— zkušební látka: údaje o chemické identitě;
— testovací organismus: původ, laboratorní kultura, číslo kmene, metoda kultivace;
— zkušební podmínky:
— datum zahájení a ukončení zkoušky a délka zkoušení,
— teplota,
— složení média,
— kultivační zařízení,
— hodnoty pH roztoku na počátku a na konci zkoušky (je­li pozorováno kolísání pH o více než 1,5, uvede se vysvětlení),
— nosič a metoda použitá pro rozpouštění zkušební látky, koncentrace nosiče ve zkušebních roztocích,
— intenzita a kvalita světla,
— zkoušené koncentrace (naměřené nebo nominální);
— výsledky:
— koncentrace buněk v jednotlivých baňkách v každé době měření a metoda měření koncentrace buněk,
— průměrné hodnoty koncentrace buněk,
— růstové křivky,
— grafické znázornění vztahu koncentrace – účinek,
— hodnoty EC a metoda výpočtu,
— NOEC,
— další pozorované účinky.
III.4 LITERATURA
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 201, Decision of the Council C(81) 30 Final.
(2) Umweltbundesamt, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag „Hemmung der Zellvermehrung bei der Grünalge Scenedesmus subspicatus“, In: Rudolph / Boje: Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg,1986.
(3) ISO 8692 – Water quality – Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum.
(4) S. Galassi, M. Vighi. Chemosphere, 1981, 10, 1123-1126.
DODATEK 1
Příklad postupu kultivace řas
Obecné poznámky
Účelem kultivace následujícím postupem je získání kultur řas pro zkoušky toxicity.
Měly by být použity vhodné metody k tomu, aby bylo zajištěno, že kultury řas nebudou infikovány bakteriemi (ISO 4833). Vhodné mohou být axenické kultury, avšak základem jsou jednodruhové kultury.
Všechny operace se provádějí za sterilních podmínek, aby nedošlo ke kontaminaci bakteriemi a jinými řasami. Kontaminované kultury se vyřadí.
Postupy při získání kultur řas
Příprava živných roztoků (média):
Médium lze připravit zředěním koncentrovaných základních roztoků živin. K získání pevného média se přidává 0,8 % agaru. Použité médium by mělo být sterilní. Sterilizace v autoklávu může vést ke ztrátě NH
3
.
Kmenová kultura:
Kmenové kultury jsou malé kultury řas, které se pravidelně přenášejí do čerstvého média, kde slouží jako výchozí testovací materiál. Nejsou­li kultury pravidelně používány, vyočkovávají se na šikmý agar. Poté se nejméně jednou za dva měsíce přenášejí do čerstvého média.
Kmenové kultury se pěstují v Erlenmeyerových baňkách obsahujících vhodné medium (objem přibližně 100 ml). Jsou- li řasy kultivovány při teplotě 20 st.C a stálém osvětlení, musí se přenášet každý týden.
Při přeočkování se přenese sterilní pipetou do baňky s čerstvým mediem takové množství „staré“ kultury, aby byla výchozí koncentrace u rychle rostoucího druhu řas asi stokrát menší než koncentrace kultury staré.
Růstovou rychlost druhu řas lze odečíst z růstové křivky. Je­li známa, lze z ní odhadnout hustotu, při níž musí být kultura přenesena do čerstvého média. K tomu musí dojít před fází odumírání kultury.
Předkultura:
Účelem předkultur je poskytnout dostatečné množství řas potřebných pro naočkování testovacích kultur. Předkultura se kultivuje za zkušebních podmínek a použije se ještě během exponenciálního růstu, to znamená obvykle po třídenní inkubační lhůtě. Obsahují­li kultury řas deformované nebo abnormální buňky, musí se odstranit.
DODATEK 2
V normě ISO 8692 - Jakost vody - Růstová inhibiční zkouška na sladkovodních řasách Scenedesmus subspicatus a Selenastrum capricornutum jsou uvedeny výsledky mezilaboratorních zkoušek dichromanu draselného provedených 16 laboratořemi.
 
-----------------------------------------------------------------
                    Střední hodnota (mg*l
-1
) Rozpětí (mg*l
-1
) ----------------------------------------------------------------- E
r
C
50
(0 – 72 h) 0,84 0,60 až 1,03 E
b
C
50
(0 – 72 h) 0,53 0,20 až 0,75 -----------------------------------------------------------------
IV. METODY PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI – METODY C.4 PODLE PŘÍLOHY SMĚRNICE 92/69/EHS
IV.I.1 ÚVOD
Je popsáno šest metod, které umožňují screeningové posouzení snadné biologické rozložitelnosti chemických látek v aerobním vodním prostředí:
a) Zkouška na úbytek rozpuštěného organického uhlíku (DOC) (metoda C.4­A)
b) Modifikovaná screeningová zkouška OECD – na úbytek DOC (metoda C.4­B)
c) Zkouška na uvolňování oxidu uhličitého (CO
2
) (modifikovaná Sturmova zkouška) (metoda C.4­C)
d) Zkouška manometrickou respirometrií (metoda C.4­D)
e) Zkouška v uzavřených lahvičkách (metoda C.4­E)
f) Zkouška MITI (Ministerstvo zahraničního obchodu a průmyslu – Japonsko) (metoda C.4­F)
Obecné a společné úvahy pro všech šest zkoušek jsou uvedeny v části I metody. Specifické body jednotlivých metod jsou uvedeny v částech II až VII. Přílohy obsahují definice, vzorce a návody.
Mezilaboratorní srovnávací test OECD provedený v roce 1988 ukázal, že metody poskytují shodné výsledky. V závislosti na fyzikálním charakteru látky, která má být zkoušena, se však může dávat přednost určité metodě.
IV.I.2 VÝBĚR VHODNÉ METODY Pro volbu nejvhodnější metody jsou nezbytné
informace o rozpustnosti, tenzi par a o adsorpčních vlastnostech chemické látky. Pro výpočet teoretických hodnot a/nebo ověření naměřených hodnot parametrů, např. TSK, TCO
2
, DOC, TOC, CHSK (viz přílohy I a II) je nutné znát chemickou strukturu nebo vzorec.
Zkušební chemické látky, jejichž rozpustnost ve vodě je alespoň 100 mg·l
­1
, lze zkoušet všemi metodami za předpokladu, že netěkají a neadsorbují se. Pro látky špatně rozpustné ve vodě, které těkají nebo se adsorbují, jsou vhodné metody uvedené v tabulce 1. Způsob, jakým je třeba zacházet s látkami špatně rozpustnými ve vodě a s látkami těkavými, je popsán v příloze III. Mírně těkavé látky je možno zkoušet metodou úbytku DOC, pokud je ve zkušebních nádobách (které musí být vhodně uzavřeny) dostatečně velký prostor pro plyn. V tomto případě musí být provedena abiotická kontrola pro zohlednění případné fyzikální ztráty.
 

       Tabulka 1: Použitelnost zkušebních metod
------------------------------------------------------------------------------- ----------
       Zkouška             Analytická metoda             Vhodnost pro látky
                                                    špatně     těkavé   adsorbující
                                                  rozpustné                 se
------------------------------------------------------------------------------- ----------
na úbytek DOC          rozpuštěný organický            —          —        + / –
                       uhlík

modif. zkouška OECD –  rozpuštěný organický            —          —        + / –
na úbytek DOC          uhlík

na uvolňování CO
2
respirometrie: + — + uvolňování CO
2
manometrická manometrická + + / – + respirometrie respirometrie: spotřeba kyslíku zkouška v uzavřených respirometrie: + / – + + lahvičkách rozpuštěný kyslík MITI respirometrie: spotřeba + + / – + kyslíku ------------------------------------------------------------------------------- ----------
Pro interpretaci získaných výsledků, zejména pokud jsou výsledky nízké nebo marginální, se vyžadují informace o čistotě nebo relativních podílech hlavních složek zkušebního materiálu.
Pro volbu vhodných zkušebních koncentrací mohou být velmi užitečné informace o toxicitě zkušební chemické látky pro bakterie (příloha IV); tyto informace mohou být důležité pro správnou interpretaci nízkých hodnot biologického rozkladu.
IV.I.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Pro ověření postupu se souběžně se zkouškou a ve vlastní baňce zkoušejí referenční chemické látky, které splňují kritéria snadné biologické rozložitelnosti.
Vhodnými chemickými látkami jsou anilin (čerstvě předestilovaný), natrium­acetát, natrium­benzoát. Všechny tyto referenční chemické látky se za podmínek v uvedených metodách rozkládají, i když se záměrně nepřidá žádné inokulum.
Byl podán návrh hledat referenční chemickou látku, která by byla snadno rozložitelná, avšak vyžadovala by přidání inokula. Navržen byl kalium­hydrogen­ftalát. O této látce je třeba ještě získat více údajů, než ji bude možné přijmout jako referenční látku.
V respirometrických zkouškách mohou v důsledku nitrifikace ovlivnit spotřebu kyslíku látky obsahující dusík (viz přílohy II a V).
IV.I.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍCH METOD
Roztok nebo suspense zkušební látky v minerálním prostředí se inokuluje a kultivuje v aerobních podmínkách v temnu nebo v difuzním světle. Množství DOC ve zkušebním roztoku pocházející z inokula se musí udržovat ve srovnání s DOC pocházejícího ze zkušební látky co nejnižší. Endogenní aktivita inokula se zohlední na základě souběžné slepé zkoušky s inokulem, avšak bez zkoušené látky, třebaže endogenní aktivita buněk v přítomnosti látky přesně neodpovídá aktivitě v endogenní kontrolní zkoušce. Za účelem kontroly postupu se souběžně provádí zkouška s referenční látkou.
Obecně se rozklad sleduje stanovením parametrů jako DOC, tvorba CO
2
nebo spotřeba kyslíku a měření se provádějí v dostatečně krátkých intervalech, aby bylo možné identifikovat začátek a konec biologického rozkladu. Měření automatickými respirometry je kontinuální. Někdy se doplňkově k jinému parametru měří DOC, avšak obvykle pouze na začátku a na konci zkoušky. Lze rovněž použít specifickou chemickou analýzu, kterou se vyhodnotí primární rozklad zkušební látky nebo kterou se stanoví koncentrace kteréhokoli vzniklého meziproduktu (ve zkoušce MITI povinné).
Zkouška obvykle trvá 28 dnů. Je však možné ukončit měření před uplynutím 28 dní, tj. jakmile vykazuje křivka biologického rozkladu plató po tři po sobě následující měření. Je také možné měření po 28 dnech prodloužit, jestliže z křivky vyplývá, že biologický rozklad začal, avšak 28. dne ještě nebylo ještě dosaženo plató.
IV.I.5 KRITÉRIA JAKOSTI
IV.I.5.1 Reprodukovatelnost
Vzhledem k charakteru biologického rozkladu a směsných populací bakterií používaných jako inokula se stanovení provádějí nejméně duplicitně.
Je obecně známo, že čím vyšší je koncentrace mikroorganismů přidaných na počátku do zkušebního média, tím menší jsou rozdíly mezi vícenásobnými měřeními. Okružní testy rovněž ukázaly, že mezi výsledky získanými různými laboratořemi mohou být velké rozdíly, avšak u snadno biologicky rozložitelných sloučenin se obvykle dosahuje dobré shody.
IV.I.5.2 Platnost zkoušky
Zkouška se považuje za platnou, je-li na konci zkoušky nebo popřípadě na konci 10denního období rozkladu rozdíl hodnot krajních výsledků vícenásobných měření rozkladu zkušební chemické látky v oblasti plató křivky menší než 20 % a dosáhl­li stupeň rozkladu referenční látky vyjádřený v procentech úrovně snadné biologické rozložitelnosti do 14 dní. Není-li splněna kterákoli z těchto podmínek, měření se opakuje. Vzhledem k náročnosti metod neznamenají nízké hodnoty nutně skutečnost, že zkušební látka není v podmínkách životního prostředí biologicky rozložitelná, ale znamenají, že k prokázání biologické rozložitelnosti jsou třeba další studie.
Jestliže ve zkoušce toxicity zahrnující jak zkušební látku, tak referenční chemickou látku došlo během 14 dnů k méně než 35% rozkladu (stanoveného podle DOC) nebo k méně než 25% rozkladu (stanoveného podle TSK nebo TCO
2
), lze zkušební chemické látky považovat za inhibující (viz také příloha IV). Série zkoušek by měla být opakována, pokud možno s nižší koncentrací zkušební chemické látky a/nebo s vyšší koncentrací inokula, avšak ne s koncentrací vyšší než 30 mg tuhých látek v litru.
IV.I.6 OBECNÉ POSTUPY A PŘÍPRAVA
Obecné podmínky pro zkoušky jsou shrnuty v tabulce 2. Přístroje a další experimentální podmínky specifické pro jednotlivé metody jsou popsány dále v kapitolách pro tyto příslušné metody.
                 Tabulka 2: Zkušební podmínky
---------------------------------------------------- ---------------------------------------------------
     Zkouška       Zkouška  Zkouška na Manometrická      Modif.          Zkouška       Zkouška MITI
                     na     uvolňování respirometrie  screeningová    v uzavřených          (I)
                   úbytek      CO
2
zkouška OECD lahvičkách ---------------------------------------------------- --------------------------------------------------- DOC Koncentrace zkušební látky mg*l
-1
100 2 - 10 100 mg DOC/l 10 - 40 10 - 20 10 - 40 mg TSK/l 50 - 100 5 - 10 ---------------------------------------------------- --------------------------------------------------- Koncentrace =< 30 mg/l SL nebo =< 100 ml 0,5 ml =< 5 ml odpadní 30 mg/l SL inokula odpadní vody/l sekundární vody/l (10
7
-10
8
) (buňky/l, (10
7
-10
8
) odpadní vody/l (10
4
-10
6
) přibližně) (10
5
) ---------------------------------------------------- --------------------------------------------------- Koncentrace prvků v minerálním médiu (v mg*l
-1
) P 116 11,6 29 N 1,3 0,13 1,3 Na 86 8,6 17,2 K 122 12,2 36,5 Mg 2,2 2,2 6,6 Ca 9,9 9,9 29,7 Fe 0,05 – 0,1 0,05 - 0,1 0,15 ---------------------------------------------------- --------------------------------------------------- pH 7,4 +/- 0,2 nejlépe 7,0 ---------------------------------------------------- --------------------------------------------------- Teplota 22 +/- 2 st.C 25 +/- 1 st.C ---------------------------------------------------- --------------------------------------------------- DOC = rozpuštěný organický uhlík, TSK = teoretická spotřeba kyslíku, SL = suspendované látky ---------------------------------------------------- ---------------------------------------------------
IV.I.6.1 Ředicí voda
Používá se deionizovaná nebo destilovaná voda neobsahující inhibující koncentrace toxických látek (např. ionty Cu
2+
). Voda smí obsahovat nejvýše 10 % obsahu organického uhlíku vneseného zkušebním materiálem. Vysoká čistota vody pro zkoušky je nezbytná pro to, aby se nevyskytovaly vysoké hodnoty slepého pokusu. Kontaminace může pocházet z vlastních přítomných nečistot, z materiálu měniče iontů, z rozkladných látek z bakterií a řas. Pro každou sérii měření se použije pouze jedna šarže vody, která byla předem překontrolována analýzou DOC. Tato kontrola není nutná u zkoušky v uzavřených lahvičkách, spotřeba kyslíku vodou však musí být nízká.
IV.I.6.2 Zásobní roztoky minerálních složek
Pro přípravu zkušebních roztoků se připraví zásobní roztoky o vhodných koncentracích minerálních složek. Níže uvedené zásobní roztoky je možné použít (při různých zřeďovacích faktorech) pro metodu s úbytkem DOC, modifikovanou screeningovou metodu OECD, metodu s uvolňováním CO
2
, pro manometrickou respirometrii a pro metodu s uzavřenými lahvičkami. Zřeďovací faktory a specifická příprava minerálního media pro zkoušku MITI jsou uvedeny v oddílech pro jednotlivé zkoušky.
Zásobní roztoky:
       Za  použití reakčních činidel čistoty p.a. se  připraví
       následující zásobní roztoky:

a)          Dihydrogenfosforečnan draselný, KH
2
PO
4
8,50 g Hydrogenfosforečnan didraselný, K
2
HPO
4
21,75 g Hydrogenfosforečnan disodný dihydrát, Na
2
HPO
4
*2H
2
O 33,40 g Chlorid amonný, NH
4
Cl 0,50 g Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr. pH roztoku musí být 7,4. b) Chlorid vápenatý bezvodý, CaCl
2
27,50 g nebo chlorid vápenatý dihydrát, CaCl
2
*2H
2
O 36,40 g Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr. c) Síran hořečnatý heptahydrát, MgSO
4
*7H
2
O 22,50 g Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr. d) Chlorid železitý hexahydrát, FeCl
3
*6H
2
O 0,25 g Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.
Poznámka: Aby nebylo nutné připravovat tento roztok bezprostředně před použitím, přidá se jedna kapka koncentrované kyseliny chlorovodíkové nebo 0,4 g disodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA) na 1 litr.
IV.I.6.3 Zásobní roztoky chemických látek
Pokud je rozpustnost vyšší než 1 g·l
-1
, rozpustí se například 1 – 10 g (podle potřeby) zkušební nebo referenční látky v deionizované vodě a doplní se na 1 litr. Jinak se zásobní roztoky připravují v minerálním médiu, nebo se chemická látka přidá přímo do minerálního média. Pokud jde o postup s méně rozpustnými chemickými látkami, viz příloha III; ve zkoušce MITI (metoda C.4-F) se nepoužívají ani rozpouštědla, ani emulgační činidla.
IV.I.6.4 Inokula
Inokulum lze získat z řady zdrojů: z aktivovaného kalu, ze splaškových vod (nechlorovaných), z povrchových vod a půd nebo z jejich směsi. Používá­li se aktivovaný kal ve zkoušce na úbytek DOC, na uvolňování CO
2
a ve zkoušce manometrickou respirometrií, měl by být odebrán z čistírny nebo z laboratorní jednotky čistící převážně domovní odpadní vody. U inokulí z jiných zdrojů byl zjištěn větší rozptyl výsledků. V modifikované screeningové zkoušce OECD a ve zkoušce v uzavřených lahvičkách je potřebné zředěnější inokulum bez vloček kalu a nejvhodnějším zdrojem je voda z druhého stupně čistírny domovních odpadních vod nebo z laboratorní jednotky. Pro zkoušku MITI se inokulum získává ze směsi zdrojů a je popsáno v oddílu věnovaném této zkoušce.
IV.I.6.4.1 Inokulum z aktivovaných kalů
Odebere se čerstvý vzorek aktivovaného kalu z aerační nádrže čistírny odpadních vod nebo laboratorní jednotky čistící převážně domovní odpadní vody. Podle potřeby se filtrací přes jemné síto odstraní hrubé částice a kal se udržuje v aerobních podmínkách.
Jinou možností je usazení nebo odstředění (např. 10 min při 1 100 g) po odstranění hrubých částic. Voda nad usazeninou se odstraní. Kal se promyje minerálním médiem. Koncentrovaný kal se suspenduje v minerálním médiu na koncentraci 3 – 5 g suspendovaných tuhých látek na litr a až do použití se provzdušňuje.
Kal by měl být odebrán z dobře fungující konvenční čistírny. Je-li nutné odebrat kal z čistírny s vysokým výkonem nebo předpokládá­li se, že kal obsahuje inhibitory, je třeba jej promýt. Po důkladném promíchání se kal nechá usadit nebo se odstředí, voda nad usazeninou se odstraní a promytý kal se opět suspenduje v nové dávce minerálního média. Tento postup se opakuje, dokud se kal nepovažuje za prostý přebytečného substrátu nebo inhibitoru.
Po opakovaném suspendování nebo z neupravovaného kalu se těsně před použitím odebere vzorek pro stanovení hmotnosti sušiny suspendovaných tuhých látek.
Další možností je homogenizace aktivovaného kalu (3 – 5 g suspendovaných látek v litru). Kal se 2 min zpracovává v mechanickém mísiči při střední rychlosti. Promíchaný kal se nechá 30 min, popřípadě déle, usazovat a kapalina se dekantuje pro použití jako inokulum v koncentraci 10 ml na litr minerálního média.
IV.I.6.4.2 Jiné zdroje inokula
Inokulum lze získat z výstupu z druhého stupně čistírny odpadních vod nebo laboratorní jednotky zpracovávající převážně domovní odpadní vody Odebere se čerstvý vzorek a během přepravy se udržuje v aerobních podmínkách. Nechá se 1 h usadit nebo se zfiltruje přes hrubý filtrační papír a dekantovaná kapalina nebo filtrát se až do použití udržuje v aerobních podmínkách. Na litr média lze použít až 100 ml tohoto typu inokula.
Dalším zdrojem inokula je povrchová voda. V tomto případě se odebere vzorek vhodné povrchové vody, např. říční nebo jezerní vody, a uchovává se až do použití v aerobních podmínkách. V případě potřeby se inokulum zkoncentruje filtrací nebo odstředěním.
IV.I.6.5 Předběžná úprava inokulí
Inokula je možné předběžně upravit pro experimentální podmínky, ale nikoli předběžně adaptovat na zkušební látku. Předběžná úprava spočívá v aeraci aktivovaného kalu v minerálním médiu nebo výstupu z druhého stupně čistírny po dobu 5 – 7 dnů při zkušební teplotě. Předběžná úprava někdy zlepší přesnost zkušebních metod snížením hodnot ze slepých pokusů. Předběžná úprava inokula pro zkoušku MITI se nepovažuje za nutnou.
IV.I.6.6 Abiotické kontroly
V případě potřeby se kontroluje možný abiotický rozklad zkušební látky stanovením úbytku DOC, přijmu kyslíku nebo uvolňování oxidu uhličitého ve sterilních kontrolách bez inokula. Sterilizace se provádí filtrací přes membránu (0,2 – 0,45 µm) nebo přidáním vhodné toxické látky v odpovídající koncentraci. Používá­li se membránová filtrace, odebírají se vzorky asepticky, aby byla zachována sterilita. Pokud nebyla předem vyloučena adsorpce zkušební látky, měly by zkoušky, kterými se sleduje biologický rozklad podle úbytku DOC, zejména při použití inokula z aktivovaného kalu, zahrnovat abiotickou kontrolu, která je inokulována a intoxikována.
IV.I.6.7 Počet nasazených baněk
Počet nasazených baněk v typické zkoušce je uveden v oddílech věnovaných jednotlivým zkouškám.
Mohou být použity tyto baňky:
Zkušební suspense: obsahující zkušební látku a inokulum
Slepá zkouška s inokulem: obsahující pouze inokulum
Kontrolní zkouška postupu: obsahující referenční látku a inokulum
Abiotická sterilní kontrola: sterilní, obsahující zkušební látku (viz I.6.6)
Kontrola adsorpce: obsahující zkušební látku, inokulum a sterilizační činidlo
Kontrola toxicity: obsahující zkušební látku, referenční látku a inokulum
Stanovení ve zkušební suspensi a slepý pokus s inokulem musí být prováděny souběžně. Doporučuje se, aby stanovení v ostatních baňkách bylo prováděno rovněž souběžně.
To však nemusí být vždy možné. Je třeba zajistit, aby se odebíral dostatečný počet vzorků nebo aby se prováděl dostatečný počet odečtů pro vyhodnocení procenta úbytku v 10denním období rozkladu.
IV.I.7 DATA A HODNOCENÍ
Při výpočtu rozkladu v procentech Dt, se použijí střední hodnoty z měření parametru provedených duplicitně v obou zkušebních nádobách a ze slepého pokusu s inokulem. Vzorce jsou uvedeny dále v oddílech pro jednotlivé zkoušky. Průběh rozkladu se znázorní graficky a vyznačí se 10denní období rozkladu. Vypočte se a uvede úbytek v procentech dosažený na konci 10denního období rozkladu a hodnota pro plató křivky nebo popřípadě hodnota odpovídající konci zkoušky.
V respirometrických zkouškách mohou v důsledku nitrifikace ovlivnit spotřebu kyslíku látky obsahující dusík (viz přílohy II a V).
IV.I.7.1 Měření rozkladu prostřednictvím stanovení DOC
Za účelem posouzení platnosti zkoušky (viz I.5.2) by se měla hodnota rozkladu Dt v procentech v každém časovém okamžiku, ve kterém se odebral vzorek, vypočítat odděleně pro každou baňku obsahující zkušební látku, a to pomocí středních hodnot měření DOC provedených duplicitně. Vypočte se podle následující rovnice:
        
                 +-         -+
                 |  C
t
- Cb
t
| D
t
= 1 - | ----------| x 100 | C
0
- C
b0
| +- -+
kde
D
t
= rozklad v procentech v čase t,
C
0
= střední počáteční koncentrace DOC v inokulovaném kultivačním médiu obsahujícím zkušební látku (v mg DOC na litr),
C
t
= střední koncentrace DOC v inokulovaném kultivačním médiu obsahujícím zkušební látku v čase t (v mg DOC na litr),
C
bo
= střední počáteční koncentrace DOC ve slepém inokulovaném minerálním médiu (v mg DOC na litr),
C
bt
= střední koncentrace DOC ve slepém inokulovaném minerálním médiu v čase t (v mg DOC na litr).
Všechny koncentrace se stanoví experimentálně.
IV.I.7.2 Rozklad měřený specifickou analýzou
Je-li možné získat specifické analytické údaje, vypočte se primární biologický rozklad z rovnice:
                      S
b
- S
a
Dt = --------- x 100 S
b
kde
D
t
= rozklad v procentech v čase t, obvykle po 28 dnech,
S
a
= zbylé množství zkušební látky v médiu s inokulem na konci zkoušky (mg),
S
b
= zbylé množství zkušební látky ve slepém pokusu s vodou/médiem, do kterých byla přidána pouze zkušební látka (mg).
IV.I.7.3 Abiotický rozklad
Použije­li se abiotická sterilní kontrola, vypočte se abiotický rozklad v procentech podle rovnice:
                                             C
s(0)
- C
s(t)
abiotický rozklad v % = ---------------- x 100 C
s(0)
kde:
C
s(0)
= koncentrace DOC ve sterilní kontrole v den 0,
C
s(t)
= koncentrace DOC ve sterilní kontrole v den t.
IV.I.8 ZPRÁVY
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:
— zkušební a referenční chemické látky a jejich čistota;
— zkušební podmínky;
— inokulum: charakter a místo (místa) odběru, koncentrace a jakákoli předběžná úprava;
— podíl a charakter průmyslového odpadu obsaženého v odpadní vodě, jsou-li známy;
— délka zkoušky a teplota;
— v případě špatně rozpustných zkušebních látek použitý způsob zpracování;
— použitá zkušební metoda; měly by být uvedeny vědecké důvody a vysvětlení pro veškeré změny postupu;
— přehled dat;
— veškeré pozorované projevy inhibice;
— jakýkoli pozorovaný abiotický rozklad;
— specifická analytická data o chemické látce, pokud existují;
— analytická data o meziproduktech, pokud existují;
— graf závislosti rozkladu v procentech na čase pro zkušební a referenční látku; je třeba zřetelně označit fázi iniciace, fázi rozkladu, 10denní období rozkladu a směrnici (příloha I). Vyhovuje­li zkouška kritériím jakosti, je možné v grafu použít střední hodnotu rozkladu v procentech v baňkách obsahujících zkušební látku;
— rozklad v procentech po 10denním období rozkladu, v oblasti plató a na konci zkoušky.
IVA. METODA PRO STANOVENí „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI POMOCí ÚBYTKU ROZPUŠTĚNÉHO ORGANICKÉHO UHLÍKU (DOC) – METODA C.4-A PODLE PříLOHY SMěRNICE 92/69/EHS
IVA.1 PODSTATA METODY
Odměřený objem inokulovaného minerálního média obsahujícího známou koncentraci zkušební látky (10 – 40 mg DOC na litr) jako nominální jediný zdroj organického uhlíku se provzdušňuje v temnu nebo v difusním světle při 22 +/- 2 st.C.
Rozklad se sleduje v krátkých intervalech během 28denního období prostřednictvím analýzy DOC. Stupeň biologického rozkladu se vypočte vyjádřením koncentrace rozloženého DOC (opravené na koncentraci DOC ve slepé zkoušce s inokulem) v procentech koncentrace, která byla přítomna na začátku. Stupeň primárního biologického rozkladu lze rovněž vypočítat z doplňkové chemické analýzy provedené na začátku a na konci kultivace.
IVA 2 POPIS METODY
IVA 2.1 Aparatura
a) Erlenmeyerovy baňky, např. 250 ml až 2 litry, podle objemu potřebného pro analýzu DOC;
b) Třepačka upravená pro umístění Erlenmeyerových baněk, buď s automatickou regulací teploty nebo používaná v místnosti s konstantní teplotou, a s dostatečným výkonem pro udržení aerobních podmínek ve všech baňkách;
c) Filtrační aparatura s vhodnými membránami;
d) Analyzátor DOC;
e) Přístroj pro stanovení rozpuštěného kyslíku;
f) Odstředivka;
IVA 2.2 Příprava minerálního média
Příprava zásobních roztoků je popsána v bodě I.6.2. Smísí se 10 ml roztoku a) s 800 ml ředicí vody, přidá se po 1 ml roztoků b) až d) a doplní se ředicí vodou na 1 litr.
IVA 2.3 Příprava a předběžná úprava inokula
Inokulum lze získat z řady zdrojů: z aktivovaného kalu, ze splaškových vod, z povrchových vod, z půd nebo z jejich směsi.
Viz I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 a I.6.5.
IVA 2.4 Příprava baněk
Do dvoulitrových Erlenmeyerových baněk se například odměří 800 ml minerálního média a do jednotlivých baněk se přidají dostatečná množství zásobních roztoků zkušební a referenční látky tak, aby se získaly koncentrace látky odpovídající 10 – 40 mg DOC na litr. Zkontrolují se hodnoty pH a popřípadě se upraví na 7,4. Baňky se inokulují aktivovaným kalem nebo jiným zdrojem inokula (viz I.6.4), aby se získala výsledná koncentrace nejvýše 30 mg suspendovaných látek na litr. Připraví se rovněž kontroly s inokulem v minerálním médiu, avšak bez zkušební nebo referenční látky.
Podle potřeby se použije jedna nádoba ke kontrole možného inhibičního účinku zkušební látky inokulací roztoku, který obsahuje srovnatelná množství jak zkušební, tak referenční chemické látky v minerálním médiu.
Podle potřeby se také použije další, sterilní baňka s roztokem chemické látky bez inokula, a to ke kontrole, zda se zkušební chemická látka rozkládá abioticky (viz I.6.6).
Existuje­li dále podezření, že se zkušební látka významně adsorbuje na skle, kalu apod., provede se předběžný odhad pravděpodobného rozsahu adsorpce, a tedy vhodnosti zkoušky pro danou látku (viz tabulka 1). Nasadí se baňka obsahující zkušební látku, inokulum a sterilizační činidlo.
Obsah všech baněk se doplní minerálním médiem na 1 litr a po promíchání se z každé baňky odebere vzorek pro stanovení počáteční koncentrace DOC (viz příloha II, bod 4). Ústí baněk se zakryjí např. hliníkovou fólií tak, aby byla umožněna volná výměna vzduchu mezi baňkami a okolní atmosférou. Baňky se poté umístí do třepačky a zahájí se zkouška.
IVA 2.5 Počet baněk v typické zkoušce
Baňka 1 a 2: Zkušební suspense
Baňka 3 a 4: Slepá zkouška s inokulem
Baňka 5: Kontrolní zkouška postupu
Dále se doporučují nebo se podle potřeby použijí:
Baňka 6: Abiotická sterilní kontrola
Baňka 7: Kontrola adsorpce
Baňka 8: Kontrola toxicity
Viz také bod I.6.7.
IVA 2.6 Provedení zkoušky
Během zkoušky se ve známých časových intervalech duplicitně stanovuje koncentrace DOC v každé baňce, a to dostatečně často, aby bylo možné určit začátek 10denního období rozkladu a úbytek v procentech na konci 10denního období rozkladu. Pro každé stanovení se odebere pouze minimální nezbytné množství zkušební suspense.
Před každým odběrem vzorků se podle potřeby nahradí ztráty odpařováním z baněk přidáním potřebného množství ředicí vody (1.6.1). Před odběrem vzorků se kultivační médium dobře promíchá a zajistí se, aby látky ulpělé na stěnách nádob přešly do roztoku nebo suspense. Vzorky se ihned po odběru zfiltrují přes membránu nebo odstředí (viz příloha II, bod 4). Zfiltrované nebo odstředěné vzorky se analyzují týž den, v opačném případě se uchovávají nejdéle 48 h při 2 – 4 st.C nebo delší dobu při teplotě nižší než -18 st.C.
IVA 3 DATA A ZPRÁVY
IVA 3.1 Zpracování výsledků
Rozklad v procentech v čase t se vypočte podle bodu I.7.1. (stanovení DOC) nebo podle bodu I.7.2 (specifická analýza).
Všechny výsledky se uvedou na příslušných formulářích přehledu dat.
IVA 3.2 Platnost výsledků
Viz bod I.5.2.
IVA 3.3 Zprávy
Viz bod I.8.
IVA 4 PŘEHLED DAT
Dále je uveden příklad přehledu dat.
       ZKOUŠKA NA ÚBYTEK DOC
       1. LABORATOŘ
       2. DATUM POČÁTKU ZKOUŠKY
       3. ZKUŠEBNÍ LÁTKA
             Název:
             Koncentrace  chemické látky v  zásobním  roztoku:
             mg*l
-1
Počáteční koncentrace chemické látky v médiu v čase t0: mg*l
-1
4. INOKULUM Zdroj: Provedená úprava: Předběžná úprava, pokud byla provedena: Koncentrace suspendovaných látek v reakční směsi: mg*l
­1
5 STANOVENÍ UHLÍKU ------------------------------------------------------------ Analyzátor uhlíku: Baňka DOC po n dnech č. (mg*l
-1)
------------------------------------------------------------ 0 n
1
n
2
n
3
n
x
------------------------------------------------------------ Zkušební látka a 1 a
1
inokulum a
2
a, střední hodnota C
a(t)
2 b
1
b
2
b, střední hodnota C
b(t)
------------------------------------------------------------ Slepá zkouška 3 c
1
s inokulem bez zkušební látky c
2
c, střední hodnota C
c(t)
4 d
1
d
2
d, střední hodnota C
d(t)
------------------------------------------------------------ C
c(t)
+ C
d(t)
C
bl(t)
= --------------- 2 6. VYHODNOCENÍ NAMĚŘENÝCH DAT


Poznámka: Podobné formuláře lze použít pro referenční chemickou látku a kontrolu toxicity. 7. ABIOTICKÁ KONTROLA (nepovinná)


8. SPECIFICKÁ CHEMICKÁ ANALÝZA (nepovinná) --------------------------------------------------------------------- Zbylé množství Primární zkušební rozklad chemické látky v procentech na konci zkoušky (mg*l
-1)
--------------------------------------------------------------------- Sterilní kontrola S
b
S
b
- S
a
Inokulované zkušební médium S
a
----------- x 100 S
b
---------------------------------------------------------------------
IVB. METODA PRO STANOVENí „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI POMOCí ÚBYTKU ROZPUŠTĚNÉHO ORGANICKÉHO UHLÍKU (DOC) - MODIFIKOVANÁ SCREENINGOVÁ ZKOUŠKA OECD – METODA C.4-B PODLE PříLOHY SMěRNICE 92/69/EHS
IVB.1 PODSTATA METODY
Odměřený objem minerálního média obsahujícího známou koncentraci zkušební látky (10 – 40 mg DOC na litr) jako jediný zdroj organického uhlíku se inokuluje 0,5 ml odpadní vody na litr média. Směs se provzdušňuje v temnu nebo v difusním světle při 22 +/- 2 st.C.
Rozklad se sleduje v krátkých intervalech během 28denního období prostřednictvím analýzy DOC. Stupeň biologického rozkladu se vypočte vyjádřením koncentrace rozloženého DOC (opravené na koncentraci DOC ve slepé zkoušce s inokulem) v procentech koncentrace, která byla přítomna na začátku. Stupeň primárního biologického rozkladu lze rovněž vypočítat z doplňkové chemické analýzy provedené na začátku a na konci inkubace.
IVB.2 POPIS METODY
IVB.2.1 Aparatura
a) Erlenmeyerovy baňky, např. 250 ml až 2 litry, podle objemu potřebného pro analýzu DOC;
b) Třepačka pro umístění Erlenmeyerových baněk, buď s automatickou regulací teploty nebo používaná v místnosti s konstantní teplotou, a s dostatečným výkonem pro udržení aerobních podmínek ve všech baňkách;
c) Filtrační aparatura s vhodnými membránami;
d) Analyzátor DOC;
e) Přístroj pro stanovení rozpuštěného kyslíku;
f) Odstředivka.
IVB.2.2 Příprava minerálního média
Příprava zásobních roztoků je popsaná v bodě I.6.2. Smísí se 10 ml roztoku a) s 800 ml ředicí vody, přidá se po 1 ml roztoků b) až d) a doplní se ředicí vodou na 1 litr.
V této metodě se používá jako inokulum pouze 0,5 ml odpadní vody na litr, a proto je nutné do média dodat stopové prvky a růstové faktory. Toho se dosáhne přidáním 1 ml každého z dále uvedených roztoků na jeden litr výsledného média:
       Roztok stopových prvků:
       Síran manganatý tetrahydrát, MnSO
4
*4H
2
O 39,9 mg Kyselina boritá, H
3
BO
3
57,2 mg Síran zinečnatý heptahydrát, ZnSO
4
*7H
2
O 42,8 mg Heptamolybdenan hexaamonný, (NH
4
)
6
Mo7O
24
34,7 mg Chelát Fe (FeCl
3
s kyselinou ethylendiaminotetraoctovou) 100,0 mg Rozpustí se v ředicí vodě a doplní se touto vodou na 1 000 ml. Vitaminový roztok: Kvasničný extrakt 15,0 mg Kvasničný extrakt se rozpustí ve 100 ml vody.
Sterilizuje se průchodem membránou 0,2 µm, nebo se připraví čerstvě.
IVB.2.3 Příprava a předběžná úprava inokula
Inokulum se získá z výstupu druhého stupně čistírny nebo laboratorní jednotky zpracovávající převážně domovní odpadní vody.
Viz I.6.4.2 a I 6.5.
Použije se 0,5 ml na litr minerálního média.
IVB.2.4 Příprava baněk
Do dvoulitrových Erlenmeyerových baněk se například odměří 800 ml minerálního média a do jednotlivých baněk se přidají dostatečná množství zásobních roztoků zkušební a referenční látky tak, aby se získaly koncentrace látky odpovídající 10 – 40 mg DOC na litr. Zkontrolují se hodnoty pH a popřípadě se upraví na 7,4. Baňky se inokulují odpadní vodou z druhého stupně čištění odpadních vod (viz I.6.4.2) v objemu 0,5 ml na litr. Připraví se rovněž slepé zkoušky s inokulem v minerálním médiu, avšak bez zkušební nebo referenční látky.
Podle potřeby se použije jedna nádoba ke kontrole možného inhibičního účinku zkušební látky inokulací roztoku, který obsahuje srovnatelná množství jak zkušební, tak referenční chemické látky v minerálním médiu.
Podle potřeby se také použije další, sterilní baňka s roztokem chemické látky bez inokula, a to ke kontrole, zda se zkušební chemická látka rozkládána abioticky (viz I.6.6).
Existuje­li dále podezření, že se zkušební látka významně adsorbuje na skle, kalu apod., provede se předběžný odhad pravděpodobného rozsahu adsorpce, a tedy vhodnosti zkoušky pro danou látku (viz tabulka 1). Nasadí se baňka obsahující zkušební látku, inokulum a sterilizační činidlo.
Obsah všech baněk se doplní minerálním médiem na 1 litr a po promíchání se z každé baňky odebere vzorek pro stanovení počáteční koncentrace DOC (viz příloha II, bod 4). Ústí baněk se zakryjí např. hliníkovou fólií tak, aby byla umožněna volná výměna vzduchu mezi baňkami a okolní atmosférou. Baňky se poté umístí do třepačky a zahájí se zkouška.
IVB.2.5 Počet baněk v typické zkoušce
Baňka 1 a 2: Zkušební suspense
Baňka 3 a 4: Slepá zkouška s inokulem
Baňka 5: Kontrolní zkouška postupu
Dále se doporučují se nebo se podle potřeby použijí:
Baňka 6: Abiotická sterilní kontrola
Baňka 7: Kontrola adsorpce
Baňka 8: Kontrola toxicity
Viz také bod I.6.7.
IVB.2.6 Provedení zkoušky
Během zkoušky se ve známých časových intervalech duplicitně stanovuje koncentrace DOC v každé baňce, a to dostatečně často, aby bylo možné určit začátek 10denního období rozkladu a úbytek v procentech na konci 10denního období rozkladu. Pro každé stanovení se odebere pouze minimální nezbytné množství zkušební suspense.
Před odběrem vzorků se podle potřeby nahradí ztráty odpařováním z baněk přidáním potřebného množství ředicí vody (1.6.1). Před odběrem vzorků se kultivační médium dobře promíchá a zajistí se, aby látky ulpělé na stěnách nádob přešly do roztoku nebo suspense. Vzorky se ihned po odběru zfiltrují přes membránu nebo odstředí (viz příloha II, odst. 4). Zfiltrované resp. odstředěné vzorky se analyzují týž den, v opačném případě se uchovávají nejdéle 48 h při 2 – 4 st.C nebo delší dobu při teplotě nižší než
-1
8 st.C.
IVB.3 DATA A ZPRÁVY
IVB.3.1 Zpracování výsledků
Rozklad v procentech v čase t se vypočte podle bodu I.7.1. (stanovení DOC) nebo podle bodu I.7.2 (specifická analýza).
Všechny výsledky se uvedou na příslušných formulářích přehledů dat.
IVB.3.2 Platnost výsledků
Viz bod I.5.2.
IVB.3.3 Zprávy
Viz bod I.8.
IVB.4 PŘEHLED DAT

       Dále je uveden příklad přehledu dat.

       MODIFIKOVANÁ SCREENINGOVÁ ZKOUŠKA OECD
       1. LABORATOŘ
       2. DATUM POČÁTKU ZKOUŠKY
       3. ZKUŠEBNÍ LÁTKA
             Název:
             Koncentrace  chemické látky v  zásobním  roztoku:
             mg*l
-1
Počáteční koncentrace chemické látky v médiu v čase t
0
: mg*l
-1
4. INOKULUM Zdroj: Provedená úprava: Předběžná úprava, pokud byla provedena: Koncentrace suspendovaných látek v reakční směsi: mg*l
­1
5 STANOVENÍ UHLÍKU ----------------------------------------------------------- Analyzátor uhlíku: Baňka DOC po n dnech č. (mg*l
-1
) ----------------------------------------------------------- 0 n
1
n
2
n
3
n
x
Zkušební látka a 1 a
1
inokulum a
2
a, střední hodnota Ca(t) 2 b
1
b
2
b, střední hodnota C
b(t)
----------------------------------------------------------- Slepá zkouška 3 c
1
s inokulem bez zkušební látky c
2
c, střední hodnota C
c(t)
4 d
1
d
2
d, střední hodnota C
d(t)
----------------------------------------------------------- C
c(t)
+ C
d(t)
C
bl(t)
= --------------- 2 6. VYHODNOCENÍ NAMĚŘENÝCH DAT


Poznámka: Podobné formuláře lze použít pro referenční chemickou látku a kontrolu toxicity. 7. ABIOTICKÁ KONTROLA (nepovinná)


8. SPECIFICKÁ CHEMICKÁ ANALÝZA (nepovinná) --------------------------------------------------------------------- Zbylé množství Primární zkušební rozklad chemické látky v procentech na konci zkoušky (mg*l
-1)
--------------------------------------------------------------------- Sterilní kontrola S
b
S
b
- S
a
Inokulované zkušební médium S
a
----------- x 100 S
b
---------------------------------------------------------------------
IVC. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI POMOCÍ UVOLŇOVÁNÍ OXIDU UHLIČITÉHO (CO
2
) – MODIFIKOVANÁ STURMOVA ZKOUŠKA – METODA C.4-C PODLE PŘÍLOHY SMĚRNICE 92/69/EHS
IVC.1 PODSTATA METODY
Odměřený objem inokulovaného minerálního média obsahující známou koncentraci zkušební látky (10 – 20 mg DOC nebo TOC na litr), která je jediným zdrojem uhlíku, se provzdušňuje v temnu nebo v difusním světle regulovaným proudem vzduchu bez CO
2
. Rozklad se sleduje po dobu 28 dnů prostřednictvím vznikajícího CO
2
jímaného v roztoku hydroxidu barnatého nebo sodného, kde se stanoví titrací zbytkového hydroxidu nebo jako anorganický uhlík. Množství CO
2
vzniklého ze zkušební látky (po korekci na CO
2
pocházející z čistého inokula) se vyjádří v procentech TCO
2
. Stupeň biologického rozkladu může být také vypočten z doplňkového stanovení DOC na začátku a na konci inkubace.
IVC.2 POPIS METODY
IVC.2.1 Přístroje
a) Baňky na 2 – 5 l vybavené provzdušňovací trubicí dosahující až ke dnu nádoby a výstupním otvorem;
b) Magnetické míchačky pro zkoušení špatně rozpustných látek;
c) Absorpční lahv;
d) Zařízení pro regulaci a měření průtoku vzduchu;
e) Zařízení pro odstraňování CO
2
při přípravě vzduchu bez CO
2
, popřípadě může být použita směs kyslíku bez CO
2
a dusíku bez CO
2
ve správném poměru (20 % O
2
a 80 % N2) z lahví se stlačenými plyny;
f) Zařízení na stanovení CO
2
buď titračně nebo pomocí analyzátoru anorganického uhlíku;
g) Zařízení pro membránovou filtraci (podle volby);
h) Analyzátor DOC (podle volby).
IVC.2.2 Příprava minerálního média
Příprava zásobních roztoků je popsána v části I.6.2. Smísí se 10 ml roztoku a) s 800 ml ředicí vody, přidá se po 1 ml roztoků b) až d) a doplní se ředicí vodou na 1 litr.
IVC.2.3 Příprava a předběžná úprava inokula
Inokulum lze získat z řady zdrojů: z aktivovaného kalu, ze splaškových vod, z povrchových vod, z půd nebo z jejich směsi.
Viz I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 a I.6.5.
IVC.2.4 Příprava baněk
Jako příklad jsou uvedeny hodnoty pro baňky na 5 litrů obsahující 3 litry suspense. V případě použití menších objemů se hodnoty úměrně upraví, musí být ovšem zajištěno, aby bylo možné přesně měřit vznikající CO
2
. Do každé baňky na 5 litrů se přenese 2 400 ml minerálního média. Přidá se vhodné množství připraveného inokula (viz I.6.4.1 a I.65), aby koncentrace suspendovaných látek v konečném objemu 3 l inokulované směsi byla 30 mg*l
-1
. Eventuálně lze nejdříve zředit připravený kal v minerálním médiu na suspensi o koncentraci 500 – 1 000 mg*l
-1
a poté přidat alikvotní části do baňky na 5 litrů, aby byla dosažena koncentrace 30 mg*l
-1
; zajistí se tím větší přesnost. Mohou být použity i jiné zdroje inokula (viz I.6.4.2). Inokulovaná směs se přes noc provzdušňuje vzduchem bez CO
2
, aby se ze systému odstranil oxid uhličitý.
Odděleně do dvojic baněk se ze zásobních roztoků přidá zkušební látka a referenční látka tak, aby koncentrace pocházející z chemických látek byla v rozmezí 10 až 20 mg DOC nebo TOC na litr; některé lahve se nasadí jako kontrola inokula bez přidání chemických látek. Špatně rozpustné látky se odváží nebo odměří přímo do baněk, nebo se postupuje podle přílohy III.
Podle potřeby se jedna baňka použije ke kontrole možného inhibičního účinku zkušební látky, a to přidáním zkušební i referenční látky ve stejných koncentracích jako v ostatních baňkách.
Podle potřeby se další baňka použije k ověření, zda se zkušební látka nerozkládá abioticky, přičemž se použije roztok chemické látky bez inokula (viz I.6.6). Sterilizace se provádí přidáním vhodné koncentrace toxické látky.
Podle potřeby se další baňka použije k ověření, zda se zkušební látka nerozkládá abioticky, přičemž se použije roztok chemické látky bez inokula (viz I.6.6).
Sterilizace se provádí přidáním vhodné koncentrace toxické látky. Ve všech baňkách se upraví objem na 3 1 přídavkem minerálního média bez CO
2
. Podle potřeby lze odebrat vzorky pro stanovení DOC (viz příloha II, bod 4) a/nebo pro specifickou analýzu. Poté se na výstup plynů u baněk připojí absorpční lahve.
V případě použití hydroxidu barnatého se za každou baňku na 5 litrů zařadí tři absorpční lahve, každá obsahující 100 ml roztoku Ba(OH)
2
o koncentraci 0,0125 mol*l
-1
. Roztok nesmí obsahovat sraženinu síranů a uhličitanu barnatého a jeho koncentrace musí být stanovena bezprostředně před použitím. Je­li použit hydroxid sodný, spojí se 2 absorpční lahve, z nichž druhá slouží jako kontrola, že byl veškerý CO
2
zachycen v první absorpční lahvi. K tomuto účelu se hodí absorpční lahve opatřené sérovými uzávěry. Do každé absorpční lahve se přidá po 200 ml roztoku NaOH o koncentraci 0,05 mol*l
-1
, což postačuje k absorpci veškerého oxidu uhličitého, který by se uvolnil při úplném rozkladu látky. Roztok hydroxidu sodného, i když je čerstvě připraven, obsahuje stopy uhličitanů; korekce se provede odečtením množství uhličitanů ve slepém pokusu.
IVC.2.5 Počet baněk v typické zkoušce
Baňka 1 a 2: Zkušební suspense
Baňka 3 a 4: Slepá zkouška s inokulem
Baňka 5: Kontrolní zkouška postupu
Dále se doporučují se nebo se podle potřeby použijí:
Baňka 6: Abiotická sterilní kontrola
Baňka 7: Kontrola toxicity
Viz také bod I.6.7.
IVC.2.6 Provedení zkoušky
Zkouška se zahájí probubláváním vzduchu bez CO
2
suspensí při průtoku 30 – 100 ml*min
-1
. Za účelem analýzy obsahu CO
2
se pravidelně odebírají vzorky absorbentu. Doporučuje se, aby se v průběhu prvních 10 dnů prováděly analýzy každý druhý až třetí den a dále pak každý pátý den až do 28. dne, což umožní rozpoznat období 10denního období rozkladu.
28. den se (nepovinně) odebere vzorek pro stanovení DOC a/nebo pro specifickou analýzu, změří se pH suspensí a poté se do každé baňky přidá 1 ml koncentrované HCl; provzdušňuje se přes noc, aby se odstranil CO
2
přítomný v suspensi. Poslední analýza uvolněného CO
2
se provede 29. den.
Ve dnech, kdy se provádí stanovení CO
2
, se odpojí absorpční lahev s hydroxidem barnatým bližší zkušební baňce a roztok hydroxidu barnatého se titruje 0,05M HCl za přítomnosti fenolftaleinu jako indikátoru. Zbývající dvě absorpční lahve se posunou k baňce a na konec řady se zařadí nová absorpční lahev se 100 ml čerstvě připraveného 0,0125M hydroxidu barnatého. Titrace se provádějí podle potřeby, např. je­li pozorována v první absorpční lahvi zřetelná sraženina a před tím, než vznikne viditelná sraženina ve druhé absorpční lahvi, nebo alespoň jednou týdně. Jinou možností je provést při použití NaOH jako absorbentu odběr malého vzorku hydroxidu sodného pomocí injekční stříkačky (podle použitého analyzátoru uhlíku) z absorpční lahve, která je nejblíže k baňce. Vzorek se nastříkne přímo do IC- části analyzátoru uhlíku pro analýzu anorganického uhlíku.
Obsah druhé absorpční lahve se analyzuje pouze na konci zkoušky s cílem stanovit korekci na možný únik CO
2
.
IVC.3 DATA A ZPRÁVY
IVC.3.1 Zpracování výsledků
Množství CO
2
zachyceného v absorpční lahvi je v případě titračního stanovení dáno vztahem:
mg CO
2
= (100 × C
B
- 0,5 × V × C
A
) × 44
kde
V = objem HCl spotřebovaný při titraci 100 ml obsahu absorpční lahve (ml),
C
B
= koncentrace roztoku hydroxidu barnatého (mol*l
-l
),
C
A
= koncentrace roztoku kyseliny chlorovodíkové (mol*l
-l
).
Je­li CL 0,0125 mol·ll a C
A
0,05 mol*ll, je spotřeba pro titraci 100 ml roztoku Ba(OH)
2
50 ml a hmotnost CO
2
je dána vztahem:
        
        0,05
        ---- x 44 x počet ml HCl spotřebované při titraci         = 1,1 x ml HCl
          2
                 
        
        
V tomto případě se tedy k přepočtu objemu HCl spotřebovaného při titraci na hmotnost vzniklého CO
2
použije faktor 1,1.
S použitím příslušných výsledků titrace se vypočte hmotnost CO
2
vzniklého ze samotného inokula a inokula se zkušební látkou a jejich rozdíl je hmotnost CO
2
vzniklého ze samotné zkušební látky.
Je­li např. výsledkem titrace samotného inokula 48 ml a inokula se zkušební látkou 45 ml, je množství
CO
2
z inokula = 1,1 × (50 - 48) = 2,2 mg,
CO
2
z inokula a zkušební látky = 1,1 × (50 - 45)= 5,5 mg,
a tedy hmotnost CO
2
vzniklého ze zkušební látky 3,3 mg.
Biologický rozklad v procentech se vypočte podle vztahu:
                                vzniklý CO
2
v mg x 100 rozklad v procentech = -------------------------------------------- TCO
2
x přidaná zkušební látka v mg
nebo
                                vzniklý CO
2
v mg x 100 rozklad v procentech = -------------------------------------------- TCO
2
přidaný ve zkoušce v mg x 3,67
přičemž 3,67 je převodní faktor (44/12) pro uhlík a oxid uhličitý.
Rozklad v procentech se po každém období vypočte dosazením hodnoty TCO
2
vypočítané pro každý den až do doby, kdy byl měřen.
Při zachytávání do NaOH se vypočte hmotnost vzniklého CO
2
, vyjádřeného jako anorganický uhlík v mg, vynásobením koncentrace anorganického uhlíku v absorpční lahvi objemem absorpčního roztoku.
Rozklad v procentech se vypočte podle vztahu:
             anorg. C ze zkušeb. baňky v mg - anorg. C  × 100  ze slep. pokusu v mg
TCO
2
v % = --------------------------------------------------------------------------- TOC přidaný jako zkušební látka v mg
Úbytky DOC se (nepovinně) vypočítají podle bodu I.7. Tento výsledek spolu s ostatními výsledky se zaznamenají do příslušného formuláře přehledu dat.
IVC.3.2 Platnost výsledků
Obsah anorganického uhlíku ve zkušební suspensi v minerálním médiu na začátku zkoušky musí být menší než 5 % TC a celkové množství CO
2
vzniklé na konci slepé zkoušky s inokulem nesmí za normálních okolností překročit 40 mg na litr média. Jsou­li hodnoty větší než 70 mg CO
2
na litr, měla by být data i experimentální postup kriticky přehodnoceny.
Viz také I.5.2.
IVC.3.3 Zprávy
Viz I. 8.
IVC.4 PŘEHLED DAT
   
     Dále je uveden příklad přehledu dat:
      ZKOUŠKA NA UVOLŇOVÁNÍ OXIDU UHLIČITÉHO
       1. LABORATOŘ
       2. DATUM ZAHÁJENÍ ZKOUŠKY
       3. ZKUŠEBNÍ LÁTKA
             Název:
             Koncentrace  chemické látky v  zásobním  roztoku:
             mg*l
-1
Počáteční koncentrace chemické látky v médiu: mg*l
-1
Celkové množství uhlíku přidaného do baňky: mg C TCO
2
: mg CO
2
4. INOKULUM Zdroj: Provedená úprava: Předběžná úprava, pokud byla provedena: Koncentrace suspendovaných látek v reakční směsi: mg*l
­1
5. TVORBA OXIDU UHLIČITÉHO A ROZLOŽITELNOST Metoda: Ba(OH)
2
/ NaOH / jiná ------------------------------------------------------------------------ Čas CO
2
CO
2
Celkové množství TCO
2
(dny) uvolněný uvolněný CO
2
(průměr ve ve zkoušce ve slepé zkoušce minus kumulativní CO
2
(mg) zkoušce průměr ve slepé --------------- x100 (mg) zkoušce) (mg) TCO
2
------------------------------------------------------------------------- 1 2 průměr 3 4 průměr 1 2 1 2 průměr 0 n
1
n
2
n
3
------------------------------------------------------------------------ 28 ------------------------------------------------------------------------ Poznámka: podobný formulář lze použít i pro referenční látku a pro kontroly toxicity. 6. ANALÝZA UHLÍKU (podle volby) Analyzátor uhlíku: ------------------------------------------------------ Čas (dny) Slepý pokus Zkušební látka (mg*l
-1
) (mg*l
-1
) 0 C
b(0)
C
0
28* C
b(t)
C
t
------------------------------------------------------ * nebo na konci kultivace C
t
- C
b(t)
odstraněný DOC v % = 1 - ------------------ x 100 C
0
- C
b(0)
7. ABIOTICKÝ ROZKLAD (nepovinné) tvorba CO
2
ve steril. podm. po 28 dnech v mg abiotický rozklad v % = -------------------------------------------- x 100 TCO
2
IVD. METODA PRO STANOVENí „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI MANOMETRICKOU RESPIROMETRIÍ C.4­D PODLE PŘÍLOHY SMĚRNICE 92/69/EHS
IVD.1 PODSTATA METODY
Odměřený objem inokulovaného minerálního média obsahující známou koncentraci zkušební chemické látky (100 mg zkušební látky na litr, dávající nejméně 50 – 100 mg TSK na litr), která je jediným zdrojem organického uhlíku, se míchá v uzavřené nádobě při konstantní teplotě (tolerance +/-1 st.C nebo menší) na dobu 28 dnů. Spotřeba kyslíku se stanoví buď měřením množství kyslíku (elektrolyticky produkovaného), který je potřebný k udržení konstantního objemu plynu v respirační nádobce, nebo ze změn objemu nebo tlaku (nebo obojího) v aparatuře. Uvolněný CO
2
se jímá v roztoku hydroxidu draselného nebo v jiném vhodném absorbentu. Množství kyslíku, které je zkoušenou látkou spotřebováno (korigované na spotřebu kyslíku inokulem ve slepé zkoušce, která se provádí současně), se vyjádří v procentech TSK nebo CHSK. Popřípadě může být z doplňkové specifické chemické analýzy provedené na začátku a na konci kultivace vypočten primární biologický rozklad a z analýzy DOC úplný biologický rozklad.
IVD.2 POPIS METODY
IVD.2.1 Přístroje
a) vhodný respirometr;
b) regulátor teploty s přesností na +/-1 st.C nebo lepší;
c) zařízení pro membránovou filtraci (nepovinné);
d) analyzátor uhlíku (nepovinné).
IVD.2.2 Příprava minerálního média
Příprava zásobních roztoků je popsána v části I.6.2. Smísí se 10 ml roztoku a) s 800 ml ředicí vody, přidá se po 1 ml roztoků b) až d) a doplní se ředicí vodou na 1 litr.
IVD.2.3 Příprava a předběžná úprava inokula
Inokulum lze získat z řady zdrojů: z aktivovaného kalu, ze splaškových vod, z povrchových vod, z půd nebo z jejich směsi.
Viz I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 a I.6.5.
IVD.2.4 Příprava baněk
S použitím zásobních roztoků se připraví samostatné sady roztoků zkušební chemické látky a referenční chemické látky v minerálním médiu o koncentraci odpovídající obvykle 100 mg chemické látky na litr (dávající nejméně 50 – 100 mg TSK na litr).
TSK se vypočte z tvorby amoniových solí, pokud lze vyloučit nitrifikaci, v opačném případě by měl být výpočet založen na tvorbě dusičnanů (viz příloha II, bod 2).
Změří se pH a v případě potřeby se upraví na 7,4 +/- 0,2.
Špatně rozpustné látky se přidají v pozdějším stádiu (viz dále).
Má-li se stanovit toxicita zkušební látky, připraví se další roztok v minerálním médiu, jenž obsahuje referenční i zkušební látku, a to ve stejných koncentracích jako v roztocích obsahujících jen jednu látku.
Požaduje­li se stanovení fyzikálně­chemické spotřeby kyslíku, připraví se roztok zkušební látky obvykle o koncentraci 100 mg TSK na litr sterilizovaný přídavkem vhodné toxické látky (viz I.6.6).
Připravené objemy roztoků zkušební a referenční chemické látky se rozdělí alespoň duplicitně do baněk. Do dalších baněk se přidá pouze minerální médium (pro kontrolu inokula) a podle potřeby směs roztoku zkušební a referenční chemické látky a sterilní roztok.
Je­li zkušební chemická látka špatně rozpustná, odváží se nebo odměří v tomto stádiu přímo do baněk, nebo se postupuje podle přílohy III. Do lahví pro absorpci CO
2
se přidá hydroxid draselný, pelety hydroxidu sodného nebo jiný absorbent.
IVD.2.5 Počet baněk v typické zkoušce
Baňka 1 a 2: Zkušební suspense
Baňka 3 a 4: Slepá zkouška s inokulem
Baňka 5: Kontrolní zkouška postupu
Dále se doporučují se nebo se podle potřeby použijí:
Baňka 6: Sterilní kontrola
Baňka 7: Kontrola toxicity
Viz také bod I.6.7.
IVD.2.6 Provedení zkoušky
V baňkách se nechá ustavit požadovaná teplota a vybrané baňky se inokulují přidáním aktivovaného kalu nebo jiného zdroje inokula, aby nebyla koncentrace suspendovaných látek větší než 30 mg·l
-1
. Zařízení se sestaví, spustí se míchačka, přezkouší se na vzduchotěsnost a zahájí se měření spotřeby kyslíku. Obvykle není třeba věnovat zkoušce žádnou zvláštní pozornost, kromě nezbytných odečtů a denní kontroly teploty a míchání.
Z pravidelných častých odečtů se podle postupu uvedeného výrobcem zařízení vypočte spotřeba kyslíku. Na konci inkubace, obvykle po 28 dnech, se změří pH v baňkách, a to zvláště tehdy, je­li spotřeba kyslíku malá nebo větší než TSK
NH4
(platí pro látky obsahující dusík).
V případě potřeby se na začátku a na konci odebírá vzorek z respiračních nádobek pro stanovení DOC nebo pro specifickou analýzu (viz příloha II, bod 4). Při počátečním odběru z baňky se zajistí, aby byl znám objem zkušební suspense, která v baňce zůstala. Je­li kyslík spotřebováván látkami obsahujícími dusík, stanoví se přírůstek koncentrací dusičnanů a dusitanů za 28 dnů a vypočte se korekce na spotřebu kyslíku nitrifikací (příloha V).
IVD.3 DATA A ZPRÁVY
IVD.3.1 Zpracování výsledků
Spotřeba kyslíku (mg) zkušební látkou za danou dobu (korigovaná na spotřebu kyslíku inokulem za stejnou dobu ve slepé zkoušce) se podělí hmotností zkušební látky v baňce. Získá se tak hodnota BSK vyjádřená v mg kyslíku na mg zkušební látky:
    



       spotř. O
2
zk. chem. látkou v mg - spotř. O
2
ve slep. zkoušce v mg BSK = ------------------------------------------------------------------ hmotnost zkušební chem. látky v baňce v mg = mg O
2
na mg zkušební chemické látky. Biologický rozklad v procentech se vypočte buď z rovnice: BSK (mg O
2
na mg chem. látky) biolog. rozklad v % = % TSK = ------------------------------ x 100 TSK (mg O
2
na mg chem. látky) nebo z rovnice: BSK (mg O
2
na mg chem. látky) % COD = ------------------------------ x 100. COD (mg O
2
na mg chem. látky)
Je třeba poznamenat, že tyto dvě metody nemusí poskytovat stejné hodnoty; přednost se dává první metodě.
Pro látky, jež obsahují dusík, se použije vhodná hodnota TSK (pro NH
4
nebo NO
3
) podle toho, zda se očekává nitrifikace, či nikoli (příloha II, bod 2).
Jestliže k nitrifikaci dochází, avšak není úplná, vypočte se korekce na spotřebu kyslíku při nitrifikaci ze změn koncentrace dusitanů a dusičnanů (příloha V).
V případě, že se provádí nepovinné stanovení organického uhlíku a/nebo specifické chemické látky, vypočte se stupeň rozkladu podle bodu I.7.
Všechny výsledky se zaznamenají do příslušného formuláře přehledu dat.
IVD.3.2 Platnost výsledků
Obvyklá spotřeba kyslíku inokulem je 20 – 30 mg O
2
na litr a neměla by být větší než 60 mg*l
-1
za 28 dnů. Hodnoty větší než 60 mg*l
-1
vyžadují kritické přehodnocení výsledků a experimentální techniky. Je­li pH mimo rozpětí 6 – 8,5 a spotřeba kyslíku zkušební látkou je menší než 60 %, měla by být zkouška opakována s nižší koncentrací zkušební látky.
Viz také I.5.2.
IVD.3.3 Zprávy
Viz I.8.
IVD.4 PŘEHLED DAT
       Dále je uveden příklad přehledu dat:
       ZKOUŠKA MANOMETRICKOU RESPIROMETRIÍ

       1. LABORATOŘ

       2. DATUM ZAHÁJENÍ ZKOUŠKY

       3. ZKUŠEBNÍ LÁTKA
             Název:
             Koncentrace zásobního roztoku: mg*l
-1
Počáteční koncentrace v médiu, C0: mg*l
-1
Objem zkušební baňky (V): ml TSK nebo CHSK: v mg O
2
na mg zkušební látky (NH
4
, NO
3
): 4. INOKULUM Zdroj: Provedená úprava: Předběžná úprava, pokud byla provedena: Koncentrace suspendovaných látek v reakční směsi: mg*l
­1
5. SPOTŘEBA KYSLÍKU: BIOLOGICKÁ ROZLOŽITELNOST ----------------------------------------------------------------- Čas (dny) 0 7 14 21 28 ----------------------------------------------------------------- Spotřeba O
2
1 (mg) zkušební látkou 2 a,průměr ----------------------------------------------------------------- Spotřeba O
2
3 (mg) ve slepé zkoušce 4 b,průměr ----------------------------------------------------------------- Korigovaná (a
1
-b
m
) BSK (mg) (a
2
-b
m
) ----------------------------------------------------------------- BSK na mg zkušební látky ----------------------------------------------------------------- Rozklad v % D
1
(a
1
) BSK D
2
--- x 100 (a
2
) TSK Průměr* ----------------------------------------------------------------- V = objem média ve zkušební baňce * Hodnoty D
1
a D
2
by neměly být průměrovány, je­li mezi nimi výrazný rozdíl. Poznámka: Podobný formulář lze použít i pro referenční látku a pro kontroly toxicity. 6. KOREKCE NA NITRIFIKACI (viz příloha V) ----------------------------------------------------------------------------- Den 0 28 Rozdíl i) Koncentrace dusičnanů (mg N na litr) (N) ii) Kyslíkový ekvivalent (4,57 × N × V) (mg) — — iii) Koncentrace dusitanů (mg N na litr) (N) iv) Kyslíkový ekvivalent (3,43 × N × V) (mg) — — ii + iv) Celkový kyslíkový ekvivalent — — ----------------------------------------------------------------------------- 7. ANALÝZA UHLÍKU (podle volby) Analyzátor uhlíku: ----------------------------------------------- Čas (dny) Slepá zkouška Zkušební látka (mg*l
-1
) (mg*l
-1
) ----------------------------------------------- 0 (C
bl(0)
) (C
0
) 28* (C
bl(t)
) (C
t
) ----------------------------------------------- * nebo na konci inkubace 8. SPECIFICKÁ ANALÝZA (nepovinné) S
b
= koncentrace ve fyzikálně­chemické kontrole (sterilní) po 28 dnech, S
a
= koncentrace v inokulované baňce po 28 dnech. 9. ABIOTICKÝ ROZKLAD (nepovinné) a = spotřeba kyslíku ve sterilních baňkách po 28 dnech v mg, a spotřeba kyslíku na mg zkušební chemické látky = ------- C
0
V (viz oddíl 1 a 3) a x 100 abiotický rozklad v % = ----------------------. C
0
V x TSK
IVE. METODA PRO STANOVENí „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI POMOCÍ ZKOUŠKY V UZAVŘENÝCH LAHVIČKÁCH – METODA C.4-E PODLE PŘÍLOHY SMĚRNICE 92/69/EHS
IVE.1. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Roztok zkušební látky v minerálním médiu, obvykle o koncentraci 2 až 5 mg·l
-1
, se inokuluje malým množstvím mikroorganismů ze směsné kultury a udržuje se ve zcela naplněných uzavřených lahvičkách, v temnu a při konstantní teplotě. Rozklad se sleduje po dobu 28 dnů prostřednictvím analýzy rozpuštěného kyslíku. Množství spotřebovaného kyslíku po korekci na souběžnou slepou zkoušku s inokulem se vyjádří jako TSK nebo CHSK.
IVE.2 POPIS METODY
IVE.2.1 Přístroje a pomůcky
a) Lahve pro analýzu BSK se skleněnými zátkami, např. na 250 – 300 ml.
b) Vodní lázeň nebo inkubátor pro udržování lahviček při konstantní teplotě (tolerance +/-1 st.C nebo menší) v temnu.
c) Velké skleněné lahve na 2 – 5 1 pro přípravu média a pro naplnění lahviček pro analýzu BSK.
d) Kyslíková elektroda a oxymetr nebo vybavení a činidla pro Winklerovu titrační metodu.
IVE.2.2 Příprava minerálního média
Příprava zásobních roztoků je popsána v části I.6.2. Smísí se po 1 ml roztoků a) až d) a doplní se vodou na 1 litr.
IVE.2.3 Příprava inokula
Inokulum se obvykle získává z výstupu z druhého stupně čistírny odpadních vod nebo laboratorní jednotky zpracovávající převážně domovní odpadní vody. Alternativním zdrojem inokula může být povrchová voda. Obvykle se použije jedna kapka (0,05 ml) až 5 ml filtrátu na litr média; k nalezení optimálního objemu dané odpadní vody může být nezbytné provést pokusy (viz I.6.4.2 a I.6.5).
IVE.2.4 Příprava lahviček
Minerální médium se alespoň 20 min silně provzdušňuje. Všechny série zkoušek se provedou s minerálním médiem ze stejné dávky. Obecně je médium připraveno k použití po 20 h stání při zkušební teplotě. Pro kontrolu se stanoví obsah kyslíku v médiu; jeho obsah by měl být asi 9 mg·l
-1
při 20 st.C. Všechny operace přenosu média nasyceného vzduchem a jeho plnění se provedou tak, aby nevznikaly bublinky, např. pomocí nasávaček. Připravují se shodné skupiny lahviček pro analýzu BSK pro stanovení se zkušební látkou a referenční látkou v souběžných sériích experimentů. Připraví se dostatečný počet lahviček, včetně slepých pokusů, tak, aby v každém zvoleném časovém intervalu, např. 0, 7, 14, 21 a 28 dnů, bylo možné provést alespoň dvě měření spotřeby kyslíku. K tomu, aby bylo možné rozpoznat 10denní období rozkladu, může být potřeba více lahviček.
Velké lahve se přibližně do jedné třetiny naplní provzdušněným médiem. Poté se zvlášť do jednotlivých velkých lahví přidá dostatečný objem zásobního roztoku zkušební látky a referenční látky, a to obvykle tak, aby nebyla konečná koncentrace chemických látek větší než 10 mg·l-1. Ke slepému pokusu v další velké lahvi se nepřidávají žádné chemické látky.
S cílem zajistit, aby aktivita inokula nebyla omezená, nesmí koncentrace kyslíku v lahvičkách pro analýzu BSK klesnout pod 0,5 mg·l
-1
. Toto omezuje koncentraci zkušební látky na 2 mg*l-1. Pro látky, které se špatně rozkládají, a pro látky s nízkou hodnotou TSK lze použít koncentraci 5 - 10 mg*l
-1
. V některých případech se doporučuje provést souběžné série měření při dvou různých koncentracích zkušební látky, např. při 2 a 5 mg*l
-1
. Obvykle se TSK počítá na základě tvorby amonných solí, ale v případech, kdy se předpokládá nitrifikace nebo kdy dochází k nitrifikaci, se TSK vypočte na základě tvorby dusičnanů (TSKNO
3
, viz příloha II, bod 2). V případech, kdy nitrifikace není úplná, se provede korekce na změny analyticky stanovených koncentrací dusitanů a dusičnanů (viz příloha V).
Má­li být vyšetřena toxicita zkušební látky (např. v případě dříve zjištěné nízké biologické rozložitelnosti), je nezbytné nasadit další sérii lahviček.
Připraví se další velká láhev s provzdušněným minerálním médiem (naplněná asi do jedné třetiny objemu), do které se přidá zkušební a referenční chemická látka o konečné koncentraci obvykle stejné jako v případě ostatních velkých lahví.
Roztoky ve velkých lahvích se inokulují výstupem z druhého stupně čistírny odpadních vod (jedna kapka nebo 0,05 až 5 ml·l
-1
) nebo z jiného zdroje inokula, jako je např. říční voda (viz I.6.4.2). Nakonec se lahve doplní na objem provzdušněným minerálním médiem za použití hadičky, která sahá na dno, aby se dosáhlo dostatečného promíchání.
IVE.2.5 Počet lahviček v typické zkoušce V typické zkoušce se použijí následující lahvičky:
nejméně 10 lahviček se zkušební látkou a inokulem (zkušební suspense),
nejméně 10 lahviček pouze s inokulem (slepá zkouška s inokulem),
nejméně 10 lahviček s referenční látkou a inokulem (kontrolní zkouška postupu),
a podle potřeby 6 lahviček se zkoušenou látkou, referenční látkou a inokulem (kontrola toxicity). Pro rozpoznání 10denního období rozkladu je však potřebný dvojnásobný počet lahviček.
IVE.2.6 Provedení zkoušky
Všechny připravené roztoky se ihned po přípravě rozdělí do příslušné skupiny lahviček pro analýzu BSK, a to pomocí hadičky zavedené do spodní čtvrtiny velké lahve (nikoliv ke dnu) tak, aby se všechny lahvičky pro analýzu BSK zcela naplnily. Jemně se poklepe, aby se odstranily bublinky. V lahvičkách se Winklerovou metodou nebo pomocí oxymetru ihned stanoví obsah rozpuštěného kyslíku k počátku zkoušky (k času nula). Obsah lahviček lze konzervovat pro pozdější analýzu přídavkem síranu manganatého a hydroxidu sodného (prvním Winklerovým činidlem). Před provedením zbývajících kroků Winklerovy metody se pečlivě uzavřené lahvičky obsahující kyslík vázaný ve formě hydratovaného oxidu manganitého skladují v temnu nejdéle 24 h při teplotě 10 – 20 st.C. Zbývající souběžně připravené lahvičky se uzavřou tak, aby v nich nezůstaly bublinky vzduchu, a inkubují se v temnu při 20 st.C. Každá série musí být doprovázena úplnou sérií slepého pokusu s inokulovaným médiem. Ve všech sériích se během 28 dnů inkubace v pravidelných intervalech (nejméně jednou týdně) stanoví alespoň ve dvou lahvičkách obsah rozpuštěného kyslíku.
Týdenní vzorky umožní stanovení rozkladu v procentech ve 14denním období rozkladu, zatímco vzorky odebírané každé 3 – 4 dny umožní rozpoznat 10denní období rozkladu, což vyžaduje dvojnásobný počet lahviček. U látek obsahujících dusík se provede korekce na spotřebu kyslíku při nitrifikaci. K tomuto účelu se stanoví koncentrace rozpuštěného kyslíku oxymetrem a poté se z lahvičky pro analýzu BSK odebere vzorek pro stanovení dusitanů a dusičnanů. Z přírůstku koncentrace dusitanů a dusičnanů se vypočte množství spotřebovaného kyslíku (viz příloha V).
IVE.3 DATA A ZPRÁVY
IVE.3.1 Zpracování výsledků Nejprve se vypočte BSK, ke které došlo po každé časové periodě, a to odečtením spotřeby kyslíku (v mg O
2
na litr) ve slepém pokusu s inokulem od spotřeby zkušební chemickou látkou. Takto korigovaná spotřeba se vydělí koncentrací zkušební látky (mg*l
-1
) a získá se specifická BSK v mg kyslíku na mg zkušební látky. Biologická rozložitelnost v procentech se vypočte jako podíl specifické BSK a specifické TSK (vypočtené podle přílohy II, bodu 2) nebo CHSK (stanovené analyticky, viz příloha II, bod 3), tedy:
      

      spotř. O
2
zk. chem. látkou v mg - spotř. O
2
ve slep. pokusu v mg BSK = ----------------------------------------------------------------- hmotnost zkušební chem. látky v baňce v mg = mg O
2
na mg zkušební chemické látky. BSK (mg O
2
na mg zkušeb. chem. látky) rozklad v % = -------------------------------------- x 100 TSK (mg O
2
na mg zkušeb. chem. látky) nebo BSK (mg O
2
na mg zkušeb. chem. látky) rozklad c % = -------------------------------------- x 100 COD (mg O
2
na mg zkušeb. chem. látky)
Je třeba poznamenat, že tyto dvě metody nemusí poskytovat stejné hodnoty; přednost se dává první metodě.
Pro látky, jež obsahují dusík, se použije odpovídající hodnota TSK (pro NH
4
nebo NO
3
) podle toho, zda se očekává nitrifikace, či nikoli (příloha II, bod 2). Jestliže k nitrifikaci dochází, avšak není úplná, vypočte se korekce na spotřebu kyslíku při nitrifikaci ze změn koncentrace dusitanů a dusičnanů (příloha V).
IVE.3.2 Platnost výsledků
Spotřeba kyslíku ve slepém pokusu s inokulem by neměla být po 28 dnech vyšší než 1,5 mg·l
-1
. Vyšší hodnoty vyžadují přešetření experimentální techniky. Zbytková koncentrace kyslíku ve zkušebních lahvičkách by neměla nikdy klesnout pod 0,5 mg*l
-1
. Takto nízké úrovně kyslíku jsou platné pouze tehdy, lze­li použitou metodou stanovení rozpuštěného kyslíku tak nízké úrovně přesně změřit.
Viz také I.5.2.
IVE.3.3 Zprávy
Viz I.8.
IVE.4 PŘEHLED DAT
       Dále je uveden příklad přehledu dat:
       ZKOUŠKA V UZAVŘENÝCH LAHVIČKÁCH

       1. LABORATOŘ

       2. DATUM ZAHÁJENÍ ZKOUŠKY

       3. ZKUŠEBNÍ LÁTKA
             Název:
             Koncentrace zásobního roztoku: mg*l
-1
Počáteční koncentrace v lahvičce: mg*l
-1
TSK nebo CHSK: v mg O
2
na mg zkušební látky 4. INOKULUM Zdroj: Provedená úprava: Předběžná úprava, pokud byla provedena: Koncentrace v reakční směsi: mg*l
­1
5. STANOVENÍ ROZPUŠTĚNÉHO KYSLÍKU: Metoda: Winklerova metoda / oxymetr Analýzy lahviček -------------------------------------------------- Doba kultivace (d) Rozpuštěný kyslík (mg*l
-1
) -------------------------------------------------- 0 n
1
n
2
Slepá 1 C
1
zkouška (bez chemické látky) 2 C
2
Průměr Zkušební 1 a
1
chemická látka 2 a
2
Průměr a
1
+ a
2
m1 = ----------- 2 -------------------------------------------------- Poznámka: podobný formulář lze použít i pro referenční látku a pro kontroly toxicity. 6. KOREKCE NA NITRIFIKACI (viz příloha V) ------------------------------------------------------ Doba kultivace 0 n
1
n
2
n
3
------------------------------------------------------ i) Koncentrace dusičnanů (mg N na litr) ii) Změna koncentrace dusičnanů — (mg N na litr) iii) Kyslíkový ekvivalent (mg*l
-1
) — iv) Koncentrace dusitanů (mg N na litr) v) Změna koncentrace dusitanů — (mg N na litr) vi) Kyslíkový ekvivalent (mg*l
-1
) — iii + vi) Celkový kyslíkový — ekvivalent (mg*l
-1
) ------------------------------------------------------ 7. ÚBYTEK ROZPUŠTĚNÉHO KYSLÍKU: ROZKLAD V PROCENTECH ----------------------------------------------------------------- Úbytek po n dnech (mg.l
-1
) ----------------------------------------------------------------- n1 n2 n3 ----------------------------------------------------------------- Lahvička 1: (m
t0
- m
tx
) - (m
b0
- m
bx
) ----------------------------------------------------------------- Lahvička 2: (m
t0
- m
tx
) - (m
b0
- m
bx
) ----------------------------------------------------------------- Lahvička 1: [(m
t0
- m
tx
) - (m
b0
- m
bx
)] x 100 % D1 = --------------------------------- konc. zkuš. chem. látky x TSK ----------------------------------------------------------------- Lahvička 2: [(m
t0
- m
tx
) - (m
b0
- m
bx
)] x 100 % D2 = --------------------------------- konc. zkuš. chem. látky x TSK ----------------------------------------------------------------- D
1
- D
2
průměr*) % D = ------- 2 ----------------------------------------------------------------- * Hodnoty nelze průměrovat, je­li mezi nimi výrazný rozdíl. m
t0
= hodnota pro zkušební lahvičku v čase 0 m
tx
= hodnota pro zkušební lahvičku v čase x m
b0
= hodnota pro slepý pokus v čase 0 m
bx
= hodnota pro slepý pokus v čase x Použijí se rovněž korekce na nitrifikaci z bodu iii + vi v oddílu 6. 8. ÚBYTEK ROZPUŠTĚNÉHO KYSLÍKU VE SLEPÉM POKUSU Spotřeba kyslíku ve slepém pokusu je (m
b0
- m
b28
) v mg*l
-1
. Tato spotřeba je důležitá pro platnost zkoušky. Měla by být menší než 1,5 mg*l
-1
.
IVF. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI POMOCÍ ZKOUŠKY MITI – METODA C.4-F PODLE PŘÍLOHY SMĚRNICE 92/69/EHS
IVF.1 PODSTATA METODY
Měření spotřeby kyslíku v míchaném roztoku nebo suspensi zkušební chemické látky v minerálním médiu inokulovaném speciální kulturou neadaptovaných mikroorganismů se provádí automaticky po dobu 28 dnů za tmy v uzavřeném respirometru při 25 +/- 1 st.C. Uvolňovaný oxid uhličitý se jímá v hydroxidu sodném. Biologická rozložitelnost se vyjádří jako spotřeba kyslíku (korigovaná na slepý pokus) vyjádřená v procentech teoretické spotřeby kyslíku (TSK). Primární biologická rozložitelnost vyjádřená v procentech se rovněž vypočte z doplňkové specifické chemické analýzy provedené na začátku a na konci kultivace, popřípadě z analýzy DOC.
IVF.2 POPIS METODY
IVF.2.1 Přístroje a pomůcky
a) automatický elektrolytický měřič BSK nebo respirometr standardně vybavený 6 baňkami na 300 ml opatřenými uzávěry obsahujícími absorbent CO
2
;
b) místnost s konstantní teplotou nebo vodní lázeň nastavená na 25 +/- 1 st.C;
c) zařízení pro membránovou filtraci (nepovinné);
d) analyzátor uhlíku (nepovinné).
IVF.2.2 Příprava minerálního média
    
        a)  Dihydrogenfosforečnan draselný, KH
2
PO
4
8,50 Hydrogenfosforečnan didraselný, K
2
HPO
4
21,75 g Hydrogenfosforečnan disodný dodekahydrát, Na
2
HPO
4
*12H
2
O 44,60 g Chlorid amonný, NH
4
Cl 1,70 g Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr. pH roztoku musí být 7,2. b) Síran hořečnatý heptahydrát, MgSO
4
*7H
2
O 22,50 g Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr. c) Chlorid vápenatý bezvodý, CaCl
2
27,50 g Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr. d) Chlorid železitý hexahydrát, FeCl
3
*6H
2
O 0,25 g Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr. Spojí se po 3 ml roztoků a), b), c), a d) a doplní se na 1 litr.
IVF.2.3 Příprava inokula
Odeberou se čerstvé vzorky nejméně z deseti lokalit, kde se používají a vypouštějí různé chemické látky. Z míst, jako jsou čistírny městských a průmyslových odpadních vod, řeky, jezera a moře se odeberou litrové vzorky kalu, povrchových půd, vody atd., které se pečlivě smíchají. Po odstranění vyplavených látek a ustálení se pH supernatantu upraví na 7 +/- 1 hydroxidem sodným nebo kyselinou fosforečnou.
Vhodným objemem filtrovaného supernatantu se naplní nádoba na aktivaci kalu a kapalina se 23˝ h provzdušňuje. Třicet minut po ukončení provzdušňování se odlije přibližně jedna třetina celkového objemu supernatantu a k usazenému materiálu se přidá stejný objem roztoku (pH 7), který obsahuje vždy po 0,1 % glukosy, peptonu a dihydrogenfosforečnanu draselného, a obnoví se provzdušňování. Tento postup se opakuje jednou denně. Kalová jednotka musí být provozovaná podle zásad správné laboratorní praxe: odtok má být čirý, teplota má být udržována při 25 +/- 2 st.C, pH má být 7 +/- l, kal se má dobře usazovat, provzdušňování musí být za všech okolností dostatečné, mají být přítomni prvoci a aktivita kalu se má kontrolovat pomocí referenční látky nejméně každé tři měsíce. Inokulum se nepoužívá dříve než po 1 měsíci kultivace, ale ne později než po čtyřech měsících. Proto se v pravidelných intervalech jednou za tři měsíce odebírají vzorky z 10 míst.
K udržení stejné aktivity čerstvého a starého kalu se filtrovaný supernatant aktivovaného použitého kalu mísí se stejným objemem filtrovaného supernatantu čerstvě odebraného kalu pocházejícího z deseti zdrojů a směs se kultivuje podle výše uvedeného postupu. Kal se použije jako inokulum až 18 – 24 h po uvedeném zpracování.
IVF.2.4 Příprava baněk
Připraví se následujících 6 baněk:
Baňka č. 1: zkušební chemická látka v ředicí vodě, 100 mg*l
-1
Baňky č. 2, 3, 4: zkušební chemická látka v minerálním médiu, 100 mg*l
-1
Baňka č. 5: referenční látka (např. anilin) v minerálním médiu, 100 mg*l
-1
Baňka č. 6: pouze minerální médium
Špatně rozpustné chemické látky se odváží nebo odměří, nebo se zpracují podle přílohy III, s výjimkou těch, u nichž nesmějí být použita rozpouštědla ani emulgátory. Do speciálních uzávěrů všech lahví se přidá absorbent oxidu uhličitého. pH v baňkách č. 2, 3 a 4 se upraví na 7,0.
IVF.2.5 Provedení zkoušky
Baňky č. 2, 3, 4 (zkušební suspense), č. 5 (kontrola aktivity), č. 6 (slepý pokus s inokulem) se inokulují malým množstvím inokula tak, aby byla výsledná koncentrace kalu 30 mg·l
-1
. Do lahve č. 1 se inokulum nepřidává, slouží jako abiotická kontrola. Zařízení se sestaví, přezkouší se na vzduchotěsnost, spustí se míchačka a v temnu se zahájí měření spotřeby kyslíku. Denně se kontroluje teplota, míchání, coulometrický zapisovač spotřeby kyslíku a zaznamenají se všechny změny barvy obsahu baněk. Spotřeba kyslíku pro 6 baněk se odečítá přímo, např. šestikanálovým zapisovačem, čímž se získá křivka BSK. Na konci kultivace, obvykle po 28 dnech, se změří pH v baňkách a stanoví se zbytková koncentrace zkušební chemické látky a jejích produktů rozkladu a v případě zkoušení látek rozpustných ve vodě také koncentrace DOC (postup podle přílohy II, bodu 4). Zvláštní pozornost je třeba věnovat těkavým látkám. Pokud se předpokládá nitrifikace, stanoví se podle možnosti koncentrace dusičnanů a dusitanů.
IVF.3 DATA A ZPRÁVY
IVF.3.1 Zpracování výsledků Spotřeba kyslíku (mg) zkušební látkou za danou dobu (korigovaná na spotřebu inokulem za stejnou dobu ve slepém pokusu) se podělí hmotností použité zkušební látky. Získá se tak hodnota BSK vyjádřená v mg kyslíku na mg zkušební látky:
       
      spotř. O
2
zk. chem. látkou v mg - spotř. O
2
ve slepé zkoušce v mg BSK = ----------------------------------------------------------------- hmotnost zkušební chem. látky v baňce v mg = mg O
2
na mg zkušební chemické látky. Biologický rozklad v procentech se vypočte buď z rovnice: BSK (mg O
2
na mg chem. látky) biolog. rozklad v % = % TSK = ----------------------------- x 100. TSK (mg O
2
na mg chem. látky) Pro směsi se TSK vypočte z elementární analýzy, tak jako pro jednoduché sloučeniny. Použije se odpovídající hodnota TSK (TSK
NH4
nebo TSK
NO3
) podle toho, zda se očekává nitrifikace, či nikoli (příloha II, bod 2). Jestliže k nitrifikaci dochází, avšak není úplná, vypočte se korekce na spotřebu kyslíku při nitrifikaci ze změn koncentrace dusitanů a dusičnanů (příloha V). Vypočte se primární biologický rozklad v procentech z úbytku specifické (výchozí) chemické látky (viz I.7.2): S
b
- S
a
Dt = ------- x 100 S
b
Zjistí-li se při měření fyzikálně-chemického úbytku ztráta zkušební chemické látky v baňce č. 1, zaznamená se to a jako koncentrace zkušební látky (Sb) po 28 dnech se pro výpočet biologické rozložitelnosti dosadí tato koncentrace. Stanovuje-li se koncentrace DOC (nepovinné), vypočte se konečná hodnota biologického rozkladu v procentech podle vztahu: C
1
- C
bt
Dt = (1 - --------) x 100 C
0
- C
b0
jak je uvedeno v bodě I.7.1. Zjistí­li se při měření fyzikálně-chemického úbytku ztráta DOC v baňce č. 1, použije se při výpočtu biologického rozkladu v procentech tato koncentrace DOC. Všechny výsledky se zaznamenají do přehledu dat.
IVF.3.2 Platnost výsledků
Obvyklá spotřeba kyslíku inokulem je 20 – 30 mg O
2
na litr a neměla by být větší než 60 mg*l
-1
za 28 dnů. Hodnoty větší než 60 mg*l
-1
vyžadují kritické přehodnocení výsledků a experimentální techniky. Je­li pH mimo rozpětí 6 – 8,5 a spotřeba kyslíku zkušební látkou je menší než 60 %, měla by být zkouška opakována s nižší koncentrací zkušební látky.
Viz také I.5.2.
V případě, že rozklad anilinu vypočtený ze spotřeby kyslíku nepřekročí po 7 dnech 40 % a po 14 dnech 65 %, považuje se zkouška za neplatnou.
IVF.3.3 Zprávy
Viz I.8.
IVF.4 PŘEHLED DAT
      Dále je uveden příklad přehledu dat:
       ZKOUŠKA MITI (I)

       1. LABORATOŘ

       2. DATUM ZAHÁJENÍ ZKOUŠKY

       3. ZKUŠEBNÍ LÁTKA
             Název:
             Koncentrace  chemické látky  v  zásobním  roztoku:
             mg*l
-1
Počáteční koncentrace chemické látky v médiu, C0: mg*l
-1
Objem reakční směsi, V: ml TSK: mg O
2
na litr 4. INOKULUM Místa odběru kalu: 1)... 6)... 2)... 7)... 3)... 8)... 4)... 9)... 5)... 10)... Koncentrace suspendovaných látek v aktivovaném kalu po aklimatizaci se syntetickými splašky = ... mg*l
-1
. Objem aktivovaného kalu v litru konečného média = ... ml Koncentrace kalu v konečném médiu = ... mg*l
-1
5. SPOTŘEBA KYSLÍKU: BIOLOGICKÁ ROZLOŽITELNOST Typ použitého respirometru: --------------------------------------------------- Čas (dny) 0 7 14 21 28 --------------------------------------------------- Spotřeba O
2
a
1
(mg) zkušební látkou a
2
a
3
--------------------------------------------------- Spotřeba O
2
b
(mg) ve slepé zkoušce --------------------------------------------------- Korigovaná (a
1
- b) spotřeba O
2
(a
2
- b) (mg) (a
3
- b) --------------------------------------------------- BSK na mg (a-b) Baňka zkušební ---- 1 látky C
0
V Baňka 2 Baňka 3 --------------------------------------------------- Rozklad v % 1 2 3 Průměr* --------------------------------------------------- Poznámka: podobný formulář lze použít i pro referenční látku. * Hodnoty nelze průměrovat, je­li mezi nimi výrazný rozdíl. 6. ANALÝZA UHLÍKU (podle volby) Analyzátor uhlíku: -------------------------------------------------------- Baňka DOC úbytek Průměr DOC v % -------------------------------------------------------- Naměřená Korigovaná hodnota hodnota -------------------------------------------------------- Voda + a — — zkušební látka Kal + b
1
b
1
- c zkušební látka Kal + b
2
b
2
- c zkušební látka Kal + b
3
b
3
- c zkušební látka Kontrolní c — — — slepá zkouška -------------------------------------------------------- 7. DATA ZE SPECIFICKÉ CHEMICKÉ ANALÝZY -------------------------------------------------------- Zbytkové množství Rozklad zkušební chemické v % látky na konci zkoušky -------------------------------------------------------- Slepá zkouška S
b
s vodou -------------------------------------------------------- Inokulované S
a1
médium S
a2
S
a3
-------------------------------------------------------- S
b
- S
a
rozklad v % = ------- x 100 S
b
Rozklad v % se vypočte pro baňky a
1
, a
2
, a
3
. 8. POZNÁMKY Připojí se křivka závislosti BSK na čase, je­li k dispozici.
PŘÍLOHA I
ZKRATKY A DEFINICE
DO: Rozpuštěný kyslík (dissolved oxygen) (mg*l
-1
) je koncentrace kyslíku, který je rozpuštěn ve vodném vzorku.
BSK: Biochemická spotřeba kyslíku (biochemical oxygen demand, BOD) (g) je množství kyslíku, jež je v průběhu metabolizace zkušební látky spotřebováno mikroorganismy; vyjadřuje se také jako spotřeba kyslíku v gramech na gram zkušební látky. (Viz metoda C.5).
CHSK: Chemická spotřeba kyslíku (chemical oxygen demand, COD) (g) je množství kyslíku, jež je spotřebováno v průběhu oxidace zkušební látky horkým kyselým dichromanem; je měřítkem množství přítomných oxidovatelných látek; vyjadřuje se také v gramech kyslíku spotřebovaného na gram zkušební látky. (Viz metoda C.6).
DOC: Rozpuštěný organický uhlík (dissolved organic carbon) je celkový organický uhlík, který je přítomný v roztoku nebo projde přes filtr o velikosti pórů 0,45 µm nebo zůstane v supernatantu po odstřeďování po dobu 15 min při zrychlení 40 000 m*s?2 (asi 4 000 g).
TSK: Teoretická spotřeba kyslíku (theoretical oxygen demand, ThOD) (mg) je celkové množství kyslíku nezbytné pro úplnou oxidaci chemické látky; vypočte se z molekulového vzorce látky (viz příloha II, bod 2) a vyjadřuje se také jako množství kyslíku v mg nezbytné na mg zkušební látky.
TCO
2
: Teoretický oxid uhličitý (theoretical carbon dioxide, ThCO
2
) je množství oxidu uhličitého, které by mělo vzniknout ze známého nebo změřeného obsahu uhlíku ve zkušební látce za předpokladu její úplné mineralizace; vyjadřuje se v mg oxidu uhličitého uvolněného z 1 mg zkušební látky.
TOC: Celkový organický uhlík (total organic carbon) ve vzorku je součtem organického uhlíku v roztoku a v suspensi. IC: Anorganický uhlík (inorganic carbon).
TC: Celkový uhlík (total carbon) je součtem organického a anorganického uhlíku ve vzorku.
Primární biologický rozklad:
jsou změny chemické struktury látky způsobené biologickým působením, vedoucí ke ztrátě specifických vlastnosti látky.
Úplný biologický rozklad (aerobní):
je stupeň rozkladu látky dosažený po jejím úplném zužitkování mikroorganismy, vedoucí k produkci oxidu uhličitého, vody, minerálních solí a nové mikrobiální buněčné hmoty (biomasy).
Snadno biologicky rozložitelná:
je dohodnutá klasifikace chemických látek, které prošly screeningovými zkouškami úplné biologické rozložitelnosti; tyto zkoušky jsou tak přísné, že lze předpokládat, že se látky budou ve vodném prostředí za aerobních podmínek rychle a úplně biologicky rozkládat.
Biologicky rozložitelná:
je klasifikace chemických látek, pro něž existuje nepochybný důkaz o jejich biologické rozložitelnosti (primární nebo konečné) v kterékoli uznávané zkoušce biologické rozložitelnosti.
Odstranitelnost:
je náklonnost látek k jejich odstranění při biologickém čištění odpadních vod, aniž by byl nepříznivě ovlivněn normální průběh čisticích pochodů. Látky snadno biologicky rozložitelné jsou obecně odstranitelné, avšak ne všechny rozložitelné látky jsou odstranitelné. Mohou zde působit také abiotické procesy.
Fáze iniciace:
je doba, ve zkoušce na úbytek rozpuštěného organického uhlíku, od inokulace do dosažení alespoň 10% biologického rozkladu. Fáze iniciace je často různě dlouhá a špatně reprodukovatelná.
Doba rozkladu:
je doba od konce fáze zdržení do dosažení 90 % maximální dosažitelné úrovně rozkladu.
10denní období rozkladu:
je 10 dnů, které následují bezprostředně po dosažení 10% rozkladu.
PŘÍLOHA II
VÝPOČET A STANOVENÍ NĚKTERÝCH SOUHRNNÝCH PARAMETRŮ
V závislosti na zvolené zkušební metodě se vyžaduje určení některých souhrnných parametrů. V následujícím oddíle je popsán výpočet těchto hodnot. Využití těchto parametrů je popsáno u jednotlivých metod.
1. Obsah uhlíku
Obsah uhlíku se počítá ze známého elementárního složení nebo se stanoví analýzou prvků ve zkušební látce.
2. Teoretická spotřeba kyslíku (TSK)

Teoretickou  spotřebu kyslíku (TSK) lze vypočítat  ze  znalosti
elementárního složení nebo z výsledků analýzy prvků. Pro látku

                     C
c
H
h
Cl
cl
N
n
Na
na
O
o
P
p
S
s
bez nitrifikace, 16[2c + 1/2(h - cl - 3n) + 3s + 5/2p + 1/2na -o] * TSK
NH4
= ------------------------------------------------ v mg/mg M nebo s nitrifikací, 16[2c + 1/2(h - cl) + 5/2n + 3s + 5/2p + 1/2na -o] TSK
NH4
= -------------------------------------------------- M bez nitrifikace, * Poznámka: M je molekulová hmotnost
3. Chemická spotřeba kyslíku (CHSK)
Chemická spotřeba kyslíku (CHSK) se stanoví metodou C.6.
4. Rozpuštěný organický uhlík (DOC)
Rozpuštěným organickým uhlíkem je podle definice organický uhlík přítomný ve vodném roztoku chemické látky nebo směsi, který projde přes filtr o velikosti pórů 0,45 µm.
Odeberou se vzorky ze zkušebních nádob a ihned se filtrují pomocí filtračního zařízení s vhodným membránovým filtrem.
Prvních 20 ml (toto množství může být při použití malých filtrů zmenšeno) se odstraní. 10 ? 20 ml, nebo v případě nástřiku menší objem (objem závisí na množství potřebném pro analýzu), se uschová pro analýzu uhlíku. Koncentrace DOC se stanoví pomocí analyzátoru organického uhlíku, který umožňuje přesné stanovení koncentrace uhlíku, která je menší nebo rovna 10 % počáteční koncentrace DOC použité ve zkoušce.
Zfiltrované vzorky, které není možné analyzovat ve stejný pracovní den, se uchovávají v ledničce 48 h při 2 – 4 st.C nebo delší dobu při teplotě nižší než -18 st.C.
Poznámky:
Membránové filtry jsou často impregnovány povrchově aktivními látkami za účelem jejich hydrofilizace. Filtr tedy může obsahovat až několik mg rozpustného organického uhlíku, který může ovlivnit stanovení biologické rozložitelnosti.
Povrchově aktivní látky a jiné rozpustné organické látky se z filtrů odstraňují vyvařením třikrát jednu hodinu v deionizované vodě. Filtry lze poté skladovat 1 týden ve vodě. Při použití filtračních patron pro jedno použití se musí u každé šarže ověřit, zda neobsahuje rozpustný organický uhlík. V závislosti na typu membránového filtru může docházet k adsorpci zkušební látky na filtru. Doporučuje se ověřit, zda k adsorpci zkušební chemické látky na filtru nedochází.
Místo filtrace lze použít k rozlišení TOC od DOC odstřeďování při 40 000 m·s
-1
(4 000 g) po dobu 15 min. Tato metoda však není spolehlivá při počáteční koncentraci DOC < 10 mg*l
-1
, protože buď nelze odstranit všechny bakterie, nebo se zpětně rozpouští uhlík, který je součástí bakteriální plasmy.
LITERATURA
— Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 12th ed., Am. Publ. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen Demand, 1965, p 65.
— Wagner, R. von Wasser, 1976, vol 46, 139.
— DIN­Entwurf 38 409, Teil 41 – Deutsches Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser- und Schlammuntersuchung, Summarische Wirkungs- und Stoffkenngrössen (Gruppe H). Bestimmung des Chemischen Sauerstoffbedarfs (CSB) (H 41), Normenausschuss Wasserwesen (NAW) in DIN Deutsches Institut für Normung e.V.
— Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, vol 13(1), 169.
PŘÍLOHA III
VYHODNOCENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI ŠPATNĚ ROZPUSTNÝCH LÁTEK
Při zkouškách biologické rozložitelnosti špatně rozpustných látek si zaslouží zvláštní pozornost následující aspekty.
Zatímco odběr vzorků homogenních kapalin je problémem jen zřídka, u tuhých látek se doporučuje provést homogenizaci vhodnými prostředky, aby v důsledku nehomogenity nedošlo k chybám. Zvláštní pozornost musí být věnována odběrům reprezentativních vzorků o několika miligramech ze směsí látek, které obsahují velké množství nečistot.
V průběhu zkoušek lze použít různé způsoby míchání. Je třeba věnovat pozornost tomu, aby míchání bylo přiměřené právě pro udržení látky v disperzi a nedocházelo k přehřívání, nadměrnému pěnění a nadměrným třecím silám.
Může se použít emulgátor vytvářející stabilní disperzi chemické látky. Nesmí být toxický pro bakterie a nesmí se biologicky rozkládat nebo pěnit za zkušebních podmínek.
Stejná kritéria jako pro emulgátory platí i pro rozpouštědla. U tuhých zkušebních látek se nedoporučuje používat tuhé nosiče, mohou však být vhodné v případě olejovitých látek.
Použijí­li se pomocné látky, jako jsou emulgátory, rozpouštědla a nosiče, musí být proveden slepý pokus s pomocnou látkou. Pro studium biologické rozložitelnosti špatně rozpustných látek lze použít kteroukoli ze tří respirometrických zkoušek (zkouška na úbytek CO
2
, na BSK, zkouška MITI).
LITERATURA
— de Morsier, A. et al. Biodegradation tests for poorly soluble compounds. Chemosphere, 1987, 16, 833.
— Gerike, P. The Biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, 13, 169.
PŘÍLOHA IV
VYHODNOCENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI LÁTEK POTENCIÁLNĚ TOXICKÝCH PRO INOKULUM
Je­li chemická látka podrobena zkoušení snadné biologické rozložitelnosti a jeví se jako biologicky nerozložitelná, doporučuje se postupovat při požadavku rozlišit inhibiční působení od odolnosti látky vůči rozkladu následujícím způsobem (Reynolds et al., 1987).
Ve zkouškách toxicity i ve zkouškách biologické rozložitelnosti se použijí podobná nebo stejná inokula.
K posouzení toxicity chemických látek zkoušených ve zkouškách snadné biologické rozložitelnosti se doporučuje použít zkoušku inhibice dýchání aktivovaného kalu (směrnice 88/302/EHS), stanovení BSK nebo metodu inhibice růstu nebo kombinaci těchto metod.
Nemá­li dojít k inhibici z důvodu toxicity, měla by být koncentrace zkušební látky použitá ve zkouškách snadné biologické rozložitelnosti menší než 1/10 hodnoty EC
50
(nebo menší než EC
20
) zjištěné zkouškou toxicity. Látky s EC
50
> 300 mg*l
-1
pravděpodobně nemají při zkouškách snadné biologické rozložitelnosti toxické účinky.
Hodnoty EC
50
< 20 mg*l
-1
mohou při následném zkoušení působit potíže. Měly by být použity nízké koncentrace, což vyžaduje použít přísné a citlivé zkoušky v uzavřených lahvičkách nebo materiál značený 14C. Použití vyšších koncentrací zkušební látky může být popřípadě umožněno nasazením aklimatizovaného inokula. V tomto případě se však ztrácí specifické kritérium zkoušky snadné biologické rozložitelnosti.
LITERATURA
Reynolds, L. et al., Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere, 1987, 16, 2259.
PŘÍLOHA V
KOREKCE NA SPOTŘEBU KYSLÍKU PŘI NITRIFIKACI
Chyby způsobené tím, že při stanovení spotřeby kyslíku ve zkouškách látek, které neobsahují dusík, není vzata v úvahu nitrifikace, nejsou významné (nejsou větší než 5 %), i když je oxidace amoniakálního dusíku ve zkušebních nádobách a ve slepém pokusu nepravidelná. U zkušebních látek obsahujících dusík může dojít ke značným chybám.
Dochází­li k nitrifikaci, avšak nikoli úplné, musí být spotřeba kyslíku reakční směsí korigována na množství kyslíku spotřebovaného na oxidaci amoniaku a amonných iontů na dusitany a dusičnany, jsou­li změny koncentrace dusitanů a dusičnanů během kultivace stanoveny pomocí následujících rovnic:
2 NH
4
Cl + 3 O
2
= 2 HNO
2
+ 2 HCl + 2 H
2
O (1) 2 HNO
2
+ O
2
= 2 HNO
3
(2) Celkově: 2 NH
4
Cl + 4 O
2
= 2 HNO
3
+ 2 HCl + 2 H
2
O (3)
Podle rovnice 1 je spotřeba kyslíku při oxidaci 28 g dusíku obsaženého v NH
4
Cl na dusitan 96 g, tzn., že přepočítávací faktor je 3,43 (96/28). Stejně tak je podle rovnice 3 spotřeba kyslíku při oxidaci na dusičnan 128 g, tzn. přepočítávací faktor je 4,57 (128/28).
Protože popsané reakce následují po sobě, přičemž jsou realizovány odlišnými druhy bakterií, může koncentrace dusitanů stoupat i klesat; při poklesu roste odpovídajícím způsobem koncentrace dusičnanů. Spotřeba kyslíku při tvorbě dusičnanů se tedy vypočte vynásobením přírůstku koncentrace dusičnanů faktorem 4,57, zatímco spotřeba kyslíku při tvorbě dusitanů se vypočte vynásobením přírůstku koncentrace dusitanů faktorem 3,43, nebo při poklesu obsahu dusitanů se ztráty kyslíku vypočtou vynásobením poklesu koncentrace faktorem -3,43.
To znamená:
spotřeba  O
2
při tvorbě dusičnanů = 4,57 × přírůstek koncentrace dusičnanů (4) spotřeba O
2
při tvorbě dusitanů = 3,43 × přírůstek koncentrace dusitanů (5) ztráta O
2
při úbytku dusitanů: = -3,43 × pokles koncentrace dusitanů (6) Tedy spotřeba O
2
při nitrifikaci = +/- 3,43 × změna koncentrace dusitanů + 4,57 × změna koncentrace dusičnanů (7) a proto spotřeba O
2
v důsledku oxidace C = celková pozorovaná spotřeba - spotřeba v důsledku nitrifikace (8)
Jinými slovy, pokud se stanoví pouze celkový oxidovaný N, je možno za spotřebu kyslíku v důsledku nitrifikace považovat v prvém přiblížení hodnotu 4,57 x přírůstek oxidovaného dusíku.
Korigovaná hodnota spotřeby kyslíku v důsledku oxidace C se potom porovnává s TSK NH3 vypočítanou podle přílohy II.
V. METODA PRO STANOVENí ROZLOŽITELNOSTI – BIOCHEMICKÁ SPOTŘEBA KYSLÍKU – METODA C.5 PODLE PříLOHY SMĚRNICE 92/69/EHS
V.1 METODA
V.1.1 ÚVOD
Metoda je určena pro měření biochemické spotřeby kyslíku (BSK) tuhých nebo kapalných organických látek.
Data získaná při této zkoušce platí pro látky rozpustné ve vodě; těkavé látky a látky s nízkou rozpustností ve vodě lze touto metodou alespoň v zásadě rovněž zkoušet. Metodu lze použít pouze pro organické látky, které nemají v koncentracích používaných při zkoušce inhibiční účinek na bakterie. Není-li daná látka při koncentracích používaných ve zkoušce rozpustná, může být nezbytné použít pro dosažení dobré dispergace zkušebního materiálu zvláštní postupy, např. dispergaci ultrazvukem.
Informace o toxicitě chemické látky mohou být užitečné při interpretaci nízkých hodnot výsledku zkoušky a při volbě vhodných zkušebních koncentrací.
V.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
Biochemická spotřeba kyslíku (BSK) je definována jako množství rozpuštěného kyslíku, které je nutné k biochemické oxidaci určitého objemu roztoku látky za předepsaných podmínek.
Výsledky se vyjadřují v gramech spotřeby kyslíku (BSK) na 1 g zkušební látky.
V.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Je žádoucí použít vhodnou referenční látku pro kontrolu aktivity inokula.
V.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Předem stanovené množství látky rozpuštěné nebo dispergované ve vhodném, dobře provzdušněném médiu se inokuluje mikroorganismy a kultivuje se v temnu za stálé, definované teploty.
BSK se stanoví z rozdílu mezi obsahem rozpuštěného kyslíku na začátku a na konci zkoušky. Zkouška musí trvat nejméně pět dní a nejdéle 28 dní.
Souběžně musí být provedena slepá zkouška bez obsahu zkušební látky.
V.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI
Stanovení BSK nelze považovat za ověřené stanovení biologické rozložitelnosti látky. Tuto zkoušku lze považovat pouze za screeningovou zkoušku.
V.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
Připraví se předběžný roztok nebo disperse zkušební látky o koncentraci vhodné pro použitou metodu. Poté se stanoví BSK některou vhodnou vnitrostátní nebo mezinárodní standardizovanou metodou.
V.2 DATA A HODNOCENÍ
BSK předběžného roztoku se vypočte vybranou normalizovanou metodou a přepočte se na BSK vyjádřenou v gramech na 1 g zkušební látky.
V.3 ZPRÁVY
Uvede se použitá metoda.
Biochemická spotřeba kyslíku se vypočte jako průměr výsledků alespoň tří platných měření.
Musí být uvedeny všechny informace a poznámky, které jsou důležité pro interpretaci výsledků a které by mohly ovlivnit výsledek, zejména pokud jde o nečistoty, fyzikální stav, toxické účinky a vlastní složení zkušební látky.
Použití přísad pro inhibici biologické nitrifikace musí být uvedeno.
V.4 LITERATURA
Seznam příkladů standardizovaných metod: NF T 90­103: Determination of the biochemical oxygen demand.
NBN 407: Biochemical oxygen demand.
NEN 3235 5.4: Bepaling van het biochemisch zuurstofverbruik (BZV).
The determination of biochemical oxygen demand, Methods for the examination of water and associated materials, HMSO, London.
ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after n days.
VI. METODA PRO STANOVENí ROZLOŽITELNOSTI - CHEMICKÁ SPOTŘEBA KYSLÍKU – METODA C.6 PODLE PŘÍLOHY SMĚRNICE 92/69/EHS
VI.1 METODA
VI.1.1 ÚVOD
Metoda je určena pro měření chemické spotřeby kyslíku (CHSK) tuhých nebo kapalných organických látek prováděné standardním dohodnutým způsobem za pevně stanovených laboratorních podmínek.
Pro provedení této zkoušky a pro interpretaci výsledků jsou užitečné informace o chemickém vzorci látky (např. zda jde o soli halogenů, železnaté soli organických sloučenin, organické sloučeniny chloru).
VI.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
Chemická spotřeba kyslíku (CHSK) je mírou oxidovatelnosti látky, která se vyjadřuje jako ekvivalentní množství kyslíku oxidačního činidla spotřebovaného látkou za pevně stanovených laboratorních podmínek.
Výsledek se vyjadřuje jako množství spotřebovaného kyslíku (COD) v gramech na 1 g zkušební látky.
VI.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provedení metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami.
VI.1.4. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Předem stanovené množství látky rozpuštěné nebo dispergované ve vodě se za přítomnosti síranu stříbrného jako katalyzátoru oxiduje dichromanem draselným v prostředí koncentrované kyseliny sírové pod zpětným chladičem. Přebytečný dichroman se stanoví titrací odměrným roztokem síranu amonno­železnatého.
U látek obsahujících chlór se pro omezení rušení chloridy přidává síran rtuťnatý*.
VI.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI
Vzhledem k dohodnutým podmínkám stanovení je CHSK „ukazatelem oxidovatelnosti“ a jako takový se používá pro hodnocení organických látek.
Ve zkoušce mohou rušit chloridy; na stanovení CHSK mohou mít rovněž vliv anorganické redukční a oxidační látky.
U některých cyklických sloučenin a u řady těkavých sloučenin (např. u nižších mastných kyselin) nedochází v této zkoušce k úplné oxidaci.
VI.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
Připraví se počáteční roztok nebo disperse látky tak, aby bylo dosaženo CHSK od 250 do 600 mg·l
-1
.
Poznámky:
U špatně rozpustných nebo nedispergovatelných látek lze jemně rozmělněnou látku nebo kapalinu v množství odpovídajícím 5 mg CHSK odvážit a vpravit přímo do experimentální aparatury s vodou.
Často je výhodné, zejména v případě špatně rozpustných látek, stanovit CHSK upravenou metodou, tj. v uzavřeném systému s vyrovnávačem tlaku (H. Kelkenberg, 1975).
Touto upravenou metodou lze často úspěšně kvantifikovat i látky, u nichž je stanovení konvenční metodou obtížné – např. kyselinu octovou. Metoda však také selhává v případě pyridinu. Zvýší­li se koncentrace dichromanu draselného předepsaná v (1), na 0,25 N (0,0416 M), usnadní se přímé navažování 5 – 10 mg látky, což je důležité pro stanovení CHSK látek obtížně rozpustných ve vodě (2).
Jinak se CHSK stanoví vhodnou vnitrostátní nebo mezinárodní metodou.
VI.2 DATA A HODNOCENÍ
CHSK obsahu experimentální baňky se vypočte vybranou normalizovanou metodou a přepočte se na CHSK vyjádřenou v gramech na 1 g zkušební látky.
VI.3 ZPRÁVY
Uvede se odkaz na použitou metodu.
Chemická spotřeba kyslíku se vypočte jako průměr výsledků alespoň tří měření. Jsou­li známy, musí být uvedeny všechny informace a poznámky, které jsou důležité pro interpretaci výsledků a které by mohly ovlivnit výsledek, zejména pokud jde o nečistoty, fyzikální stav a základní vlastnosti zkušební látky.
Uvede se použití síranu rtuťnatého za účelem omezení rušení chloridy.
VI.4 LITERATURA
(1) Kelkenberg, H. Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, 8, 146.
(2) Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, 13, 169.
Seznam příkladů normovaných metod:
NBN T 91­201 Determination of the chemical oxygen demand.
ISBN O 11 7512494 Chemical oxygen demand (dichromat value) of polluted and waste waters.
NF T 90­101 Determination of the chemical oxygen demand.
DS 217 Water analysis –Determination of the chemical oxygen demand.
DIN 38409­H­41 Determination of the chemical oxygen demand (COD) within the range above 15 mg per litre.
NEN 3235 5.3 Bepaling van bet chemisch zuurstofverbruik.
ISO 6060 Water Quality: Chemical oxygen demand dichromate methods.
VII. METODA PRO STANOVENÍ ABIOTICKÉHO ROZKLADU – HYDROLÝZA JAKO FUNKCE PH – METODA C.7 PODLE PŘÍLOHY SMĚRNICE 92/69/EHS
VII.1 METODA Metoda je založena na Pokynech OECD pro zkoušení (1).
VII.1.1 ÚVOD
Hydrolýza je důležitá reakce ovlivňující abiotický rozklad. Tato reakce má zvláštní význam u látek, které jsou málo biologicky rozložitelné; může ovlivnit stálost látky v životním prostředí.
Většina reakcí hydrolýzy probíhá jako reakce pseudoprvního řádu, a poločasy jsou tedy nezávislé na koncentraci. To zpravidla dovoluje extrapolaci výsledků získaných s laboratorními koncentracemi na podmínky v životním prostředí.
Mimoto byly u několika typů chemických sloučenin publikovány příklady uspokojivé shody výsledků naměřených v čisté vodě a v přírodních vodách (2).
Při provádění této zkoušky je užitečné znát hodnotu tlaku par dané látky.
Metoda je použitelná pouze pro látky rozpustné ve vodě. Nečistoty mohou ovlivnit výsledky.
Chování látek při hydrolýze by mělo být zkoumáno při hodnotách pH, které se obvykle vyskytují v životním prostředí (pH 4 – 9).
VII.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
       Hydrolýzou  se  rozumí reakce látky  RX  s  vodou.  Tuto
       reakci  lze  znázornit  prostou  výměnou  skupiny  X  za
       skupinu OH:
             RX + HOH => ROH + HX        (1)
 
       Rychlost,  kterou klesá koncentrace látky  RX,  je  dána
 
       vztahem:
       
             rychlost = k*[H
2
O]*[RX] (2) Protože je voda přítomna vůči zkoušené látce ve velkém přebytku, označuje se obvykle tento typ reakce jako reakce pseudoprvního řádu, ve které je pozorovaná rychlostní konstanta dána vztahem: k
pozorov.
= k*[H
2
O] (3) Tuto konstantu lze určit pro danou hodnotu pH a teplotu T z výrazu: 2,303 C
0
k
pozorov.
= ---- x log ---- (4) t C
t
kde t = čas, C
0
= koncentrace látky v čase 0, C
t
= koncentrace látky v čase t, 2,303 = přepočítací faktor mezi přirozeným logaritmem a dekadickým logaritmem. Koncentrace se vyjádří v g*l
-1
nebo v mol*l
-1
. Konstanta kpozorov. má rozměr [čas]-1. „Poločas“ t
1/2
je definován jako doba potřebná pro snížení koncentrace látky o 50 %, Ct = 1/2*C
0
(5) Z rovnic (4) a (5) plyne, že t
1/2
= 0,693 / k
pozorov.
(6)
VII.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Při vyšetřování nové látky není nutné vždy používat referenční látky. Měly by v první řadě sloužit k občasné kontrole provedení metody a ke vzájemnému porovnávání výsledků získaných jinými metodami.
Jako referenční látky byly použity následující látky (1):
Kyselina acetylsalicylová (aspirin),
O,O-diethyl-O-(2-isopropyl-6-methylpyrimidin-4- yl)fosforothioát (dimpylát, diazinon).
VII.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Látka se rozpustí ve vodě v nízké koncentraci; pH a teplota se regulují.
Vhodnou analytickou metodou se sleduje pokles koncentrace látky v závislosti na čase. Sestrojí se graf závislosti logaritmů koncentrací na čase, a je­li závislost lineární, lze zjistit rychlostní konstantu reakce prvního řádu ze směrnice přímky (viz bod 2).
Není-li možné stanovit rychlostní konstantu pro danou teplotu přímo, je obvykle možné odhadnout ji pomocí Arrheniovy rovnice, která udává teplotní závislost rychlostních konstant. Z průběhu lineární závislosti logaritmů rychlostních konstant, získaných při vhodných teplotách, na převrácené hodnotě absolutní teploty (K) lze extrapolací získat hodnotu rychlostní konstanty, kterou nebylo možné stanovit přímo.
VII.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI
V odkazu (2) se uvádí, že měření rychlostních konstant hydrolýzy lze u 13 tříd organických sloučenin provádět s vysokou přesností.
Reprodukovatelnost závisí zejména na regulaci pH a teploty a může být ovlivněna přítomností mikroorganismů a ve speciálních případech koncentrací rozpuštěného kyslíku.
VII.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
VII.1.6.1 Reakční činidla
VII.1.6.1.1 Pufrační roztoky
Zkouška se provádí při třech hodnotách pH: 4,0, 7,0 a 9,0.
K tomuto účelu se za použití chemikálií čistoty p.a. a destilované nebo deionizované vody připraví pufrační roztoky. Některé příklady pufračních roztoků jsou uvedeny v doplňku.
Použitý pufrační roztok může mít vliv na rychlost hydrolýzy; je­li tomu tak, je třeba zvolit jiný pufrační roztok. V odkazu (2) se doporučuje použít namísto fosforečnanových pufračních roztoků boritanové a acetátové pufrační roztoky.
Není-li známa hodnota pH pufračních roztoků při zkušební teplotě, lze ji stanovit s přesností na +/-0,1 pH­metrem kalibrovaným při zvolené teplotě.
VII.1.6.1.2 Zkušební roztoky
Zkušební látka se rozpustí ve zvoleném pufračním roztoku a koncentrace by neměla překročit 0,01 mol·l
-1
nebo polovinu koncentrace nasyceného roztoku, podle toho, která z těchto hodnot je nižší.
Použití organických rozpouštědel mísitelných s vodou se doporučuje jen u látek s nízkou rozpustností ve vodě. Množství tohoto rozpouštědla by mělo být menší než 1 % a nemělo by mít vliv na proces hydrolýzy.
VII.1.6.2 Aparatura
Použijí se skleněné baňky se zabroušenými zátkami, pro něž není vhodné používat mazací tuk.
Pokud jsou chemická látka nebo pufrační roztok těkavé, nebo provádí­li se zkouška při zvýšené teplotě, upřednostňují se baňky zatavené nebo jinak uzavřené a s omezeným prostorem nad roztokem.
VII.1.6.3 Analytická metoda
Použitá metoda musí být specifická pro stanovení zkušební látky při zkušebních koncentracích a může být i kombinací vhodných analytických technik.
Použitá analytická metoda bude záviset na povaze látky a musí být dostatečně přesná a citlivá pro zjištění úbytku počáteční koncentrace o 10 %.
VII.1.6.4 Zkušební podmínky
Zkoušky se provádí v termostatovaném prostoru nebo za použití termostatované lázně nastavené na zvolenou teplotu s tolerancí +/-0,5 st.C. Teplota se udržuje a měří s přesností na +/-0,1 st.C. Vhodnými opatřeními je třeba zabránit fotolýze.
U snadno oxidovatelných látek je nezbytné odstranit rozpuštěný kyslík (např. 5minutovým probubláváním roztoku dusíkem nebo argonem před přípravou roztoku).
VII.1.6.5 Zkušební postup
VII.1.6.5.1 Předběžná zkouška
U všech látek se provede předběžná zkouška při teplotě 50 +/- 0,5 st.C pro tři hodnoty pH: 4,0, 7,0 a 9,0. Provede se dostatečný počet měření, aby bylo možné pro každé pH odhadnout, zda je při 50 st.C poločas (t˝) menší než 2,4 h nebo zda po 5 dnech dojde k hydrolýze méně než 10 %. (Lze odvodit, že tyto hodnoty odpovídají za podmínek, které se nejčastěji vyskytují v životním prostředí (25 st.C), poločasu kratšímu než jeden den, resp. delšímu než 1 rok). Jestliže se v předběžném experimentu ukáže, že při 50 st.C dojde při všech třech hodnotách pH (4, 7, 9) za 2,4 h k hydrolýze 50 nebo více procent zkušební látky, nebo že po 5 dnech dojde k hydrolýze méně než 10 % zkušební látky, nejsou další experimenty nezbytné.
V ostatních případech a pro hodnoty pH, u nichž výše uvedené podmínky nenastanou, se provede zkouška 1.
VII.1.6.5.2 Zkouška 1
Zkouška 1 se provede při jedné teplotě, nejlépe při 50 +/- 0,5 st.C, a pokud možno za sterilních podmínek při pH, pro něž se v předběžné zkoušce ukázala nutnost dalších zkoušek.
Zvolí se dostatečný počet vzorků, aby byl pokryt stupeň hydrolýzy 20 až 70 % a bylo tak možné ověřit, že jde při specifikovaném pH o reakci pseudoprvního řádu.
Pro každé pH, při němž se zkouška 1 provede, se stanoví řád reakce.
Odhad rychlostní konstanty při 25 st.C:
Rozhodnutí o dalším experimentálním postupu závisí na tom, zda lze ze zkoušky 1 usuzovat na reakci pseudoprvního řádu, či nikoliv.
Pokud nelze ze zkoušky 1 s jistotou usuzovat na reakci pseudoprvního řádu, je třeba provést další experimenty podle zkoušky 2.
Vyplývá-li s jistotou ze zkoušky 1, že jde o rekci pseudoprvního řádu, provedou se další experimenty podle zkoušky 3. (Za speciálních okolností lze vypočítat rychlostní konstanty při 25 st.C z konstant při 50 st.C vypočtených s použitím výsledků zkoušky 1, viz bod 3.2).
VII.1.6.5.3 Zkouška 2
Tato zkouška se provede při každém pH, pro něž se její provedení ukázalo na základě výsledků zkoušky 1 nezbytným, a to
— buď při teplotě nižší než 40 st.C,
— nebo při dvou teplotách nad 50 st.C, které se od sebe liší nejméně o 10 st.C.
Při každém pH a při každé teplotě, při nichž se má provést zkouška 2, se v přiměřených intervalech zvolí nejméně 6 bodů tak, že stupeň hydrolýzy je v oblasti 20 až 70 %.
Pro jedno pH a pro jednu teplotu se provede měření dvakrát. Pokud se zkouška 2 provádí při dvou teplotách nad 50 st.C, provede se měření dvakrát nejlépe při nižší z těchto dvou teplot.
Při každém pH a při každé teplotě, při nichž se provede zkouška 2, se podle možnosti uvede grafický odhad poločasu (t
1/2
).
VII.1.6.5.4 Zkouška 3
Tato zkouška se provede při každém pH, pro něž se její provedení ukázalo na základě výsledků zkoušky 1 nezbytným, a to
— buď při teplotě nižší než 40 st.C,
— nebo při dvou teplotách nad 50 st.C, které se od sebe liší nejméně o 10 st.C.
Při každém pH a při každé teplotě, při nichž se má provést zkouška 3, se zvolí tři body, první v čase 0, druhý a třetí při stupni hydrolýzy vyšším než 30 %; vypočte se konstanta k
pozorov.
a poločas t
1/2
.
VII.2 DATA Jde­li o reakci pseudoprvního řádu, lze vypočítat hodnoty konstanty kpozorov. pro každé pH a každou zkušební teplotu z grafu závislosti hodnot logaritmů koncentrací na čase pomocí rovnice:
 
            k
pozorov.
= - směrnice × 2,303 (7)
Dále je možné z rovnice (6) vypočítat t
1/2
.
Podle potřeby se s použitím Arrheniovy rovnice stanoví k25 st.C.
Pokud chování neodpovídá reakci pseudoprvního řádu, viz bod 3.1.
VII.3 ZPRÁVA
VII.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:
— specifikaci látky;
— všechny výsledky získané s referenčními látkami;
— podstatu a podrobnosti použité analytické metody;
— pro každou zkoušku: teplotu, pH, složení pufračního roztoku, tabulku se všemi údaji o koncentraci a čase;
— u reakcí pseudoprvního řádu hodnoty k
pozorov.
a t
1/2
, včetně metody jejich výpočtu;
— u reakce, která neodpovídá pseudoprvnímu řádu, graf průběhu závislosti logaritmu koncentrace na čase;
— všechny informace a pozorování nezbytné pro interpretaci výsledků.
VII.3.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ
Může existovat možnost vypočítat přijatelné hodnoty rychlostních konstant (při 25 st.C) zkušebních látek za předpokladu, že pro homology chemické látky již existují experimentální údaje pro aktivační energii a za předpokladu, že lze důvodně očekávat, že aktivační energie zkušební látky je stejného řádu.
VII.4 LITERATURA
(1) OECD, Paris 1981, Test Guideline 111, Decision of the Council C(81), 30 final.
(2) W. Mabey, T. Mill.: Critical Review of Hydrolysis of Organic Compounds in Water Under Environmental Conditions. J. Phys, Chem. Ref. Data, 1978, 7 (2), 383­415.
DODATEK
Pufrační roztoky
 A. CLARK A LUBS

       Hodnoty  pH  uvedené  v  následujících  tabulkách   byly
       vypočteny  na  základě  měření  potenciálu  za   použití
       Sörensenových standardních rovnic. Skutečné  hodnoty  pH
       jsou o 0,04 vyšší než hodnoty v tabulce.

        Složení                                                  pH
        kalium­hydrogenftalát (0,1 mol*l
-1
) a HCl (0,1 mol*l
-1
) při 20 st.C 2,63 ml HCl + 50 ml ftalátu doplnit do 100 ml 3,8 kalium­hydrogenftalát (0,1 mol*l
-1
) a NaOH (0,1 mol*l
-1
) při 20 st.C 0,40 ml NaOH + 50 ml ftalátu doplnit do 100 ml 4,0 3,70 ml NaOH + 50 ml ftalátu doplnit do 100 ml 4,2 dihydrogenfosforečnan draselný (0,1 mol*l
-1
) a NaOH (0,1 mol*l
-1
) při 20 st.C 23,45 ml NaOH + 50 ml fosforečnanu doplnit do 100 ml 6,8 29,63 ml NaOH + 50 ml fosforečnanu doplnit do 100 ml 7,0 35,00 ml NaOH + 50 ml fosforečnanu doplnit do 100 ml 7,2 H3BO3 (0,1 mol*l
-1
) v KCl (0,1 mol*l
-1
) a NaOH (0,1 mol*l
-1
) při 20 st.C 16,30 ml NaOH + 50 ml kyseliny borité doplnit do 100 ml 8,8 21,30 ml NaOH + 50 ml kyseliny borité doplnit do 100 ml 9,0 26,70 ml NaOH + 50 ml kyseliny borité doplnit do 100 ml 9,2 B. KOLTHOFF A VLEESHOUWER Složení pH Monokalium­citrát (0,1 mol*l
-1
) a NaOH (0,1 mol*l
-1
) při 18 st.C (je třeba přidat malý krystalek thymolu, aby nevznikaly plísně) 2,0 ml NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml 3,8 9,0 ml NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml 4,0 16,3 ml NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml 4,2 C. SÖRENSEN Borax (0,05 mol*l
-1
) a HCl (0,1 mol*l
-1
) Složení pH ml ml HCl Sörensen Walbum boraxu 18 st.C 10 st.C 40 st.C 70 st.C 8,0 2,0 8,91 8,96 8,77 8,59 8,5 1,5 9,01 9,06 8,86 8,67 9,0 1,0 9,09 9,14 8,94 8,74 9,5 0,5 9,17 9,22 9,01 8,80 10,0 0,0 9,24 9,30 9,08 8,86 Borax (0,05 mol*l
-1
) a NaOH (0,1 mol*l
-1
) Složení pH ml ml HCl Sörensen Walbum boraxu 18 st.C 10 st.C 40 st.C 70 st.C 10,0 0,0 9,24 9,30 9,08 8,86 9,0 1,0 9,36 9,42 9,18 8,94 8,0 2,0 9,50 9,57 9,30 9,02 7,0 3,0 9,68 9,76 9,44 9,12
VIII. METODA PRO STANOVENÍ TOXICITY PRO ŽÍŽALY – ZKOUŠKA NA UMĚLÉ PŮDĚ – METODA C.8 PODLE PŘÍLOHY SMĚRNICE 92/69/EHS
VIII.1 METODA
VIII.1.1 ÚVOD
V této laboratorní zkoušce se zkoušená látka přidá do umělé půdy, do které se na 14 dní umístí žížaly. Po této době (a nepovinně i po sedmi dnech) se vyšetří letální účinek látky na žížaly. Zkouška je metodou relativně krátkodobého orientačního zjištění účinku chemických látek na žížaly při dermálním a potravním příjmu.
VIII.1.2 JEDNOTKY A DEFINICE
LC
50
: Koncentrace látky, vyhodnocená jako hodnota, při které v průběhu zkoušky dojde k uhynutí 50 % pokusných zvířat.
VIII.1.3 REFERENČNÍ LÁTKA
Referenční látka se používá periodicky jako prostředek pro důkaz, že se citlivost zkušebního systému podstatně nezměnila.
Jako referenční látka se doporučuje chloracetamid analytické čistoty.
VIII.1.4 PRINCIP ZKOUŠKY
Půda představuje proměnlivé prostředí, takže se pro zkoušku používá pečlivě definovaná umělá hlinitá půda.
V definované umělé půdě se chovají dospělé žížaly druhu Eisenia foetida (viz poznámku v příloze) a exponují se různým koncentracím zkoušené látky. Obsah nádob se 14 dní (a nepovinně i 7 dní) po začátku zkušky rozprostře na podložku a spočítají se žížaly, které při jednotlivých koncentracích přežijí.
VIII.1.5 KRITÉRIA KVALITY
Zkouška je navržena tak, aby byla z hlediska zkušebního substrátu a organismů co nejreprodukovatelnější. Úhyn v kontrolních skupinách nesmí na konci zkoušky překročit 10 %, jinak je zkouška neplatná.
VIII.1.6 POPIS ZKUŠEBNí METODY
VIII.1.6.1 Látky
VIII.1.6.1.1 Substrát pro zkoušku
Jako základní substrát pro zkoušku se používá definovaná umělá půda.
(a) Základní substrát (procenta se rozumí na bázi suché hmotnosti):
- 10 % sfagnové rašeliny (s pH co nejblíže 5,5 až 6,0, bez viditelných zbytků rostlin a jemně mleté),
- 20 % kaolinitického jílu, pokud možno s více než 50 % kaolinitu,
- asi 69 % průmyslového křemenného písku (dominantní jemný písek s více než 50 % částic velikosti 0,05 až 0,2 mm). Pokud zkoušená látka není dostatečně dispergovatelná ve vodě, je třeba ponechat k dispozici pro pozdější míšení se zkoušenou látkou 10 g na každou zkušební nádobu,
- asi 1 % uhličitanu vápenatého (CaCO
3
), práško vého, chemicky čistého, přidaného pro úpravu pH na 6,0 +/- 0,5.
(b) Substrát pro zkoušku:
Substrát pro zkoušku obsahuje základní substrát, zkoušenou látku a deionizovanou vodu.
Obsah vody činí asi 25 až 42 % sušiny základního substrátu. Obsah vody v substrátu se stanoví vysušením vzorku na konstantní hmotnost při 105 st. C.
Klíčovým kritériem je, že mělá půda musí být vlhčena tak, aby neobsahovala stojící vodu. Je třeba věnovat péči mísení, aby se dosáhlo rovnoměrného rozdělení zkoušené látky a substrátu. působ uvedení zkoušené látky do substrátu je třeba uvést ve zprávě.
(c) Kontrolní substrát:
Kontrolní substrát obsahuje základní substrát a vodu. Přidává-li se aditivní činidlo, musí další kontrola obsahovat stejné množství aditivního či nidla
.
VIII.1.6.1.2 Nádoby pro zkoušku
Skleněné nádoby o obsahu asi jednoho litru (řádně přikryté plastovými víky, miskami nebo plastovou fólií s otvory pro větrání), naplněné množstvím vlhkého substrátu pro zkoušku nebo kontrolního substrátu, ekvivalentním 500 g suchého substrátu.
VIII.1.6.2 Experimentální podmínky
Nádoby je třeba uchovávat v klimatizovaných komorách při 20 +/- 2 oC se stálým světlem. Intenzita světla by měla být 400 až 800 lux.
Doba trvání zkoušky je 14 dní, ale je možné nepovinně vyhodnotit úhyn sedm dní po začátku zkoušky.
VIII.1.6.3 Pracovní postup
Zkoušené koncentrace
Koncentrace zkoušené látky se vyjadřují jako hmotnost látky na hmotnost sušiny základního substrátu (mg.kg- 1).
Zkouška pro zjištění rozsahu koncentrací
Aby se získaly informace o vhodném rozmezí koncentrací pro definitivní zkoušku provede se předběžná zkouška, kterou se zjistí rozsah koncentrací, které právě způsobují úhyn od 0 do 100 %.
Látku je třeba zkoušet při těchto koncentracích: 1000; 100; 10; 1; 0,1 mg látky.kg
-1
substrátu pro zkoušku (jako sušina).
Je-li třeba provést úplnou definitivní zkoušku, stačí pro zkoušku pro zjištění rozsahu koncentrací jedna zkušební skupina na každou koncentraci a jedna pro neexponovanou kontrolu, každá o 10 žížalách.
Definitivní zkouška
Výsledky zkoušky pro zjištění rozsahu koncentrací se použijí pro volbu nejméně pěti koncentrací, odstupňo vaných v geometrické posloupnosti, právě pokrývajících rozsah 0 až 100 % mortality, lišících se o konstantní činitel nepřevyšující 1,8.
Zkoušky používající tyto řady koncentrací musí umožnit co nejpřesnější stanovení hodnoty LC
50
a jejích mezí spolehlivosti.
V definitivní zkoušce se používají nejméně čtyři zkušební skupiny na každou koncentraci a čtyři neexponované kontrolní skupiny, každá o 10 žížalách. Výledky za tyto replikované skupiny se uvedou průměrem a standardní odchylkou.
Tam, kde úhyn 0 % a 100 % vyvolají dvě po sobě následující koncentrace, jež jsou vůči sobě v poměru 1,8 , jsou tyto dvě hodnoty dostatečné pro identifikaci oblasti, do které spadá LC
50
.
Mísení základního substrátu a zkoušené látky
Substrát pro zkoušení musí být všude tam kde je to mož né připraven bez jakýchkoli přídavných činidel jiných než voda. Těsně před začátkem zkoušky se smísí emulze nebo disperze zkoušené látky v deionizované vodě nebo v jiném rozpouštědle se základním substrátem pro zkoušení, nebo se na něj rovnoměrně rozstříká rozprašovačem pro chromatografii nebo podobným rozprašo vačem.
Je-li zkoušená látka nerozpustná ve vodě, může se rozpustit v co nejmenším objemu vhodného organického rozpouštědla (např. hexanu, acetonu nebo chloroformu).
K rozpuštění, dispergaci nebo emulgaci zkoušené látky lze použít pouze činidla, která snadno těkají. Substrát pro zkoušení je nutné před použitím odvětrat. Množství odpařené vody je nutné nahradit. Kontrolní zkouška musí obsahovat stejné množství všech aditivních činidel.
Není-li zkoušená látka rozpustná, dispergovatelná ani emulgovatelná v organických rozpouštědlech, připraví se směs 10 g křemenného písku a množství zkoušené látky potřebné pro přípravu 500 g zkušebního substrátu a ta se smíchá se 490 g zvlhčeného základního substrátu (hmotnost se rozumí v sušině).
Pro každou jednotlivou vsázku použitou ve zkoušce se do skleněné nádoby vpraví množství vlhkého substrátu pro zkoušku, ekvivalentní 500 g sušiny, a na povrch substrátu se umístí 10 žížal, které byly před použitím kondicionovány po 24 hodiny v podobném vlhkém základním substrátu, poté rychle omyty a zbaveny přebytečné vody absorpcí filtračním papírem.
Nádoby se přikryjí plastovými víky s otvory, miskami nebo fólií, aby se zabránilo vysychání substrátu, a udržují se v podmínkách zkoušky po 14 dní. Vyhodnocení je třeba provést 14 dní (a nepovinně i sedm dní) po zahájení zkoušky. Substrát se rozprostře na podnos ze skla nebo nerezové oceli. Žížaly se vy šetří a stanoví se počet přežívajících jedinců. Žížaly se považují za mrtvé, jestliže nereagují na jemné mechanické podráždění na předním konci.
Provádí-li se vyšetření po sedmi dnech, nádoba se znovu naplní substrátem a žížaly se znovu vloží na povrch téhož substrátu.
VIII.1.6.4 Organizmy použité ve zkoušce
Ke zkoušce musí být použity dospělé žížaly Eisenia foetida (viz poznámku v příloze) (alespoň dva měsíce staré s klitellem) o hmotnosti (ve vlhkém stavu) 300 až 600 mg. (Pokud se týká metody chovu, viz příloha.)
VIII.2 VÝSLEDKY
VIII.2.1 ZPRACOVÁNÍ A VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ
Uvedou se koncentrace zkoušené látky s odpovídajícím procentem mrtvých žížal.
Jsou-li údaje vyhovující, stanoví se hodnota LC
50
a meze spolehlivosti (p = 0,05) s použitím standardních metod (Litchfield a Wilcoxon, 1949, nebo ekvivalentní metoda). LC
50
se udává v mg zkoušené lát ky na 1 kg substrátu pro zkoušku (v sušině).
V případech, kdy sklon křivky koncentrací je pro vý počet LC
50
příliš strmý, stačí grafický odhad této hodnoty.
Tam, kde úhyn 0 % a 100 % vyvolají dvě po sobě následující koncentrace, jež jsou vůči sobě v poměru 1,8 jsou tyto dvě hodnoty dostatečné pro identifikaci rozsahu, do kterého spadá LC
50
.
VIII.3 ZPRÁVA
VIII.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
Je-li to možné, má protokol obsahovat tyto informace:
- prohlášení, že zkouška byla provedena v souladu s výše uvedenými kritérii kvality,
- o druhu provedené zkoušky (zkouška pro zjištění rozsahu koncentrací a (nebo) definitivní zkouška),
- přesný popis experimentálních podmínek nebo konsta tování, že zkouška byla provedena v souladu s metodou; je nutno uvést veškeré odchylky,
- přesný popis, jak byla zkoušená látka smísena se základním substrátem,
- informace o organismech použitých ve zkoušce (druh, stáří, střední hmotnost a rozsah jednotlivých hod not, podmínky chovu, dodavatel),
- metoda použitá ke stanovení LC
50
,
- výsledky zkoušky včetně všech použitých údajů,
- popis pozorovaných symptomů nebo změn v chování organizmů použitých ve zkoušce,
- úhyn v kontrolních zkouškách,
- LC
50
nebo nejvyšší zkoušená koncentrace nevyvolá vající úhyn a nejnižší zkoušená koncentrace vyvolávající 100 % úhyn 14 dní (a nepovinně sedm dní) od začátku zkoušky,
- grafické znázornění křivky koncentrace/odezva,
- výsledky získané s referenční látkou, ať v souvis losti s touto zkouškou nebo dřívějších zkoušek kon troly jakosti.
VIII.4 LITERATURA
(1) OECD, Paris, 1981. Test Guideline 207, Decision of the Council C(81) 30 final.
(2) Edwards, C.A. a Lofty, J.R., 1977, Biology of Earthworms, Chapman and all, London.
(3) Bouche, M.B., 1972, Lombriciens de France, Écolo gieet Systématique, Institut National de la Recherche Agronomique, 671 str.
(4) Litchfield, J.T., Wilcoxon, F., A simplified method of evaluation dose effect experiments. J. Pharm. Exp. Therap., vol. 96, 1949, str. 99
(5) Commission of the European Communities, Development of a standardized laboratory method for assessing the toxicity of chemical substances to earthworms, Report EUR 8714 EN, 1983.
(6) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfah rensvorschlag "Toxizitätstest am Regenwurm Eisenia foetida in künstlichem Boden", in Rudolph/Boje, Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.
PŘÍLOHA
Chov žížal před zkouškou
Pro účely chovu se 30 až 50 dospělých žížal umístí do chovné schránky s čerstvým substrátem a vyjmou se po 14 dnech. Tyto jedince je možné použít pro další chovné vsázky. Žížaly vylíhlé ze zámotků se použijí ke zkoušení, když jsou dospělé (v uvedených podmínkách po dvou až třech měsících).
        
                        Podmínky chovu

       Klimatizovaná komora:    teplota 20 +/- 2 st. C, nejlépe s
                                neustálým  světlem (intenzita
                                400 - 800 lux).

       Chovné nádoby:           vhodné mělké nádoby o objemu
                                10 až  20 l.

       Substrát:                Eisenia foetida je
                                možné chovat  v různých zvířecích
                                exkrementech.
                                Jako chovné médium se doporučuje
                                používat směs 50 % obj. rašeliny 
                                a 50 % obj.hovězího
                                nebo koňského
                                hnoje. Médium  musí mít pH asi 6 až 7
                                (upraví se
                                uhličitanem vápenatým) a nízkou 
                                iontovou
                                vodivost (méně
                                než 6 mmhos nebo  0,5 % koncentraci
                                solí).
                                Substrát musí
                                být vlhký, ale ne příliš mokrý.
                                Vedle výše
                                uvedené metody je možné  používat i jiné
                                úspěšné postupy.
Poznámka:
Eisenia foetida existuje ve dvou odrůdách, které někteří taxonomové rozlišili na druhy (Bouche, 1972). Jsou si morfologicky podobné, avšak jedna, Eisenia foetida foetida, má na článcích typické příčné pruhování nebo páskování a druhá, Eisenia foetida andrei, toto postrádá a má pestře červené zbarvení. Pokud je to možné, je třeba používat Eisenia foetida andrei. Jiné druhy je možné použít, pokud existuje potřebná metodika.
IX. METODA PRO STANOVENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI – ZAHN- WELLENSOVA ZKOUŠKA – METODA C.9 PODLE PŘÍLOHY SMĚRNICE 92/69/EHS
IX.1 METODA
IX.1.1 ÚVOD Cílem metody je stanovení úplné biologické
rozložitelnosti ve vodě rozpustných netěkavých organických látek statickou zkouškou, při které jsou tyto látky vystaveny účinku vysokých koncentrací mikroorganismů.
Při interpretaci výsledků musí být zohledněna fyzikálně- chemická adsorbce na suspendované pevné částice. Zkoušené látky jsou zřeďovány v koncentracích odpovídajících hodnotám DOC nebo TOC od 50 do 400 mg.l
-1
nebo hodnotám CHSK 100 - 1000 mg.l
-1
. Tyto poměrně vysoké koncentrace umožňují dostatečně spolehlivou analýzu.
Sloučeniny s toxickými vlastnostmi mohou však proces rozkladu zpomalit.
Mírou biologické rozložitelnosti zkoušené látky v této metodě je úbytek rozpuštěného organického uhlíku nebo chemická spotřeba kyslíku. Specifickými analytickými metodami může být stanovena i primární biologická rozložitelnost látek.
Touto metodou mohou být zkoušeny pouze organické látky, které při koncentracích použitých ve zkoušce:
— jsou za podmínek zkoušky rozpustné ve vodě,
— mají za podmínek zkoušky nevýznamnou tenzi par,
— neinhibují bakterie,
— jsou ve zkušebním systému jen omezeně adsorbovány,
— pěněním nesnižují svou koncentraci ve zkoušeném roztoku.
Pokud jsou stanoveny nízké nebo marginální hodnoty biologické rozložitelnosti, je nutné pro interpretaci výsledků znát obsah nejdůležitějších komponent zkoušené látky.
Pro interpretaci nižších hodnot biologické rozložitelnosti a volbu vhodných koncentrací zkoušené látky jsou důležité rovněž informace o toxicitě zkoušené látky.
IX.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
Procentuální hodnota biologického rozkladu v čase se vypočítá podle vztahu:
       
                      C
T
- C
B
D
T
(%) = [ 1 - -----------] .100 C
A
- C
BA
kde: D
T
= rozklad ( %) v čase T, C
a
= hodnoty DOC (nebo CHSK) zkoušené látky 3 h od zahájení zkoušky (mg.l
-1
), C
T
= hodnoty DOC (nebo CHSK) zkoušené látky v době odběru vzorku (mg.l
-1
), C
B
= hodnoty DOC (nebo CHSK) kontroly v době odběru vzorku (mg.l
-1
), C
BA
= hodnoty DOC (nebo CHSK) kontroly 3 h od zahájení zkoušky (mg.l
-1
).
Stupeň rozložitelnosti se zaokrouhluje na celá procenta.
Jako procentuální rozložitelnost je udáván procentuální úbytek hodnot DOC (nebo CHSK) zkoušené látky.
Rozdíl mezi hodnotami naměřenými po 3 h po zahájení zkoušky a mezi vypočítanými a zejména však naměřenými počátečními hodnotami, poskytuje užitečnou informaci o rozložitelnosti zkoušené látky (viz 3.2).
IX.l.3 STANDARDNÍ LáTKY
Při posuzování rozložitelnosti nových látek mohou být v jednotlivých případech využity referenční materiály, v této metodice však nejsou doporučeny žádné.
IX.l.4 PRINCIP METODY
Aktivovaný kal, minerální živné médium a zkoušená látka ve vodném roztoku jako zdroj uhlíku se smíchají v 1 - 4 l skleněné nádobě s míchadlem a aeračním zařízením. Suspenze je míchána a aerována až 28 dní při teplotě 20-25 st. C v difuzním světle nebo temnu. Rozklad je sledován denně nebo v jinak vhodně stanovených časových intervalech prostřednictvím měření hodnot DOC (nebo CHSK) v odebraném vzorku po jeho přefiltrování. Procentuální hodnota biologického rozkladu v čase je definována jako poměr mezi hodnotami DOC (nebo CHSK) v době odběru vzorku a po 3 h od zahájení zkoušky. Výsledek je vyjádřen graficky jako funkce času.
V případě, že se analyticky stanovují změny koncentrací původní molekuly látky, jsou tyto změny měřítkem primární biologické rozložitelnosti.
IX.l.5 KRITÉRIA KVALITY
Dostatečná reprodukovatelnost byla ověřena mezilaboratorními zkouškami. Citlivost metody je značně závislá na variabilitě kontrolního vzorku, na poměrně malé přesnosti stanovení množství organického uhlíku a na koncentraci zkoušené látky v suspenzi.
IX.l.6 POSTUP ZKOUŠENÍ
IX.l.6.l Příprava
IX.l.6.1.1 Reagencie
 
       Voda:   Pitná  voda s obsahem organického uhlíku  menším
            než  5  mg.l
-1
.Koncentrace vápenatých a hořečnatých iontů nesmí překročit 2,7 mmol.l
-1
, jinak je nutné jako rozpouštědlo použít deionizovanou nebo destilovanou vodu. Kyselina sírová p. a. 50 g.l
-1
Hydroxid sodný p.a. 40 g.l
-1
Minerální živné médium: v jednom litru deionizované vody se rozpustí: Chlorid amonný NH
4
Cl p.a. 38,5 g NaH
2
PO
4
. 2H
2
O p.a. 33,4 g KH
2
PO
4
p.a. 8,5 g K
2
HPO
4
p.a. 21,75 g Tento roztok slouží zároveň jako tlumič pH.
IX.l.6.1.2 Přístroje
Skleněné nádoby o objemu 1 - 4 l.
Skleněné nebo kovové míchadlo, které by mělo být umístěno 5 - 10 cm nad dnem nádoby. Použito může být rovněž magnetické míchadlo se 7 - 10 cm dlouhým ramenem.
Skleněná aerační trubice o vnitřním průměru 2 - 4 mm. Vyústění trubice by mělo být umístěno cca 1 - 10 cm nad dnem nádoby.
Odstředivka (cca 3 550 g).
pH-metr.
Oximetr.
Papírový filtr.
Membránový filtrační přístroj.
Membránový filtr o velikosti pórů 0,45 m, který během filtrace neuvolňuje a neabsorbuje uhlík.
Analyzátor ke stanovení obsahu organického uhlíku a vybavení ke stanovení CHSK.
IX.1.6.1.3 Příprava inokula
Aktivovaný kal z biologické čistírny se promývá opakovaně vodou předepsané kvality a buď se opakovaně centrifuguje nebo sedimentuje.
Aktivovaný kal musí mít vhodné složení, tzn., že musí obsahovat co nejvíce druhů bakteriálních kultur. Inokulum může být namícháno z různých zdrojů (např. z čistírny, z půdního extraktu, z říční vody, atd.). Stanovení aktivity aktivovaného kalu je popsáno v kap. 1. 6. 2 nazvané Funkční kontrola.
IX.1.6.1.4 Příprava pracovních roztoků zkoušené látky
Do zkušební nádoby odměříme 500 ml vody, 2,5 ml.l
-1
minerálního živného roztoku a přidáme aktivovaný kal v množství 0,2 až 1,0 g.l
-1
sušiny v konečné směsi a odpipetujeme takový objem základního roztoku zkoušené látky, aby bylo dosaženo koncentrace rozpuštěného organického uhlíku od 50 do 400 mg.l
-1
suspenze. Odpovídající hodnoty CHSK jsou 100 až 1000 mg.l
-1
. Doplníme vodou na celkový objem 1 - 4 l. Zvolený objem je závislý na počtu odebíraných vzorků nutných ke stanovení hodnot DOC nebo CHSK a na tom, kolik odběrů bude vyžadovat zvolený analytický postup. Zpravidla postačuje objem 2 l. Současně je s každou zkušební sérií nasazena alespoň jedna kontrola, do které je odměřen aktivovaný kal a minerální živné médium doplněné na stejný objem jako má zkoušená směs.
IX.1.6.2 Pracovní postup
Kultivační nádoby se inkubují při difusním světle nebo v tmavé komoře při teplotě 20 - 25 oC, za stálého míchání pomocí magnetického míchadla nebo šroubovitého míchadla. Nádoba se provzdušňuje tlakovým vzduchem, který je čištěn, pokud je to potřebné, vatovým filtrem nebo přes promývačku. Musí být zajištěno, aby nedošlo k usazování kalu a koncentrace rozpuštěného kyslíku neklesla pod 2 mg.l
-1
.
V pravidelných časových intervalech se měří pH (např. denně) a pokud je to potřebné upravuje se na hodnotu pH 7 - 8.
Ztráty vypařováním se vyrovnávají destilovanou nebo deionizovanou vodou vždy před odebráním vzorku. Je účelné označit hladinu kapaliny před začátkem zkoušky a znovu zaznamenat výšku hladiny po odebrání vzorku při vypnuté aeraci a míchaní. První vzorky se odebírají 3 h po zahájení zkoušky, aby aktivovaný kal dostatečně adsorboval zkoušenou látku.
Rozklad zkoušené látky se sleduje stanovením hodnoty DOC a CHSK v pravidelných časových intervalech. Vzorky z nádoby se zkoušenou látkou a z kontroly se před analýzou filtrují na promytém papírovém filtru. Prvních 5 ml filtrátu se vylévá. Kaly, které se špatně filtrují mohou být odděleny 10 min odstředěním. Stanovení DOC a CHSK se provede nejméně dvakrát. Všechny baňky se nechají inkubovat 28 dní.
Poznámka: Vzorky, které jsou po uvedeném postupu ještě zakalené, se filtrují na membránovém filtru, který nesmí uvolňovat nebo adsorbovat organické látky.
Funkční kontrola aktivovaného kalu
Paralelně se ke každé sérii pokusů nasazuje referenční nádoba s kalem, médiem, vodou a referenční látkou, která slouží ke kontrole citlivosti aktivovaného kalu. Doporučován je diethylenglykol.
Adaptace
V relativně krátkých časových intervalech (např. denně) jsou prováděny analýzy a naměřené hodnoty jsou vynášeny do grafu. Na inhibiční křivce lze zpočátku rozlišit tzv. adaptační fázi (viz obr. 2), proto by zkouška neměla být nasazována ke konci týdne. Jestliže na konci normální délky zkoušky dochází znovu k adaptaci, může být zkouška prodloužen až do konečného rozložení zkoušené látky.
Upozornění: Pokud chcete důkladně poznat chování aktivovaného kalu, upravte ho následujícím postupem: Míchadlo a aerační zařízení se vypne, aby se mohl aktivovaný kal usadit. Kapalná fáze se vypustí, dekantovaný kal v nádobě se doplní vodou na objem 2 l, 15 min se míchá a znovu se nechá sedimentovat. Kapalná fáze se znovu vypustí a zkouška se opakuje se sedimentovaným kalem a stejnou zkoušenou látkou podle kap. 1. 6. 1. 4 a 1. 6. 2. Aktivovaný kal může být upraven také centrifugací.
Adaptovaný kal může být smíchán s čerstvým aktivovaným kalem tak, aby bylo dosaženo koncentrace 0,2 - 1 g sušiny na litr suspenze.
Příprava pro analýzu
Vzorky se filtrují přes promyté papírové filtry (k promývání se používá deionizovaná voda).
Zakalené vzorky se filtrují přes membránové filtry (0,45 m).
Ve filtrátech vzorku (prvních 5 ml filtrátu se nepoužívá) se přístrojem na měření TOC stanoví dvakrát koncentrace rozpuštěného uhlíku DOC . Jestliže nemůže být filtrát analyzován v den odběru vzorku, musí být do příštího dne uchován v ledničce. Delší skladování se však nedoporučuje.
CHSK se ve filtrátu vzorku stanoví standardním postupem podle této vyhlášky.
IX.2 VYHODNOCENÍ ZKOUŠKY
Koncentrace DOC a nebo CHSK se ve vzorcích stanoví dle kap. 1. 6. 2 nejméně dvakrát. Biologická rozložitelnost v čase t se vypočítá podle vzorce 1. 2 a její hodnota se zaokrouhluje na celá procenta. Takt stanovená rozložitelnost se označuje jako „Biologická rozložitelnost stanovená Zahn-Wellensovou zkuškou“.
Poznámka: Jestliže je dosaženo úplného rozložení zkoušené látky před řádným proběhnutím zkoušky a výsledek je potvrzen další analýzou provedenou následující den, může být zkouška ukončena.
IX.3 ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
IX.3.1 PROTOKOL O ZKOUšCE
V protokolu o zkoušce by měly být uvedeny následující údaje:
— počáteční koncentrace látky,
— všechny informace a experimentální výsledky (název zkoušené látky, referenční látka, kontrolní vzorek),
— koncentrace látky po 3 h,
— inhibiční křivka s popisem,
— datum a zdroj odběru kalu, stav adaptace, použitá koncentrace atd.,
— vědecké odůvodnění případných změn v provedení zkoušky.
IX.3.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ
Postupné ubývání DOC nebo CHSK během dnů až týdnů naznačuje, že zkoušená látka je biologicky rozkládána. V mnoha případech může ovlivňovat výsledky zkoušky fyzikálně-chemická adsorbce. To lze prokázat tím, že se zjistí úplné nebo částečné odstranění DOC nebo CHSK během prvních tří hodin zkoušky a rozdíl mezi supernatantem z kontroly a ze zkoušeného vzorku je nečekaně malý.
Má-li se rozlišit úplná nebo částečná biologická rozložitelnost od adsorbce, musí se provést další zkoušky.
Ty mohou být provedeny více postupy, nejsprávnější je ale použít supernatant nebo inokulum v některé zkoušce snadné biologické rozložitelnosti (nejlépe v respirometrické zkoušce.
Zkoušené látky, které vykazují velký úbytek DOC nebo CHSK a nejsou ovlivněny adsorbcí lze pokládat za biologicky rozložitelné. Částečný, neadsorbční úbytek znamená, že látka je přinejmenším alespoň částečně biologicky rozložitelná.
Jestliže je úbytek DOC nebo CHSK minimální nebo žádný, mohla nastat inhibice mikroorganismů působením zkoušené látky. Tato inhibice se může projevovat rozpuštěním nebo úbytkem kalu nebo zákalem zkoušené suspenze. V takových případech se zkouška opakuje s nižšími koncentracemi zkoušené látky.
Vyšší citlivosti může být dosaženo specifickými analytickými metodami nebo použitím látek značených 14C. Jestliže je použita zkoušená látka s 14C, je možné stanovením 14CO
2
prokázat, že nastal rozklad zkoušené látky.
Pokud je udáván výsledek jako primární biologická rozložitelnost, měly by být uvedeny, pokud je to možné, změny v chemické struktuře, které způsobily snížení obsahu výchozí, rodičovské, zkoušené látky. Musí se také dokladovat ověření analytické metody a výsledky stanovení v živném médiu bez přídavku zkoušené látky.
IX.4 LITERATURA
(l) OECD Paris, 1981, Test Guideline 302 B, Beschluss des Rates C (81) 330 Final
(2) Anhang V C.9 Abbaubarkeit. Chemischer Sauerstoffbedarf, Richtlinie der Kommission 84/449/EWG (Amtsblatt den Europäischen Gemeinschaften Nr. L 251 vom 19. September 1984).
PŘÍLOHA
PŘÍKLAD VYHODNOCENÍ
       

       Organická látka:                                    4 - ethoxybenzoová kyselina
       Teoretická koncentrace ve zkoušce:                  600 mg.l
-1
Teoretická DOC : 390 mg.l
-1
Inokulum: městská čistírna v ..... Koncentrace: l g sušiny . l
-1
Adaptace: bez adaptace Analytika: stanovení DOC Množství vzorku: 3 ml Referenční látka: diethylenglykol Toxicita zkoušené látky: žádné toxické účinky při koncentraci menší než 1000 mg.l
-1
Použitá zkouška: zkouška ve fermentačních trubicích ------------------------------------------------------------------------------- -------- Referenční látka Zkoušená látka Doba zkoušky sl. p. DOC DOCn Rozklad DOC DOCn Rozklad mg.l
-1
mg.l
-1
mg.l
-1
% mg-l
-1
mg.l
-1
% ------------------------------------------------------------------------------- -------- 0 - - 300 - - 390 - 3 h 4,0 298,0 294,0 2 371,6 367,6 6 1 den 6,1 288,3 282,3 6 373,3 367,2 6 2 dny 5,0 281,2 276,2 8 360,0 355,0 9 5 dnů 6,3 270,5 264,2 12 193,8 187,5 52 6 dnů 7,4 253,3 245,9 18 143,9 136,5 65 7 dnů 11,3 212,5 201,2 33 104,5 93,2 76 8 dnů 7,8 142,5 134,7 55 58,9 51,1 87 9 dnů 7,0 35,0 28,0 91 18,1 11,1 97 10 dnů 18,0 37,0 19,0 94 20,0 2,0 99 ------------------------------------------------------------------------------- -------- Poznámka: DOC stanovena v triplikátech. sl. p. = slepý pokus Obrázek 1 Příklad křivek biologického rozkladu


Obrázek 2 Příklad adaptace kalu


X. METODA PRO STANOVENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI – SIMULAČNÍ ZKOUŠKA S AKTIVOVANÝM KALEM – METODA C.10 PODLE PŘÍLOHY SMĚRNICE 92/69/EHS
X.1 METODA
X.1.1 ÚVOD
X.1.1.1 Obecné poznámky
Metoda je vhodná pouze pro ty organické látky, které v používaných koncentracích:
— jsou natolik rozpustné ve vodě, aby bylo možné připravit zásobní roztok,
— mají za podmínek zkoušky zanedbatelnou tenzi par,
— neinhibují bakterie.
Je užitečné mít informace o relativním podílu nejdůležitějších komponent obsažených ve zkoušeném materiálu, zvláště tehdy, když biologická rozložitelnost dosahuje nízkých nebo marginálních hodnot. Při interpretaci nízkých hodnot biologické rozložitelnosti a volbě vhodné zkušební koncentrace je potřebné znát údaje o toxicitě látky vůči mikroorganismům.
X.1.1.2 Stanovení úplné biologické rozložitelnosti (analýza DOC/CHSK)
Cílem metody je stanovení úplné biologické rozložitelnosti organické látky na základě měření úbytku zkoušené látky a vzniklých metabolitů v koncentracích DOC více než 12 mg.1
-1
(nebo CHSK cca 40 mg.1
-1
) ve zkušebním zařízení s náplní aktivovaného kalu. Prokázalo se, že optimální je koncentrace DOC 20 mg /1.
Je nutné znát obsah organického uhlíku nebo CHSK zkoušené látky.
X.1.1.3 Stanovení primární biologické rozložitelnosti (specifická analýza)
Cílem metody je stanovení primární biologické rozložitelnosti zkoušené látky při koncentraci cca 20 mg/l v modelovém zařízení s aktivovaným kalem (pokud to umožňuje analytická metoda nebo toxicita zkoušené látky, může být použita koncentrace zkoušené látky vyšší nebo nižší). To dovolí odhadnout primární biologickou rozložitelnost zkoušené látky (vymizení původní „rodičovské“ chemické struktury).
Cílem metody není stanovení stupně mineralizace zkoušené látky.
Ke kvantitativní analýze musí být k dispozici vhodná metoda.
X.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
X.1.2.1 Analýza DOC/CHSK
Úbytek látky je vyjádřen vztahem:
   


                T - (E -E
o
) (la) DR = -------------- . 100 % T DR = DOC nebo CHSK úbytek v % vztažený na zkoušenou látku při dané střední době prodlení, T = koncentrace zkoušené látky na přítoku do zkušební jednotky v mg.l
-1
DOC nebo CHSK, E = koncentrace DOC nebo CHSK na odtoku ze zkušební jednotky v mg.l
-1
, E
o
= koncentrace DOC nebo CHSK na odtoku z kontrolní jednotky v mg.l
-1
. Rozklad je definován jako procentuální úbytek DOC nebo CHSK při udané době zdržení, vztažený na zkoušenou látku.
X.l. 2. 2 Specifická analýza
Procentuální odstranění zkoušené látky z vodné fáze (R
w
) během udaného času prodlení:
    
             C
1
- C
0
Rw = ------- . 100 % C
1
(1b) C
1
= koncentrace zkoušené látky v přítoku do zkušebního zařízení (v mg.l
-1
) stanovená specifickou analýzou, C
0
= koncentrace zkoušené látky na odtoku ze zkušebního zařízení (v mg.l
-1
) stanovená specifickou analýzou.
X.l.3 REFERENČNí LÁTKY
Při zkoušení nových látek je někdy vhodné použít referenční látku. Specifické referenční látky doposud nejsou doporučeny.
X.l.4 PRINCIP ZKUŠEBNÍCH METOD
Ke stanovení úplné biologické rozložitelnosti se používají dvě paralelně pracující modelová zařízení s aktivovaným kalem (potvrzující zkouška OECD nebo zařízení s porézní nádobkou). Zkoušená látka se přidává na přítoku do jedné z jednotek (se syntetickou nebo s komunální odpadní vodou), zatímco ve druhé je obsažena pouze odpadní voda. Ke stanovení primární biologické rozložitelnosti pomocí specifické analýzy zkoušené látky na přítoku a odtoku je zapotřebí jedna jednotka.
Na odtoku se měří koncentrace DOC nebo CHSK nebo se stanoví koncentrace zkoušené látky specifickou analýzou.
DOC zkoušené látky se nestanovuje, pouze se konstatuje. Při měření DOC nebo CHSK se vychází z toho, že rozdíl mezi průměrnými koncentracemi na odtoku ze zkušební a z kontrolní jednotky je způsoben nerozloženou částí zkoušených látek.
Jestliže jsou prováděny specifické analýzy, lze stanovovat změny koncentrace původní chemické látky (primární biologická rozložitelnost).
Obě zařízení mohou být provozována jako „spřažená“ pomocí postupu vzájemné inokulace.
X.1.5 KRITÉRIA KVALITY
Koncentrace zkoušené látky se volí s ohledem na druh analytické metody a její mez stanovitelnosti.
X.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
X.1.6.1 Příprava
X.1.6.1.1 Přístroje
Pokud se neprovádí specifická analýza, používají se dvě modelové zkušební jednotky stejného typu. Mohou být používány dva typy zařízení:
Potvrzující zkouška OECD
Zařízení se skládá ze zásobní nádoby (A) na syntetickou odpadní vodu, dávkovacího čerpadla (B), aerační nádoby (C), sedimentační nádoby (D), mamutky (E) k recirkulaci aktivovaného kalu a sběrné nádoby vyčištěné vody (F).
Nádoby (A a F) musí být ze skla nebo z vhodné umělé hmoty objemu nejméně 24 l. Čerpadlo (B) musí zajišťovat konstantní přítok syntetických splašků do aerační nádoby. Použit může být jakýkoliv vhodný systém zajišťující stanovený přítok a koncentraci. Za normálních podmínek je výška separátoru (D) nastavena tak, aby objem kultivační suspenze v aerační nádobě byl 3 l. V dolní části konické části aerační nádoby je ponořena porézní aerační krychlička. Množství dodávaného vzduchu může být kontrolováno průtokoměrem. Mamutka (E) je osazena tak, aby byl aktivovaný kal ze separátoru do aktivační nádoby dopravován rovnoměrně.
Zařízení s porézní nádobkou
Porézní nádobka je vyrobena z porézní polyethylenové fólie (tloušťka 2 mm, maximální velikost pórů 95 mikronů) stočené do válce o průměru 14 cm s konickým dnem 45 o, obrázky 1 a 2 v příloze 2. Porézní nádobka je umístěna v nepropustné nádobě o průměru l5 cm zhotovené z vhodné umělé hmoty, která má nad konickou částí odtok ve výšce 17,2 cm, čímž je v zařízení vymezen objem 3 l. Na horním konci vnitřní nádoby je upevněn kruhový držák tak, že mezi vnější a vnitřní nádobou je 0,5 cm odtoková mezera.
Celé zařízení je umístěno do vodní lázně regulované termostatem. Vzduch je přiváděn na dno vnitřní nádoby pomocí vhodného rozvaděče.
Nádoby (A) a (E) musí být vyrobeny ze skla nebo vhodné umělé hmoty a mají mít objem nejméně 24 l. Čerpadlo (B) umožňuje konstantní přítok odpadních vod do aerační nádoby. Může být použit jakýkoliv vhodný systém za předpokladu, že zaručuje stanovený přítok a koncentraci.
K dispozici musí být zásoba dalších porézních nádobek jako náhrada za zanesené; zanesené nádobky se čistí namočením na 24 hodin do roztoku chlornanu sodného a promytím pitnou vodou.
X.l.6.1.2 Filtrace
Používají se membránové filtrační přístroje a membránové filtry (velikost pórů 0,45 m). Membránový filtr nesmí uvolňovat uhlík ani nesmí adsorbovat zkoušenou látku při filtraci.
X.1.6.1.3 Odpadní voda Může být použito buď vhodné syntetické médium nebo komunální odpadní voda. Příklad syntetického média:
       V 1  l  pitné vody se rozpustí:
       pepton              160 mg,
       masový extrakt      110 mg,
       močovina             30 mg,
       NaCl                  7 mg,
       CaCl
2
. 2 H
2
O 4 mg, MgSO
4
. 7 H
2
O 2 mg, K
2
HPO
4
28 mg. Komunální odpadní vody: Odebírají se čerstvé každý den z přepadu mechanického stupně čistírny, která čistí převážně městské odpadní vody.
X.l.6.1.4 Zásobní roztok zkoušené látky
Připraví se např. l% roztok zkoušené látky, který se bude přidávat do zkušební jednotky. Stanoví se koncentrace zkoušené látky a určí se příslušný objem zásobního roztoku, který je potřebné přidat k odpadní vodě nebo dalším čerpadlem přímo do zkušební jednotky, aby byla dosažena požadovaná zkušební koncentrace.
X.1.6.1.5 Inokulum
Poznámka: Je-li používána komunální odpadní voda není vhodné používání inokula s malou koncentrací bakterií, ale má se používat aktivovaný kal.
Mohou se používat inokula z různých zdrojů.
Příklady vhodného inokula:
a) Inokulum z odtoku biologické čistírny odpadních vod Inokulum může být získáno z odtoku dobře fungující čistírny zpracovávající převážně komunální odpadní vody. Vzorek odtoku musí být v době mezi odběrem a použitím uchován v aerobních podmínkách. Inokulum se připraví filtrací vzorku vody přes hrubý filtr, prvních 200 ml filtrátu se vylije. Až do okamžiku použití se filtrát uchovává v aerobních podmínkách. Inokulum musí být použito ve stejný den kdy bylo připraveno. K inokulaci se užívá nejméně 3 ml.
b) Směsné inokulum
Inokulum odebrané z odtoku čistírny:
Viz předchozí popis.
Inokulum z půdy:
100 g zahradní zeminy (úrodná, nesterilní zemina) se suspenduje v l l nechlórované pitné vody (nevhodné jsou zeminy s vysokým obsahem jílu, písku a humusu). Po zamíchání se nechá suspenze 30 minu dekantovat. Kapalná fáze se přefiltruje, prvních 200 ml se vylije. Filtrát se ihned provzdušňuje až do okamžiku použití. Inokulum je možné použít pouze ten den, kdy bylo připraveno.
Inokulum z povrchové vody:
Další díl směsného inokula se získává z mesosaprobních povrchovým vod. Odebraný vzorek se filtruje, prvních 200 ml se vylije. Až do okamžiku použití se filtrát udržuje v aerobních podmínkách. Inokulum musí být použito pouze ten den, kdy bylo připraveno.
Směsné inokulum se získá smísením a dobrým promícháním stejných objemových dílů všech tří dílčích inokulí. K očkování se používají nejméně 3 ml směsného roztoku.
c) Inokulum z aktivovaného kalu
Používá se aktivovaný kal (s obsahem suspendovaných pevných částic do 2,5 g/l) odebraný z aerační nádrže čistírny komunálních odpadních vod.
X.1.6.2 Postup
Zkouška se provádí při laboratorní teplotě, která se má udržovat mezi 18 - 25 st. C.
Zkouška může být event. prováděna při nižších teplotách (do 10 st. C). Pokud se zkoušená látka za těchto podmínek rozkládá, nejsou zapotřebí žádná další měření. Jestliže však při nižší teplotě rozkládána není, musí být zkouška opakována při teplotě 18 - 25 st. C.
X.1.6.2.1 Fáze zapracování: tvorba kalu/stabilizace kalu
Fází růstu/stabilizace kalu je období, během kterého dochází za provozních podmínek k ustálení koncentrace aktivovaného kalu a funkce zkušební jednotky Rozběhová fáze začíná první vsádkou zkoušené látky a končí dobou, kdy naměřený úbytek zkoušené látky dosáhne relativně konstantní hodnoty. Tato fáze by neměl trvat déle než 6 týdnů.
Hodnotící fáze je doba trvající 3 týdny od okamžiku kdy úbytek zkoušené látky dosáhl relativně konstantní, zpravidla vysoké, hodnoty. Pro látky, které se během šest týdnů trvající rozběhové fáze nerozkládají nebo jejich úbytek dosahuje nízkých hodnot se za vyhodnocovací fázi považuje období dalších tří následujících týdnů.
Na začátku zkoušky se zkušební jednotka(y) naplní zkušební kapalinou s inokulem.
Zapne se provzdušňování a mamutka (při použití zkušebního zařízení podle OECD) a zapne se dávkovací zařízení.
Přítok odpadních vod bez zkoušené látky do aerační nádoby se udržuje na rychlosti l l.h
-1
nebo l/2 l.h
-1
; doba zdržení tak dosáhne 3 h nebo 6 h.
Intenzita provzdušňování musí být regulována tak, aby se udržoval obsah aerační nádoby ve vznosu a obsah rozpuštěného kyslíku neklesl pod hodnotu 2 mg.l
-1
.
Pěnění směsi se zabraňuje vhodnými prostředky, které neinhibují kal.
Kal, který se shromažďuje v horní části aerační nádoby a u průkazné zkoušky OECD na dně sedimentační nádoby a v cirkulačním okruhu musí být alespoň jednou za den vracen do matečné suspenze setřením nebo jiným vhodným způsobem.
Jestliže kal špatně sedimentuje lze zvýšit jeho hustotu přídavkem 2 ml 5% roztoku chloridu železitého. Přídavek je možné opakovat podle potřeby.
Odtok ze sedimentační nádrže se shromažďuje v nádobách E nebo F po dobu 20 - 24 hod. Před odebráním vzorku se směs důkladně promíchá. Nádoby E a F se musí pečlivě čistit.
Pro potřeby sledování účinnosti procesu a pro potřeby jeho řízení se stanoví nejméně dvakrát týdně CHSK nebo DOC zfiltrovaného průměrného vzorku výtoku ze zařízení a filtrované směsi dávkované do zařízení. K filtraci se používá membránový filtr s velikostí pórů 0,45 m.
Prvních 20 ml filtrátu se vylije.
Pokud se rozkladné procesy ustálí, vyrovnají se i poklesy CHSK nebo DOC.
Sušina kalu v aerační nádobě se stanovuje dvakrát týdně (g.l
-1
).
Zařízení mohou být provozována dvěma způsoby: pokud je sušina kalu vyšší než 2,5 g.l
-1
přebytečný kal se vypustí nebo se denně odebere z každé nádoby 500 ml suspenze, takže střední doba zdržení kalu v zařízení je 6 dní.
Jestliže jsou naměřené a hodnocené parametry (účinnost metody stanovená na základě úbytku CHSK nebo DOC, koncentrace kalu, schopnost sedimentace kalu, zákal kapalné fáze v sedimentační nádobě atd.) dvou jednotek dostatečně stabilní, může být zahájeno přidávání zkoušené látky dle kap. 1. 6. 2. 2 do nátoku do jedné z jednotek.
Alternativně může být zkoušená látka přidávána na začátku fáze růstu kalu (1. 6. 2. 1), zvlášť tehdy, když je jako inokulum používán aktivovaný kal.
X.1.6.2.2 Pracovní postup
Za dodržování podmínek pro rozběhovou fázi se do přítoku do zkušebního zařízení přidává zásobní roztok zkoušené látky (cca 1 %), aby obsah DOC v suspenzi byl v rozmezí 10 - 20 mg.l
-1
nebo CHSK 40 mg.l
-1
. Zásobní roztok se buď denně přimíchává do odpadní vody nebo se přivádí pomocí čerpadla přímo do suspenze. Koncentrace se postupně zvyšuje až na požadovanou hodnotu. Vyzkoušeny mohou být i vyšší koncentrace než udává předchozí odstavec, pokud nemá zkoušená látka na aktivovaný kal toxické účinky.
Do kontrolní jednotky se dávkuje pouze odpadní voda bez zkoušené látky. Z odtoku se odebírají vzorky pro analýzu a filtrují se na membránovém filtru s velikostí pórů 0,45 m. Prvních 20 ml filtrátu se vylévá. Filtráty vzorků musí být analyzovány v den odběru nebo musí být konzervovány (např. přídavkem 0,05 ml 1% chloridu rtuťnatého na 10 ml filtrátu, uložením na 24 h při teplotě 2 - 4 st. C nebo při -18 st. C na delší dobu). Doba trvání rozběhové fáze od okamžiku přídavku zkoušené látky by neměla překročit 6 týdnů.
Vyhodnocovací fáze by neměla být kratší než 3 týdny, aby bylo možné provést 14 - 20 stanovení nutných k vyhodnocení zkoušky.
Spřažená zařízení
Zařízení jsou spřažena tak, že je mezi nimi 1x denně vyměňováno 1,5 l suspenze (včetně kalu) z aeračních nádob. Dochází-li k silné adsorbci zkoušené látky, odebere se 1,5 l kapalné fáze ze sedimentační nádoby a přidává se do aerační nádoby druhého zařízení.
X.1.6.2.3 Analytika
Ke sledování chování zkoušené látky se používají dvě metody stanovení:
DOC a CHSK.
Hodnoty DOC se stanoví dvakrát pomocí analyzátoru uhlíku a CHSK se stanoví podle literatury (2).
Specifická analýza
Koncentrace zkoušené látky se stanoví vhodnou analytickou metodou. Je-li to možné, stanoví se zvlášť množství látky adsorbované na aktivovaný kal.
X.2 DATA A VYHODNOCENÍ
X.2.1 SPŘAŽENÁ ZAŘÍZENÍ
Pokud je používáno spřažené zařízení, počítá se denně stupeň odstranění, DR, postupem podle 1. 2. 1.
Tyto denní hodnoty se opraví na hodnotu Dr
c
, zohledněním přenosu materiálu při očkování. Tento výpočet se provádí dle rovnice (2) pro střední dobu prodlení 3 hodiny a podle rovnice (3) pro střední dobu prodlení 6 hodin.
 
          8         100
   DR
c
- --- DR - ----- (2) 7 7 4 100 DR
c
- --- DR - ----- (3) 3 3 Ze získaných hodnot se vypočítá jejich průměr a dále standardní odchylka podle rovnice (4)


(4) kde: sL = standardní odchylka, --- DRc = průměr hodnot DRc, n = počet stanovení. Odlehlé hodnoty DR
c
se eliminují vhodnou statistickou metodou, např. Nalimovou metodou (6) pro 95% hladinu významnosti, průměr a standardní odchylka se potom vypočtou s vyloučením odlehlých hodnot Dr
c
: Výsledek se vyjádří dle (5) : --- DR
c
= DR
c
+/- Tn
-1
;alfa ---------- (5) odmocnina n kde tn
-1
; = tabulková hodnota t pro n dvojic hodnot e a Eo a statistickou mez spolehlivosti P (P=1-), kde P = 95% (l). Výsledkem je průměr s udanými mezemi tolerance pro 95% hladinou významnosti případně s udanou standardní odchylkou, počtem dat hodnot DRc bez odlehlých hodnot a počtem odlehlých hodnot. Např. DR
c
= 98,6 +/- 2,3% úbytku DOC, s = 4,65% úbytku DOC, n = 18, x = počet odlehlých hodnot.
X.2.2 NESPŘAŽENÁ ZAŘÍZENÍ Provozní výkon zařízení může být ověřen následovně:
   % odstranění CHSK nebo DOC =
         
          CHSK nebo DOC odp. vody - CHSK nebo DOC výtoku
        = -----------------------------------------------      . 100
                         CHSK nebo DOC odp. vody

       Vynášením  denně naměřených úbytků do grafu se  zdůrazní
       všechny trendy, např. adaptace.
X.2.2.1 Využití stanovení CHSK/DOC
Z denně naměřených hodnot se podle kap. 1.2.1 vypočítá procentuální úbytek DR.
  
       Z  řady  hodnot  DR  se spočítá jejich  průměr  a  podle
       rovnice (6) standardní odchylka:




(6) kde sL = standardní odchylka hodnot Dr
i
, --- DR = průměr hodnot Dr
i
, n = počet stanovení. Odlehlé hodnoty DR se eliminují vhodnou statistickou metodou např. podle Nalimova (6) při 95% hladině významnosti, střední hodnota a standardní odchylka jsou potom znovu vypočítány s vyloučením odlehlých hodnot DR. Výsledná hodnota se počítá dle rovnice (7) --- DR
c
= DR
c
+/- Tn
-1
;alfa ---------- (7) odmocnina n kde tn
-1
;alfa - tabulková hodnota t pro n dvojic hodnot e a E
o
a statistickou n mez spolehlivosti P (P=1-alfa), kde P = 95 % (l). Výsledkem je průměr s mezemi tolerance při 95% hladině významnosti s udanou standardní odchylkou, počtem dat hodnot DR bez odlehlých hodnot a počtem odlehlých hodnot. Např.: Dr = (98,6 +/- 2,3%) úbytku DOC, s = 4,65% úbytku DOC, n = 18, x = počet odlehlých hodnot.
X.2.2.2 Použití výsledků specifické analýzy
Odstranění zkoušené látky z vodné fáze (Rw) v % se počítá podle 1. 2. 2.
X.3 ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
X.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
V protokolu o zkoušce by měly být uvedeny pokud je to možné následující údaje:
— provozní podmínky, které jsou zaznamenány do formuláře uvedeného v příloze č. 3 této metody;
— druh použitého zkušebního zařízení (zařízení pro průkaznou zkoušku OECD nebo zařízení s porézní nádobkou);
— způsob provozování zařízení: spřažená nebo nespřažená zařízení;
— druh odpadních vod: syntetické nebo komunální odpadní vody, u komunálních odpadních vod datum a místo odběru;
— druh inokula, datum a místo odběru;
— popis použitých analytických metod, pokud byly prováděny specifické analýzy;
— grafické vyjádření závislosti úbytku CHSK nebo DOC na čase ve fázi rozběhové a vyhodnocovací;
— výsledek stanovení obsahu zkoušené látky prostřednictvím CHSK nebo DOC v zásobním roztoku;
— při provádění specifické analýzy: grafické vyjádření procentuálního úbytku zkoušené látky z kapalné fáze během rozběhové a vyhodnocovací fáze v závislosti na čase;
— střední úbytek DOC nebo CHSK zkoušené látky a standardní odchylka výsledků získaných během vyhodnocovací fáze, kdy úbytek zkoušené látky je konstantní;
— grafické vyjádření koncentrace aktivovaného kalu v závislosti na čase;
— poznámky týkající se aktivovaného kalu (odstraňování přebytečného kalu ze zařízení, tvorba shluků, použití chloridu železitého atd.);
— proměřované koncentrace zkoušené látky;
— výsledky analýz kalu;
— všechny informace o zkoušené látce a o referenční látce, pokud byla použita;
— vědecké zdůvodnění všech odchylek a změn metody.
X.3.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ
Příčinou nízké hodnoty úbytku zkoušené látky z vodné fáze může být inhibice mikroorganismů způsobená touto látkou. Projevuje se to především rozpouštěním a ztrátou kalu, zakalováním kapalné fáze a snížením účinnosti odstraňování CHSK nebo DOC v zařízení.
Někdy hraje roli fyzikálně-chemická adsorbce. Vztah mezi biologickým působením na látku a její fyzikálně- chemickou adsorpcí je možné rozlišit po odpovídající desorpci.
K rozlišení úplného nebo částečného biologického rozkladu od adsorbce je nutno provést další zkoušky.
Nabízí se zde více možností. Nejlepším postupem je použití kapalné fáze ze sedimentační nádoby jako inokula v některé ze zkoušek snadné biologické rozložitelnosti (nejlépe v respirometrické zkoušce). Vysoké hodnoty úbytku DOC nebo CHSK jsou zpravidla způsobovány biologickým rozkladem, nízké hodnoty úbytku naproti tomu nelze odlišit od jiných mechanizmů odstranění látky. Pokud např. rozpustná sloučenina vykazuje stupeň adsorbce 98 % a denně je odstraňováno 10 % kalu, dochází až ke 40 % odstranění látky v tomto kalu. Je-li denně odstraňováno 30 % kalu, může eliminace na základě adsorbce a odstranění kalu stoupnout na 65 % (4):
Při používání specifických analýz je třeba brát na zřetel vliv struktury látky na specifickou analýzu. Úbytek látky stanovený specifickou analýzou nemůže být interpretován jako mineralizace látky.
X.4 LITERATURA
(l) OECD, Paris 1981, Test Guideline 303 A, Decision of the Council C (81) 30 final.
(2) Annex V C9 Degradation Test - Chemical Oxygen Demand, Commission Directive 84/449/EEC,Official Journal of the European Communities, No L 251,19. 9. 1984).
(3) H. A. Painter and E. F. King, WRC Porous Pot method for asessing biodegradability. Technical report TR7O. June 1978, Water Research Center, Velká Británie.
(4) Wierich P. and Gerike P., The Fate of Soluble, Recalcitrant, and Absorging Compounds in Activated Sludge Plants, Ecotoxicology and Enviromental Safety, Vol 5, Nr. 2 - June 1981, str. 161 - 171.
(5) Council Directives 82/242/EEC und 82/243/EEC, Official Journal of the European Communities, No L109, 22. 4. 1982, amending Council Directives 73/404/EEC und 73/405/EEC on biodegradability of detergents, Official Journal of the European Communities, No L347, 17. 12. 1973.
(6) Streuli, H., Fehlerhafte Interpretation und Anwendung von Ausreissetest, insbesondere bei Rindversuchen zur Überprüfung analytisch-chemischer Untersuchungsmethoden, Fressenius-Zeitschrift für Analytische Chemie (1980), str. 406 - 408.
PŘÍLOHA 1
                         
Obrázek 1
                               
                               



A = zásobník E = mamutka B = dávkovací zařízení F = zásobník na výtok C = aerační komora (objem 3 litry) G = aerátor D = sedimentační nádoba H = průtokoměr (nepovinně) Obrázek 2


PŘÍLOHA 2
                               
Obrázek 1
Zařízení používané pro stanovení biologické rozložitelnosti
                               



A = zásobník E = zásobník na výtok B = dávkovací čerpadlo F = vzduchovací kámen C = porézní aerační nádobka G = rotametr D = vnější nepropustná nádoba Obrázek 2 Detaily třílitrové vzduchovací porézní nádobky


PŘÍLOHA 3
Provozní podmínky simulační zkoušky s aktivovaným kalem
Označ v každé skupině
       
       Zařízení:
        průkazná zkouška OECD                      
        zařízení s porézní nádobkou                
       
       Způsob provozu:
        samostatná jednotka                                
        spřažená zařízení                          
        nespřažená zařízení                        
       
       Přeočkování:
        žádné                                          
        aktivovaným kalem                              
        kapalnou fází vzniklou odstraněním sedimentu   
       
       Střední doba zdržení:
        3 hodiny                                   
        6 hodin                                    
       
       Živné médium:
        komunální odpadní voda                     
        syntetická odpadní voda                    
       
       Inokulum:
        z čistírny odpadních vod                   
        směsné inokulum                            
        aktivovaný kal                             
       
       Přidávání zkoušené látky:
        na začátku                                 
        postupně                                   
        po vytvoření kalu                          
       
       Analýzy:
        specifická                                 
        CHSK                                       
        DOC                                        

XI. METODA PRO STANOVENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI – ZKOUŠKA INHIBICE DÝCHÁNÍ AKTIVOVANÉHO KALU – metoda C.11 podle přílohy směrnice 92/69/EHS
XI.1 METODA
XI.1.1 ÚVOD
Popsaná metoda hodnotí vliv zkoušené látky na mi kroorganizmy měřením intenzity jejich dýchání za defino vaných podmínek v přítomnosti různých koncentrací zkoušené látky.
Účelem této metody je poskytnout rychlou vyhledávací metodu, kterou je možné určit látky, které mohou nepříznivě ovlivnit aerobní mikrobiální čistírny vod, a naznačit vhodné koncentrace zkoušených látek, které nejsou inhibující a které je možno použít ve zkouškách biologické rozložitelnosti.
Definitivní zkoušce může předcházet zkouška pro nale zení pracovní oblasti. Může poskytnout informace o oboru koncentrací, které je možné použít v hlavní zkoušce.
Do schématu zkoušky jsou zařazeny dvě kontroly, jedna na začátku a druhá na konci řady pokusů. Každou dávku aktivovaného kalu je také nutno kontrolovat s použitím referenční látky.
Tato metoda se nejsnáze aplikuje na látky, které díky své rozpustnosti a nízké těkavosti zůstávají ve vodě.
U látek s nízkou rozpustností v médiích používaných ve zkoušce může být nemožné stanovit EC
50
.
Pokud má zkoušená látka sklon k rozkladu oxidační fosforylací mohou výsledky založené na absorpci kyslíku vést k nesprávným závěrům,
Pro provedení zkoušky je užitečné znát následující informace:
— rozpustnost ve vodě,
— tlak par,
— strukturní vzorec,
— čistota zkoušené látky.
Doporučení:
Aktivovaný kal může obsahovat potenciálně patogenní organizmy a je třeba s ním zacházet opatrně.
XI.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
Respirační rychlost je spotřeba kyslíku mikroorganizmy odpadních vod v aerobním kalu, obecně vyjádřená jako mg O
2
na 1 mg kalu za hodinu.
Pro výpočet inhibičního účinku zkoušené látky při určité koncentraci se respirační rychlost vyjadřuje jako procento průměrné hodnoty dvou kontrolních respiračních rychlostí:
                2R
s
(1 - ------------- ) = %inhibice RC
1
+ RC
2
kde: R
s
= rychlost spotřeby kyslíku při použité koncentraci zkoušené látky, Rc
1
= rychlost spotřeby kyslíku v kontrolní zkoušce 1, Rc
2
= rychlost spotřeby kyslíku v kontrolní zkoušce 2. EC
50
v této zkoušce je koncentrace zkoušené látky, při které respirační rychlost činí 50 % hodnoty vycházející z kontrolní zkoušky za podmínek popsaných v této metodě.
XI.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Jako referenční látku se doporučuje používat známý inhibitor dýchání 3,5-dichlorfenol. Ověřením EC
50
u každé dávky aktivovaného kalu by mělo být zkontrolováno, že kal není abnormálně citlivý.
XI.1.4 PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY
Rychlost dýchání aktivovaného kalu vyživovaného standardním množstvím syntetické odpadní vody se měří po době kontaktu 30 minut, 3 hodin nebo v obou časech.
Měří se také rychlost dýchání téhož aktivovaného kalu v přítomnosti různých koncentrací zkoušené látky za jinak stejných podmínek. Inhibiční efekt zkoušené látky při určité koncentraci se vyjadřuje jako procento průměrné rychlosti dýchání ze dvou kontrolních pokusů. Hodnota EC
50
se vypočítá ze stanovení při různých koncentracích.
XI.1.5 KRITÉRIA KVALITY
Výsledky zkoušky jsou platné, jestliže:
— respirační rychlosti dvou kontrolních pokusů se od sebe liší nejvýše o 15 %,
— EC
50
(pro 30 minut nebo pro 3 hodiny) 3,5- dichlorfenolu leží v přijatém rozmezí 5 - 30 mg.l
-1
.
XI.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
XI.1.6.1 Činidla
XI.1.6.1.1 Roztoky zkoušené látky
Roztoky zkoušené látky se připravují čerstvé na začátku studie s použitím zásobního roztoku. Použije-li se níže popsaný postup, je vhodná koncentrace zásobního roztoku 0,5 g.l
-1
.
XI.1.6.1.2 Roztok kontrolní látky
Roztok 3,5-dichlorfenolu lze připravit například rozpuštěním 0,5 g 3,5-dichlorfenolu v 10 ml 1 M NaOH, zředěním destilovanou vodou přibližně na 30 ml, přidáním 0,5 M H2SO4 do bodu začínajícího srážení ( je třeba asi 8 ml 0,5 M H2SO4) a konečným doplněním směsi destilovanou vodou na 1 litr. pH musí potom ležet mezi 7 a 8.
XI.1.6.1.3 Syntetická odpadní voda
Používaná syntetická odpadní voda se připraví rozpuštěním následujícího množství látek v 1 litru vody:
— 16 g peptonu,
— 11 g masového extraktu,
— 3 g močoviny,
— 0,7 g NaCl,
— 0,4 g CaCl
2
.2H
2
O,
— 0,2 g MgSO
4
.7H
2
O,
— 2,8 g K
2
HPO
4
.
Poznámka 1: Tato syntetická odpadní voda má stonásobnou koncentraci oproti vodě popsané v technické zprávě OECD "Návrh metody stanovení biologické rozložitelnosti povrchově aktivních látek používaných v syntetických detergentech" (11.6.1976), s přídavkem monohydrogenfosforečnanu draselného.
Poznámka 2: Nepoužije-li se připravené médium ihned, je nutné je přechovávat v temnu při 0 - 4 st. C ne déle než jeden týden za podmínek, které nezpůsobují žádné změny v jeho složení. Médium je také možné před uschováním sterilizovat, nebo je možné pepton a masový extrakt přidat krátce před provedením zkoušky. Před použitím je nutné médium důkladně promíchat a upravit pH.
XI.1.6.2 Aparatura
Měřicí aparatura: Přesná konstrukce není podstatná. Musí však mít volný prostor nad kapalinou a sonda musí přesně zapadat do hrdla odměrné baňky.
Z běžného laboratorního vybavení je třeba zejména toto: — měřicí přístroje,
— provzdušňovací zařízení,
— měřič pH a monitorovací zařízení,
— kyslíková elektroda.
XI.1.6.3 Příprava inokula
Jako mikrobiální inokulum pro zkoušku se používá akti vovaný kal z čistírny odpadních vod čistící převážně domovní odpadní vody.
Je-li to nutné, je možné při dodání kalu do laboratoře odstranit hrubé částice krátkodobým usazením (např. 15 minut) a dekantovat horní vrstvu jemnějších tuhých částic pro použití. Alternativně je možné kal po několik sekund.promíchat.
Lze-li mimoto předpokládat, že je přítomna látka mající inhibiční účinek, je nutné kal promýt vodovodní vodou nebo izotonickým roztokem. Po zcentrifugování se roztok nad usazeninou dekantuje (tento postup se opakuje třikrát).
Malé množství kalu se zváží a vysuší. Z výsledku je možné vypočítat množství vlhkého kalu, které je nutné suspendovat ve vodě, aby se získal aktivovaný kal v oblasti koncentrací suspendovaných tuhých látek ve směsné kapalině mezi 2 a 4 g.l
-1
. Dodrží-li se níže doporučený postup získá se zkušební médium s koncentrací kalu 0,8 a 1,6 g.l
-1
.
Není-li možné kal použít v den kdy byl shromážděn přidá se ke každému litru aktivovaného kalu, při praveného tak, jak je popsáno výše, 50 ml syntetické odpadní vody, potom se provzdušňuje přes noc při 20 +/- 2 st. C. Poté se udržuje za provzdušňování pro použití během dne. Před použitím se zkontroluje pH a je-li třeba, upraví se na 6 - 8. Obsah suspendovaných tuhých látek ve směsné kapalině je třeba stanovit, jak je popsáno v předchozím odstavci.
Požaduje-li se použití stejné dávky kalu v následující dny (nejvýše po čtyři dny), přidává se na konci každého pracovního dne dalších 50 ml syntetické odpadní vody na litr kalu.
XI.1.6.4 Provedení zkoušky
 
       Trvání/doba kontaktu:   30  minut  a  (nebo)  3  hodiny,
                               během kterých probíhá provzdušňování
       Voda:                   Pitná voda (v případě potřeby zbavená chlóru)
       Přívod vzduchu:         Čistý  vzduch, prostý  oleje.   Průtok
                               0,1 - 1 l.min
-1
. Měřicí aparatura: Baňka s plochým dnem, jaká se používá pro stanovení BSK. Měřič obsahu kyslíku: Vhodná kyslíková elektroda, se zapisovačem. Živný roztok: Syntetická odpadní voda (viz výše). Zkoušená látka: Roztok zkoušené látky se připraví čerstvý na začátku zkoušky. Referenční látka: např. 3,5-dichlorfenol (nejméně tři koncentrace) Kontrolní zkouška: Naočkovaný vzorek bez zkoušené látky Teplota: 20 +/- 2 st. C
Dále je uveden navržený experimentální postup, kterého je možné použít jak pro zkoušenou, tak pro referenční látku, pro dobu kontaktu tři hodiny:
Používá se několika nádob (např. jednolitrových kádinek).
Je třeba použít alespoň pět koncentrací, odstupňovaných o konstantní faktor nepřevyšující pokud možno 3,2.
V okamžiku "0" se 16 ml syntetické odpadní vody doplní vodou na 300 ml. Přidá se 200 ml mikrobiálního inokula a výsledná směs (500 ml) se převede do první nádoby (první kontrola C1).
Nádoby, používané v pokusu, je nutné nepřetržitě provzdušňovat, aby bylo zaručeno, že koncentrace rozpuštěného kyslíku nepoklesne pod 2,5 mg.l
-1
a aby těsně před měřením rychlosti dýchání činila koncentrace kyslíku přibližně 6,5 mg.l
-1
.
V okamžiku "15 minut" (15 minut je libovolně zvolený, avšak vhodný interval) se opakuje totéž až na to, že se k 16 ml syntetické odpadní vody před doplněním vodou na 300 ml a přidáním mikrobiálního inokula na celkový objem 500 ml přidá 100 ml zásobního roztoku zkoušené látky. Tato směs se pak převede do druhé nádoby a provzdušňuje se jako výše. Tento postup se opakuje v 15- minutových intervalech s různými objemy zásobního roztoku zkoušené látky, čímž se získá řada nádob obsahujících různé koncentrace zkoušené látky. Nakonec se připraví druhá kontrolní nádoba.
Po třech hodinách se zaznamená pH, dobře promíchaný vzorek obsahu první nádoby se převede do měřicí aparatury a v době do 10 minut se změří rychlost dýchání.
Stanovení se opakuje u obsahu každé z nádob v 15minutových intervalech tak, že doba kontaktu v každé nádobě je tři hodiny.
Referenční látka se zkouší na každé dávce mikrobiálního inokula týmž způsobem.
Mají-li se měření provádět po 30 minutách kontaktu, je třeba použít jiného režimu (např. použití více než jednoho měřiče kyslíku).
Vyžaduje-li se měření chemické spotřeby kyslíku, připraví se další nádoby, obsahující zkoušenou látku, syntetickou odpadní vodu a čistou vodu, ale ne aktivovaný kal. Spotřeba kyslíku se měří a zaznamená po době provzdušňování 30 minut a (nebo) tři hodiny (doba kontaktu).
XI.2 VÝSLEDKY A VYHODNOCENÍ
Rychlost dýchání se vypočítá ze záznamu zapisovače mezi přibližně 6,5 mg.l
-1
a 2,5 mg.l
-1
, nebo za desetiminutovou periodu, je-li rychlost dýchání nízká. Část respirační křivky, ze které se vyhodnocuje rychlost dýchání, musí být lineární.
Jestliže rychlosti dýchání v obou kontrolních pokusech neleží v rozmezí 15 % od sebe navzájem, nebo EC
50
(za 30 minut nebo tři hodiny) referenční látky neleží v akceptovaném rozmezí (5 - 30 mg.l
-1
pro 3,5- dichlorfenol), je zkouška neplatná a musí se opakovat.
Pro každou zkušenou koncentraci (viz bod 1. 2) se vypočte inhibice v %. Inhibice v % se vynese proti koncentraci na logaritmicko-normálním (nebo logaritmicko-pravděpodobnostním) papíru a odečte se hodnota EC
50
.
Standardními postupy je možné stanovit pro hodnoty EC
50
95% meze spolehlivosti.
XI.3 ZPRÁVA
XI.3.1 PROTOKOL O ZKOUšCE
Je-li to možné, má protokol o zkoušce obsahovat tyto informace:
— zkoušená látka: chemické identifikační údaje,
—- systém použitý při zkoušce: zdroj, koncentrace a veškerá předběžná úprava aktivovaného kalu,
— experimentální podmínky:
— pH reakční směsi před měřením respirace,
— teplota při zkoušce,
— ba trvání zkoušky,
— referenční látka a její změřená EC
50
,
— abiotická spotřeba kyslíku (pokud k ní dochází).
— výsledky:
— veškeré naměřené hodnoty,
— křivka inhibice a metoda výpočtu EC
50
,
— EC
50
a je-li možné 95% meze spolehlivosti, EC20 a EC80,
— veškerá pozorování a veškeré odchylky od této zkušební metody, které mohly ovlivnit výsledek.
XI.3.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ
Hodnotu EC
50
je třeba považovat pouze za orientační hodnotu pravděpodobné toxicity zkoušené látky buď při zpracování odpadních vod aktivovaným kalem, nebo pro mikroorganizmy v odpadních vodách, protože složité interakce, ke kterým dochází v životním prostředí, nelze přesně simulovat laboratorní zkouškou. Mimoto, zkoušené látky, které mohou mít inhibiční účinky na oxidaci amoniaku, mohou také způsobovat atypické inhibiční křivky. Proto je nutné interpretovat tyto křivky opatrně.
XI.4 LITERATURA
(1) International Standard ISO 8192-1986.
(2) Broecker, B., Zahn, R., Water Research 11, 1977, str. 165
(3) Brown, D., Hitz, H.R., Schaefer, L., Chemosphere 10, 1981, str. 245
(4) ETAD (Ecological and Toxicological Association of Dyestuffs Manufacturing Industries - Ekologická a toxikologická asociace průmyslu výroby barviv),
Recommended Method No 103, také popsáno v:
(5) Robra, B., Wasser/Abwasser 117, 1976, str. 80
(6) Schefer, W., Textilveredlung 6, 1977, str. 247
(7) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 209, Decision of the Council C(81) 30 final.
XII. METODA PRO STANOVENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI – MODIFIKOVANÁ ZKOUŠKA SCAS – METODA C.12 PODLE PŘÍLOHY SMĚRNICE 92/69/EHS
XII.1 METODA
XII.1.1 ÚVOD
Cílem této metody je hodnocení potenciální úplné biologické rozložitelnosti netěkavých organických látek rozpustných ve vodě, jsou-li vystaveny poměrně vysokým koncentracím mikroorganizmů po dlouhé časové období. Životaschopnost mikroorganizmů se udržuje po tuto dobu denními přídavky živin z usazené odpadní vody. (Pro potřebu během víkendů lze odpadní vodu přechovávat při 4 oC. Alternativně je možné použít syntetickou odpadní vodu podle potvrzující zkoušky OECD.)
Při interpretaci výsledků (viz 3. 2) je nutné brát v úvahu, že může docházet k fyzikálně-chemické adsorpci na suspendovaných tuhých látkách.
V důsledku dlouhé doby zdržení kapalné fáze (36 hodin) a průběžného přidávání živin nesimuluje zkouška podmínky existující v čistírně odpadních vod. Výsledky získané při pokusech s různými látkami ukazují, že zkouška má vysoký potenciál biologického rozkladu.
Podmínky poskytované zkouškou jsou vysoce příznivé pro výběr a adaptaci mikroorganizmů schopných rozkládat zkoušenou látku. (Postup je možné použít také k získávání aklimatizovaných inokulí pro použití v jiných zkouškách.)
V této metodě se používá k hodnocení výsledné bio logické rozložitelnosti zkoušené látky hodnota koncentrace rozpuštěného organického uhlíku (DOC). DOC se doporučuje raději stanovit po okyselení a přečištění než jako rozdíl C
celk.
- C
anorg
. .
Současné použití specifické analytické metody může umožnit určení primárního rozkladu látky (úbytek výchozí chemické struktury). Metoda je použitelná pouze pro ty organické látky, které v koncentracích používaných ve zkoušce:
— jsou rozpustné ve vodě (alespoň 20 mg rozpuštěného organického uhlíku na litr),
— mají zanedbatelnou tenzi par,
— nepůsobí inhibičně na bakterie,
—- významně se neadsorbují ve zkušebním systému,
— neztrácejí se ze zkoušeného roztoku pěněním.
Je nutné stanovit obsah organického uhlíku ve zkoušené látce. Při interpretaci získaných výsledků, zejména v případech, kdy výsledky jsou nízké nebo marginální, jsou cenné informace o relativních podílech hlavních složek ve zkoušeném vzorku
Pro interpretaci nízkých výsledků a při volbě vhodné koncentrace při zkoušce mohou být užitečné informace o toxicitě látky pro mikroorganizmy.
XII.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
       CT =     koncentrace   zkoušené   látky    na    začátku
           provzdušňovací  periody,  vyjádřená  jako   množství
           organického  uhlíku  přítomného  nebo  přidaného   k
           usazené odpadní vodě (mg.l
-1
), Ct = koncentrace rozpuštěného organického uhlíku v kapalině nad usazeninou, ve zkoušce, na konci provzdušňovací periody (mg.l
-1
), Cc = koncentrace rozpuštěného organického uhlíku v kapalině nad sedimentem, v kontrolní zkoušce, na konci provzdušňovací periody (mg.l
-1
). Biologický rozklad je v této metodě definován jako úbytek organického uhlíku. Biologický rozklad je možné vyjádřit jako: 1. Procentický úbytek Dda množství denně přidávané látky: C
T
- (C
1
- C
c
) D
da
= ----------------- . 1000 (1) C
T
kde D
ds
= rozklad/denní přídavek 2. Procentický úbytek Dssd množství látky přítomného na začátku každého dne: 2C
T
+ C
ti
- C
ci
- 3C
t(i+1)
+ 3C
c(i+1)k
D
ssd
= ---------------------------------------------------- . 100 (2(a)) C
T
+ C
ti
- C
ci
2C
T
- 2(Ct - C
c
) = ------------------- . 100 (2(b)) 2C
T + (C1 - C
c
) kde D
red
= rozklad/denní přídavek; indexy i a (i + 1) se vztahují ke dni měření.
Rovnice 2(a) se doporučuje, mění-li se DOC v odcházející vodě den ode dne, zatímco rovnici 2(b) lze používat, zůstává-li DOC v odcházející vodě den ode dne relativně konstantní.
XII.1.3 REFERENČNí LÁTKY
XII.1.4 PRINCIP ZKUŠEBNí METODY
Aktivovaný kal z čistírny odpadních vod se vpraví do semikontinuální jednotky pro aktivovaný kal (SCAS, semi-continuous activated sludge unit). Přidají se zkoušená látka a usazená domovní odpadní voda a směs se provzdušňuje 23 hodin. Provzdušňování se pak ukončí, kal se nechá usadit a kapalina nad usazeninou se odstraní.
Kal zbylý v provzdušňovací komoře se pak smísí s další alikvotní částí zkoušené látky a odpadní vody a cyklus se opakuje.
Biologický rozklad se určí stanovením obsahu rozpuštěného organického uhlíku v kapalině nad sedimentem. Tato hodnota se porovná s hodnotou, zjištěnou pro kapalinu získanou z kontrolní nádoby, do které byla dávkována pouze usazená odpadní voda.
Použije-li se specifická analytická metoda, je možné měřit změny koncentrace výchozí chemické látky v důsledku biologického rozkladu (primární biologický rozklad).
XII.1.5 KRITÉRIA KVALITY
Reprodukovatelnost této metody, založené na úbytku rozpuštěného organického uhlíku, nebyla ještě stanovena. (Pokud se uvažuje primární biologický rozklad, dosahuje se velmi přesných hodnot pro látky, které se rozkládají ve vysokém stupni.)
Citlivost metody je ve velké míře určena variabilitou slepé zkoušky a v menší míře přesností stanovení rozpuštěného organického uhlíku a obsahem zkoušené látky v kapalině na začátku každého cyklu.
XII.1.6 POPIS PRACOVNÍHO POSTUPU
XII.1.6.1 Příprava
Sestaví se dostatečný počet čistých provzdušňovacích jednotek, alternativně je možné použít originální zkušební jednotku SCAS o obsahu 1,5 l, a trubic pro přívod vzduchu (obrázek 1) pro každou zkoušenou látku a pro kontrolní zkoušky. Stlačený vzduch přiváděný do zkušebních jednotek, přečištěný vatovým filtrem, musí být prostý organického uhlíku a musí být předem nasycen vodou, aby se snížily ztráty vypařováním.
Vzorek směsné kapaliny, obsahující 1 - 4 g suspendovaných tuhých látek v 1 litru, se získá z čistírny pracující s aktivovaným kalem, čistící převážně domovní odpadní vody. Pro každou provzdušňovací jednotku je třeba přibližně 150 ml směsné kapaliny.
Zásobní roztoky zkoušené látky se připravují s použitím destilované vody; normálně požadovaná koncentrace je 400 mg.l
-1
jako organický uhlík, což představuje koncentraci zkoušené látky 20 mg.l
-1
uhlíku na začátku každého cyklu provzdušňování, nedochází-li k biologickému rozkladu.
Dovoluje-li to toxicita pro mikroorganizmy jsou přípustné vyšší koncentrace.
Měří se obsah organického uhlíku zásobních roztoků.
XII.1.6.2 Experimentální podmínky
Zkoušku je třeba provádět při 20 - 25 oC.Používá se vysoká koncentrace aerobních mikroorganizmů (1 - 4 g.l
-1
suspendovaných látek), a efektivní doba zdržení je 36 hodin. Uhlíkaté látky v přiváděné odpadní vodě se v široké míře oxidují, normálně během osmi hodin po začátku každého cyklu provzdušňování. Potom kal endogenně dýchá po zbytek provzdušňovací periody, a v této době je jediným dostupným substrátem zkoušená sloučenina, pokud se také rychle nemetabolizuje. Tyto skutečnosti spolu s denně opakovaným očkováním, používá-li se jako médium domovní odpadní voda, vytvářejí vysoce příznivé podmínky jak pro aklimatizaci, tak pro vysoký stupeň rozkladu.
XII.1.6.3 Provedení zkoušky
Získá se vzorek směsné kapaliny z vhodné čistírny čistící aktivovaným kalem převážně domovní odpadní vody nebo vzorek kapaliny z laboratorní jednotky a udržuje se v aerobních podmínkách až do použití v laboratoři. Do každé aerační i kontrolní jednotky se naplní 150 ml směsné kapaliny (používá-li se originální jednotka pro zkoušku SCAS, je třeba uvedené objemy násobit 10) a zahájí se provzdušňování. Po 23 hodinách se provzdušňování ukončí a kal se nechá 45 minut usadit. Postupně se otevřou kohouty všech nádob a odeberou se 100 ml podíly kapaliny nad usazeninou. Ke kalu zbylému v každé aerační jednotce se přidá 100 ml usazené domovní odpadní vody získané bezprostředně před použitím. Opět se zahájí provzdušňování. V této etapě se nepřidávají žádné zkoušené látky, a do jednotek se denně přidává domovní odpadní voda pouze do té doby, než se po usazení získá čirá kapalina nad usazeninou. To trvá obvykle až dva týdny, během kterých se obsah rozpuštěného organického uhlíku v kapalině nad usazeninou na konci každého aeračního cyklu přiblíží konstantní hodnotě.
Na konci této fáze se jednotlivé usazené kaly smísí a do každé jednotky se předloží 50 ml výsledného směsného kalu.
Do kontrolních jednotek se přidá 95 ml usazené odpadní vody a 5 ml vody, a do zkušebních jednotek se přidá 95 ml usazené odpadní vody plus 5 ml příslušného zásobního roztoku zkoušené látky (450 mg.l
-1
). Znovu se zahájí provzdušňování a pokračuje se v něm 23 hodin. Kal se pak nechá 45 minut usadit, kapalina nad usazeninou se odebere a analyzuje na obsah rozpuštěného organického uhlíku.
Výše uvedený postup plnění a odběru se opakuje v průběhu zkoušky denně.
Může se ukázat nutným očistit před usazováním stěny jednotek, aby se předešlo hromadění tuhých látek nad hladinou kapaliny. Pro každou jednotku se používá samostatná stěrka nebo kartáč, aby se předešlo vzájemné kontaminaci.
V ideálním případě se rozpuštěný organický uhlík stanoví v kapalinách nad usazeninami denně, i když jsou přípustné méně časté analýzy. Před analýzou se kapaliny zfiltrují přes promyté 0,45 m membránové filtry nebo se zcentrifugují. Membránové filtry jsou vhodné, je-li zaručeno, že ani neuvolňují uhlík, ani ve filtračním kroku neabsorbují příslušnou látku. Teplota vzorku po dobu, kdy je v odstředivce, nesmí přesáhnout 40 st. C.
Doba trvání zkoušky pro látky, u kterých dochází k malému nebo žádnému biologickému rozkladu není určena, ale na základě zkušenosti lze doporučit, aby trvala obecně nejméně 12 týdnů, avšak ne déle než 26 týdnů.
XII.2 VÝSLEDKY A VYHODNOCENÍ
Hodnoty koncentrace rozpuštěného organického uhlíku v čiré kapalině nad usazeninami ve zkušebních jednotkách a v kontrolních jednotkách se vynesou proti času.
Po skončení biologického rozkladu se koncentrace zjištěná ve zkoušce přiblíží hodnotě v kontrolní jednotce. Jakmile se ve třech po sobě následujících měřeních zjistí, že rozdíl mezi oběma úrovněmi je konstantní, provede se takový počet dalších měření, který je postačující pro statistické vyhodnocení výsledků, a vypočte se procentní hodnota biologického rozkladu zkoušené látky (Dda nebo Dred, viz 1. 2).
XII.3 ZPRÁVA
XII.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
Je-li to možné, má protokol o zkoušce obsahovat tyto informace:
— veškeré informace o druhu odpadní vody, typu použité jednotky a o experimentálních výsledcích týkajících se zkoušené látky, referenční látky ( pokud byla použita) a slepé zkoušky,
— teplotu,
— křivku úbytku s popisem, způsob výpočtu (viz 1. 2),
— datum a lokalitu, kde byly odebrány aktivovaný kal a odpadní voda, stav adaptace, koncentrace atd.,
— vědecké důvody pro veškeré změny v postupu zkoušky,
— podpis a datum.
XII.3.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ
Protože látky zkoušené touto metodou nejsou snadno biologicky rozložitelné, bude normálně jakýkoli úbytek DOC, ke kterému dojde pouze v důsledku biologického rozkladu, během dnů nebo týdnů, postupný, s výjimkou případů, kdy aklimatizace je náhlá, jak je to indikováno náhlým vymizením zkoušené látky po několika týdnech.
Někdy může hrát významnou úlohu fyzikálně-chemická adsorpce; to je indikováno úplným nebo částečným úbytkem přidaného DOC na začátku. K čemu dojde potom, závisí na činitelích jako je míra adsorpce a koncentrace suspendovaných látek v nepoužité odcházející vodě. Obvykle rozdíl mezi koncentrací DOC v kapalinách nad usazeninou u kontroly a ve zkoušce postupně vzrůstá z počáteční nízké hodnoty a tento rozdíl pak, pokud nedojde k aklimatizaci, zůstává na nové hodnotě po zbytek experimentu,.
Je-li třeba rozlišit mezi biologickým rozkladem (nebo částečným biologickým rozkladem) a adsorpcí, jsou nezbytné další zkoušky. Je možné je provést řadou způsobů, ale nejpřesvědčivější je použití kapaliny nad usazeninou nebo kalu jako inokula ve zkoušce vybrané ze základního souboru (nejlépe v respirometrické zkoušce).
Zkoušené látky, u kterých v této zkoušce dochází k vysokému neadsorpčnímu úbytku DOC, je třeba považovat za potenciálně biologicky rozložitelné. Částečný neadsorpční úbytek ukazuje, že u látky dochází alespoň k určitému biologickému rozkladu.
Nízké nebo nulové úbytky DOC mohou být způsobeny inhibicí mikroorganizmů zkoušenou látkou, což se může projevit také lyzí a ztrátou kalu, takže kapalina nad usazeninou je zakalená. Zkoušku je nutné opakovat s nižší koncentrací zkoušené látky.
Vyšší citlivosti je možné dosáhnout použitím specifické analytické metody nebo sloučeniny značené 14C. V případě zkoušené látky značené uhlíkem 14C se zachycením 14CO
2
potvrdí, že došlo k biologickému rozkladu.
Tam, kde jsou výsledky uvedeny také jako primární biologický rozklad, je třeba, pokud je to možné, uvést také vysvětlení změny chemické struktury, která vede ke ztrátě odezvy u mateřské zkoušené látky. Je nutné uvést potvrzení platnosti metody spolu s odezvou zjištěnou u média ve slepé zkoušce.
XII.4 LITERATURA
(1) OECD, Paris, 1981. Test Guideline 302 A, Decision of the Council C(81) 30 final.
PŘÍLOHA 1
Zkouška SCAS: příklad výsledků
       
-------------------------------------------------------------------------------
              Látka            C
T
Cl - C
c
Procento Doba trvání (mg.l
-1
) (mg.l
-1
) biolog. zkoušky rozkladu D
da
(dny) ------------------------------------------------------------------------------- 4 - 17,2 2,0 85 40 acetylaminobenzen sulfonan tetrapropylenbenzen 17,3 8,4 51,4 40 sulfonan 4 – nitrofenol 16,9 0,8 95,3 40 diethylenglykol 16,5 0,2 98,8 40 anilin 16,9 1,7 95,9 40 cyklopentantetra- 17,9 3,2 81,1 120 karboxylát -------------------------------------------------------------------------------
PŘÍLOHA 2
Příklad zkušební aparatury
      


XIII. METODA PRO STANOVENÍ BIOAKUMULACE - PRŮTOKOVÁ ZKOUŠKA NA RYBÁCH – metoda C.13 podle přílohy směrnice Komise 98/73/ES ze dne 18. září 1998, kterou se po dvacáté čtvrté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice rady 67/548/EHS o sbližování správních a právních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek
XIII.1 METODA
Tato bioakumulační metoda je replikou metody OECD TG 305 (1996).
XIII.1.1 Úvod
V této metodě je popsán postup pro charakterizování potenciálu látek bioakumulovat se v rybách za průtokových podmínek. Ačkoliv jsou průtokové režimy preferovány, semistatické režimy se připouštějí, jsou­li splněna kritéria validace.
V metodě jsou dostatečně popsány podrobnosti pro provedení zkoušky, přičemž je poskytnuta dostatečná volnost pro přizpůsobení experimentálního uspořádání podmínkám v jednotlivých laboratořích a různým vlastnostem zkušebních látek. Metoda je nejefektivnější pro stabilní organické chemikálie s hodnotou logPov od 1,5 do 6,0 (1), ale může být také použita na superlipofilní látky (s hodnotou log Pov > 6,0).
Předběžně odhadnutý bioakumulační faktor (BCF), někdy označován jako KB, bude pro takové superlipofilní látky pravděpodobně vyšší než hodnota bioakumulačního faktoru v rovnovážném stavu (BCFss), která je očekávána z laboratorních experimentů. Předběžné odhady pro organické látky s hodnotou log Pov až asi 9,0 lze získat pomocí rovnice Binteina et al (2). Mezi parametry, které charakterizují bioakumulační potenciál, patří rychlostní konstanta příjmu (k1), rychlostní konstanta vylučování (k2) a BCFss.
Zkušební látky značení radioizotopy mohou usnadnit analýzu vzorků vody a ryb a mohou být použity v případě, že by měla být provedena identifikace a kvantifikace produktů odbourávání. Měří­li se celkový obsah radioaktivního zůstatku (například spálením nebo solubilizací tkáně), zakládá se hodnota BCF na výchozí sloučenině, všech zadržených metabolitech a také na asimilovaném uhlíku. Hodnoty BCF založené na celkovém obsahu radioaktivního zbytku tedy nemohou být přímo srovnatelné s hodnotou BCF získanou specifickou chemickou analýzou pouze výchozí sloučeniny.
V metodách se značením radioaktivními izotopy mohou být pro stanovení výchozí sloučeniny zařazeny purifikační postupy, a je­li to považováno za nezbytné, mohou být charakterizovány hlavní metabolity. Je možné rovněž kombinovat studii metabolismu ryb se studií bioakumulace analýzou a identifikací reziduí v tkáních.
XIII.1.2 Definice a jednotky
Biokoncentrace/Bioakumulace je nárůst koncentrace zkušební látky v organismu (v jeho specifické tkáni) nebo na něm vzhledem ke koncentraci zkušební látky v okolním médiu.
Bioakumulační faktor (BCF nebo KB) je koncentrace zkušební látky v rybách nebo na nich nebo v jejich specifikovaných tkáních (C
f
v µg/g (ppm)) dělená koncentrací chemikálie v okolním médiu (C
w
v µg/ml (ppm)), a to v každém okamžiku fáze příjmu při této zkoušce.
Bioakumulační faktor v rovnovážném stavu (BCFss nebo KB) se po dlouhou dobu výrazně nemění; koncentrace zkušební látky v okolním médiu je po tuto dobu konstantní.
Plató nebo rovnovážný stav je stav dosažený tehdy, je­li při grafickém vyjádření křivka časové závislosti koncentrace zkušební látky v rybách (C
f
) rovnoběžná s časovou osou a tři po sobě jdoucí analýzy C
f
vzorků odebraných v intervalech alespoň dvou dnů se neliší více než o +/-20 % a není­li mezi těmito třemi dobami odběru žádný výrazný rozdíl. Analyzují­li se sdružené vzorky, požadují se čtyři po sobě jdoucí analýzy. V případě zkušebních látek, jejichž příjem probíhá pomalu, jsou vhodnější sedmidenní intervaly.
Bioakumulační faktory vypočtené přímo z rychlostních konstant kinetiky (k
1
/k
2
) se nazývají kinetické koncentrační faktory (BCFk).
Rozdělovací koeficient oktanol­voda (P
ov
) je rovnovážný poměr mezi rozpustností chemikálie v n­oktanolu a ve vodě (metoda A.8) a označuje se také jako K
ow
. Logaritmus hodnoty Pov se používá jako ukazatel potenciálu chemikálie bioakumulovat se ve vodních organismech.
Expozice nebo fáze příjmu je časový úsek, během něhož jsou ryby vystaveny působení zkušební chemikálii.
Rychlostní konstanta příjmu (k1) je číselná hodnota definující rychlost nárůstu koncentrace zkušební látky v testovacích rybách nebo na nich (nebo v jejich specifikovaných tkáních), jsou­li ryby této chemikálii vystaveny (k1 se vyjadřuje ve jednotce den–1).
Po­expoziční nebo vylučovací fáze je časový úsek po přemístění testovacích ryb z média obsahujícího zkušební látku do média, které tuto látku neobsahuje, během něhož se studuje vylučování látky z testovacích ryb (nebo její čistý úbytek v nich).
Rychlostní konstanta vylučování (k2) je číselná hodnota definující rychlost poklesu koncentrace zkušební látky v testovacích rybách (nebo v jejich specifikovaných tkáních) po jejich přemístění z média obsahujícího zkušební látku do média, které tuto látku neobsahuje (k2 se vyjadřuje ve jednotce den–1).
XIII.1.3 Princip zkušební metody
Zkouška má dvě fáze: fázi expozice (příjem) a po­expoziční fázi (vylučování). Během fáze příjmu jsou dvě oddělené skupiny ryb stejného druhu exponovány alespoň dvěma koncentracím zkušební látky. Poté jsou přemístěny do média, které zkušební látku neobsahuje, aby začala fáze vylučování. Fáze vylučování je vždy nezbytná, není­li příjem látky během fáze příjmu nevýznamný (např. je­li BCF menší než 10). Koncentrace zkušební látky v rybách nebo na nich (nebo v jejich specifikovaných tkáních) se sleduje v průběhu obou fází zkoušky. Vedle těchto dvou zkušebních koncentrací se za stejných podmínek, s výjimkou přítomnosti zkušební látky, udržuje kontrolní skupina ryb, aby mohly být na odpovídající kontrolní skupině porovnány možné nepříznivé účinky pozorované při bioakumulačních zkouškách a aby byly získány pozaďové koncentrace zkušební látky.
Fáze příjmu tvá 28 dnů, není­li prokázáno, že rovnováhy je dosaženo dříve. Délku fáze příjmu a dobu potřebnou k ustavení rovnovážného stavu lze předpovědět pomocí rovnice v příloze 3. Fáze vylučování poté začne po přemístění ryb do jiné nádrže bez zkušební látky. Je­li to možné, vypočítají se bioakumulační faktory nejlépe jako poměr (BCFss), tj. poměr koncentrace v rybách (C
f
) a ve vodě (C
w
) ve zřetelném rovnovážném stavu, a jako kinetický bioakumulační faktor (BCFk), tj. poměr rychlostních konstant příjmu (k1) a vylučování (k2) za předpokladu kinetiky prvního řádu. Neřídí­li se zjevně naměřené hodnoty kinetikou prvního řádu, měl by být použit složitější model (příloha 5).
Nedojde­li k rovnovážnému stavu do 28 dnů, měla by být fáze příjmu prodloužena do jeho dosažení nebo na 60 dnů, podle toho, co nastane dříve; poté začne fáze vylučování.
Rychlostní konstanta příjmu, rychlostní konstanta vylučování (úbytku) (nebo konstanty, jsou­li použity složitější modely), bioakumulační faktor a, je­li to možné, intervaly spolehlivosti každého z těchto parametrů se vypočítají z modelu, který popisuje naměřené koncentrace zkušební látky v rybách a ve vodě. Faktor BCF se vyjadřuje jako funkce celkové živé hmotnosti ryby. Pro zvláštní účely však mohou být použity specifikované tkáně nebo orgány (svalovina, játra), je­li ryba dostatečně velká nebo je­li možné ji rozdělit na jedlý (vykostěný) podíl a nejedlý podíl (vnitřnosti). Vzhledem k tomu, že u mnoha organických látek existuje zřetelný vztah mezi potenciálem bioakumulace a lipofilií, existuje také odpovídající vztah mezi obsahem tuku v testovacích rybách a pozorovanou bioakumulací takové látky. Aby se tedy snížilo kolísání výsledků pro tyto látky s vysokou lipofilií (tj. s log Pov > 3), měla by být bioakumulace vztažena vedle celkové hmotnosti těla také k obsahu tuku.
Obsah tuku by měl být stanoven pokud možno na stejném biologickém materiálu, jaký je použit ke stanovení koncentrace zkušební látky.
XIII.1.4 Informace o zkušební látce
Před prováděním zkoušek bioakumulace by měly být o zkušební látce známy tyto informace:
a) rozpustnost ve vodě,
b) rozdělovací koeficient oktanol­voda P
ov
(označovaný také jako Kow, stanovený metodou HPLC, viz A.8),
c) hydrolýza,
d) fototransformace ve vodě stanovená ozářením slunečním nebo simulovaným slunečním světlem za podmínek zkoušky bioakumulace (3),
e) povrchové napětí (tj. u látek, u nichž nelze stanovit log P
ov
),
f) tlak par,
g) popřípadě ochota k biologickému odbourávání.
Další požadovanou informací je toxicita pro druh ryby, který má být použit, nejlépe asymptotická hodnota LC
50
(tj. časově nezávislá). Musí být k dispozici vhodná analytická metoda o známé správnosti, přesnosti a citlivosti pro kvantitativní stanovení zkušební látky ve zkušebních roztocích a v biologickém materiálu a dále podrobnosti o přípravě a uchovávání vzorků. Měly by být také známy meze stanovitelnosti zkušební látky jak ve vodě, tak v rybích tkáních. Je­li použita zkušební látka značená 14C, měla by být známá aktivita nečistot vyjádřená v procentech.
XIII.1.5 Platnost zkoušky
Aby zkouška platila, měly by platit následující podmínky:
— kolísání teploty je menší než +/-2 st.C,
— koncentrace rozpuštěného kyslíku neklesne pod 60% nasycení,
— koncentrace zkušební látky v nádrži je udržována v intervalu +/-20 % kolem střední hodnoty naměřených hodnot během fáze příjmu,
— mortalita nebo jiné nepříznivé účinky/choroby jak u kontrolních, tak u exponovaných ryb je na konci zkoušky menší než 10 %; jestliže je zkouška prodloužena na několik týdnů nebo měsíců, měl by být úhyn nebo jiné nepříznivé účinky v obou skupinách ryb menší než 5 % za měsíc nebo by neměl překročit celkem 30 %.
c1.6 Referenční sloučeniny
Použití referenčních sloučenin o známém bioakumulačním potenciálu je popřípadě užitečné pro kontrolu experimentálního postupu. Zatím nelze ještě doporučit žádné specifické látky.
XIII.1.7 Popis zkušební metody
XIII.1.7.1 Přístroje a pomůcky
V případě všech částí zařízení je třeba se důsledně vyhýbat použití materiálů, které mají schopnost rozpouštět, sorbovat nebo vyluhovat a mají nepříznivý účinek na ryby. Lze použít standardní pravoúhlé nebo válcové nádrže vyrobené z inertního materiálu a mající vhodný objem s ohledem na náplň. Použití měkkých trubek z plastu by mělo být minimalizováno. Měly by být použity trubky z teflonu (R), z korozivzdorné oceli a/nebo ze skla. Zkušenosti ukázaly, že pro látky s vysokými absorpčními koeficienty, jako jsou syntetické pyrethroidy, je potřebné silanizované sklo. V těchto případech musí být zařízení po použití zlikvidováno.
XIII.1.7.2 Voda
Ve zkoušce se používá přírodní voda a měla by být získána z nekontaminovaného zdroje stálé kvality. Ředicí voda musí mít kvalitu, která umožní přežití zvoleného druhu ryby po dobu aklimatizace a v průběhu fází zkoušky, aniž by vykazoval abnormální klinický zjev nebo chování. V ideálním případě by mělo být prokázáno, že testovací druh může v ředicí vodě přežít, růst a rozmnožovat se (např. zkouškou s laboratorní kulturou nebo zkouškou toxicity během životního cyklu). Voda by měla být charakterizována alespoň hodnotou pH, tvrdostí, celkovým obsahem nerozpuštěných látek, celkovým obsahem organického uhlíku a podle možnosti také obsahem amoniaku a dusičnanů, alkalitou a v případě mořských druhů salinitou. Všechny parametry, které jsou důležité pro optimální prospívání ryb, jsou známy, v příloze I jsou přesto uvedeny doporučené maximální koncentrace pro řadu parametrů sladkovodní a mořské vody.
Voda by měla mít po celou dobu zkoušky stejnou kvalitu. Hodnota pH by měla být v rozmezí 6,0 až 8,5, avšak během zkoušky by se pH nemělo lišit o více než +/-0,5. Pro ujištění, že voda nebude mít přílišný vliv na výsledky zkoušky (například tvorbou komplexů se zkušební látkou) nebo nepříznivý vliv na stav obsádky ryb, by měly být odebírány v pravidelných intervalech její vzorky pro analýzu. Stanovení těžkých kovů (např. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), hlavních aniontů, kationtů (např. Ca, Mg, Na, K, Cl, SO
4
), pesticidů (např. celkový obsah organofosforových a organochlorových pesticidů), celkový obsah organického uhlíku a suspendovaných látek by měl být proveden každé tři měsíce, je­li kvalita ředicí vody relativně konstantní. Je­li prokázáno, že kvalita vody je konstantní po dobu alespoň jednoho roku, mohou být stanovení méně častá a intervaly lze prodloužit (např. každých šest měsíců).
Celkový přirozený obsah částic a rovněž obsah organického uhlíku (TOC) v ředicí vodě by měl být co nejnižší, aby nedošlo k absorpci zkušební látky na organických látkách, což může snížit její biologickou dostupnost (4). Maximální přijatelná hodnota je 5 mg/l pro částice (sušina zachycená filtrem 0,45 µm) a 2 mg/l pro celkový organický uhlík (viz příloha II). Je­li to nezbytné, měla by být voda před použitím filtrována. Příspěvek k obsahu organického uhlíku od testovacích ryb (exkrety) a ze zbytků potravy by měl být co nejmenší. V průběhu zkoušky by neměla koncentrace organického uhlíku ve zkušební nádrži překročit koncentraci organického uhlíku pocházejícího ze zkušební látky a z rozpouštědla, je­li použito, o více než 10 mg/l (+/-20 %).
XIII.1.7.3 Zkušební roztoky
Zásobní roztok zkušební látky se připraví ve vhodné koncentraci. Zásobní roztok by měl být připraven nejlépe jednoduchým smícháním nebo protřepáním zkušební látky s ředicí vodou. Použití rozpouštědel nebo dispersantů (solubilizačních činidel) se nedoporučuje; může však být v některých případech nezbytné pro vytvoření zásobního roztoku o vhodné koncentraci. Rozpouštědly, která mohou být použita, jsou ethanol, methanol, ethylenglykol­monomethylester, ethylenglykol­dimethylester, dimethylformamid a triethylenglykol. Dispersanty, které mohou být použity, jsou Cremophor RH40, Tween 80, 0,01% methylcelulosa a HCO­40. Snadno biologicky odbouratelná činidla je třeba používat rozvážně, neboť mohou způsobit problémy s růstem bakterií v průtokových zkouškách. Zkušební látka může být značena radioaktivními izotopy a měla by být nejvyšší čistoty (např. > 98%).
Pro průtokové zkoušky je pro zajištění koncentrací testované látky nezbytný systém, který plynule dávkuje a ředí zásobní roztok zkušební látky (např. dávkovací čerpadlo, proporcionální dávkovač, saturační systém). Přijatelná je výměna nejlépe pěti objemů v každé zkušební nádrži za den. Upřednostňuje se průtokový režim, není­li to však možné (např. jsou­li testovací organismy nepříznivě ovlivňovány), může být použita semi­statická technika za předpokladu, že jsou splněna kritéria validity. Rychlosti průtoku zásobního roztoku a ředicí vody by měly být kontrolovány jak 48 hodin před zkouškou, tak poté alespoň denně během zkoušky. Tato kontrola by měla zhrnovat stanovení rychlosti průtoku v každé testovací nádrži a měla by zajistit, aby se rychlost průtoku neměnila o více než 20 % v rámci jedné nádrže nebo mezi nádržemi.
XIII.1.7.4 Výběr druhů
Důležitými kritérii pro výběr druhu jsou jeho dostupnost, možnost získat jej ve vyhovující velikosti a jeho bezproblémové udržování v laboratoři. Dalšími kritérii pro výběr druhu ryb jsou jeho rekreační, komerční a ekologický význam a rovněž srovnatelná citlivost, úspěšné dřívější použití atd. Doporučené druhy jsou uvedeny v příloze II. Mohou být použity jiné druhy, avšak zkušební postup musí být upraven, aby byly vytvořeny vhodné zkušební podmínky. V takovém případě by měly být uvedeny důvody pro výběr druhu a experimentální podmínky.
XIII.1.7.5 Chov ryb Obsádka ryb se nechá aklimatizovat alespoň dva týdny při zkušební teplotě a krmí se odpovídající potravou stejného typu jako v průběhu zkoušky.
Po 48 hodinách aklimatizace se zaznamená úhyn a použijí se následující kritéria:
— úhyn vyšší než 10 % populace za sedm dnů: vyměnit celou obsádku;
— úhyn 5 až 10 % populace za sedm dnů: nechat aklimatizovat dalších sedm dnů;
— úhyn nižší než 5 % populace za sedm dnů: násada se přijímá; dojde li během dalších sedmi dnů k úhynu vyššímu než 5 %, celá násada se vymění.
Zajistí se, aby ryby použité pro zkoušku nevykazovaly pozorovatelné nemoci a abnormality. Všechny nemocné ryby se vymění. Dva týdny před zkouškou nebo v průběhu zkoušky nesmí být léčeny nemoci u ryb.
XIII.1.8 Provedení zkoušky
XIII.1.8.1 Předběžná zkouška
Může být užitečné provést předběžný experiment s cílem optimalizovat zkušební podmínky konečné zkoušky, např. výběr koncentrace (koncentrací) zkušební látky, délka fáze příjmu a fáze vylučování.
XIII.1.8.2 Délka fáze příjmu
Předpověď délky fáze příjmu lze získat z praktických zkušeností (např. z dřívější studie nebo z akumulace podobné chemikálie) nebo z určitých empirických vztahů využívajících znalosti buď rozpustnosti ve vodě, nebo rozdělovacího koeficientu oktanol­voda pro zkušební látku (viz příloha 3).
Fáze příjmu tvá 28 dnů, není­li prokázáno, že rovnováhy je dosaženo dříve. Nedojde­li k rovnovážnému stavu do 28 dnů, měla by být fáze příjmu prodloužena do jeho dosažení, přičemž se provádějí další měření, nebo na 60 dnů, podle toho, co nastane dříve.
XIII.1.8.2.2 Délka fáze vylučování
Doba odpovídající polovině délky fáze příjmu je obvykle dostatečná k tomu, aby došlo k přiměřenému (např. 95%) snížení obsahu látky v organismu (vysvětlení odhadu viz příloha 3). Jestliže doba nezbytná pro dosažení 95% úbytku je neúčelně dlouhá, překračuje například dvakrát normální délku fáze příjmu (tj. více než 56 dnů), může být použita kratší doba (tj. dokud není koncentrace zkušební látky menší než 10 % koncentrace v rovnovážném stavu). V případě látek se složitějším charakterem příjmu a vylučování, než jaký je popsán modelem ryby s jedním kompartmentem řídícím se kinetikou prvního řádu, však delší fáze vylučování umožní stanovit rychlostní konstanty úbytku. Délka fáze však může být určena dobou, po kterou zůstává koncentrace zkušební látky v rybách nad mezí detekce analytické metody.
XIII.1.8.2.3 Počet testovacích ryb
Počet ryb na jednu zkušební koncentraci se zvolí tak, aby pro každý odběr byly k dispozici čtyři ryby na jeden vzorek. Je­li požadována větší statická síla, bude na vzorek nezbytných více ryb.
Použijí-li se pohlavně dospělé ryby, uvede se, zda byly v experimentu použity ryby samičího nebo samčího pohlaví (nebo – uvede se pohlaví ryb použitých v experimentu). V případě použití obou pohlaví společně by mělo být před započetím expozice prokázáno, že rozdíl v obsahu tuku mezi oběma pohlavími není významný; oddělení samců a samic může být nezbytné.
V každé zkoušce se vyberou ryby podobné hmotnosti, tak aby hmotnost nejmenší z nich nebyla nižší než dvě třetiny hmotnosti největší ryby. Všechny by měly být stejného stáří a měly by pocházet ze stejného zdroje. Vzhledem k tomu, že se jeví, že stáří a hmotnost ryby mají často významný vliv na hodnoty BCF (1), musí být tyto podrobnosti přesně zaznamenány. Doporučuje se zvážit před zkouškou dílčí vzorek obsádky ryb s cílem odhadnout střední hmotnost.
XIII.1.8.2.4 Násada
Volí se vysoký poměr množství vody k množství ryb, aby se minimalizovalo snížení koncentrace C
w
způsobené přidáním ryb na začátku zkoušky a také proto, aby nedošlo k poklesu koncentrace rozpuštěného kyslíku. Je důležité, aby rychlost nasazování byla přiměřená použitému druh. V každém případě se obvykle doporučuje rychlost nasazování 0,1 až 1,0 g ryb (živá hmotnost) na litr vody za den. Vysoká rychlost nasazování může být zvolena, je­li prokázáno, že požadovaná koncentrace zkušební látky může být udržována v mezích +/-20 % a že koncentrace rozpuštěného kyslíku neklesne pod 60% nasycení.
Při volbě režimu nasazování má být přihlédnuto k obvyklému přirozenému prostředí ryb. Například ryby žijící u dna mohou vyžadovat při stejném obejmu vody větší plochu dna než pelagické druhy ryb.
XIII.1.8.2.5 Krmení
Během aklimatizace a po dobu zkoušky se ryby krmí vhodnou potravou se známým obsahem tuku a celkových bílkovin podávanou v množství dostatečném pro udržení zdravého stavu a pro udržení tělesné hmotnosti. Ryby se krmí denně v průběhu aklimatizace a po dobu zkoušky množstvím přibližně 1 až 2 % tělesné hmotnosti; tím se udrží v průběhu zkoušky obsah tuku u většiny druhů ryb na relativně konstantní úrovni. Množství krmiva by mělo být například jednou týdně nově přepočítáno, aby byla udržena odpovídající tělesná hmotnost a obsah tuku. Hmotnost ryb v každé nádrži může být pro tento výpočet odhadnuta z hmotnosti ryb naposledy odebraných z dotyčné nádrže. Ryby, které zůstaly v nádrži, se neváží.
Nezkrmená potrava a exkrety se odstraňují z nádrží denně krátce po krmení (30 minut až jednu hodinu). Nádrže se udržují v celém průběhu zkoušky v co nejvyšší čistotě, aby byla koncentrace organických látek co nejnižší, neboť přítomnost organického uhlíku může snižovat biologickou dostupnost zkušební látky (1). Poněvadž mnoho krmiv pochází z rybí moučky, mělo by být krmivo analyzováno na přítomnost zkušební látky. Je rovněž žádoucí, aby bylo krmivo analyzováno na přítomnost pesticidů a těžkých kovů.
XIII.1.8.2.6 Světlo a teplota
Fotoperioda je obvykle 12 až 16 hodin a teplota (+/- 2 st.C) by měla odpovídat testovacímu druhu (viz příloha 2). Druh a charakteristiky osvětlení by měly být známy. Měla by být věnována pozornost možné fototransformaci zkušební látky za světelných podmínek studie. Měly by být použito vhodné osvětlení, aby nedošlo k expozici ryb fotoproduktům nevyskytujícím se v přírodě. V některých případech může být vhodné použít filtr pro odfiltrování UV záření s vlnovou délkou kratší než 290 nm.
XIII.1.8.2.7 Zkušební koncentrace
Ryby jsou vystaveny za průtokových podmínek alespoň dvěma koncentracím zkušební látky ve vodě. Vyšší (nejvyšší) koncentrace zkušební látky se obvykle volí tak, aby byla na úrovni 1 % její asymptotické hodnoty akutní LC
50
a aby byla desetkrát vyšší než je mez detekce této látky ve vodě při použití analytické metody. Nejvyšší zkušební koncentraci lze také stanovit dělením akutní 96hodinové LC
50
příslušným poměrem akutní/chronická letální dávka (u některých chemikálií může koeficient ležet mezi 3 a 100). Je­li to možné, volí se druhá (další) koncentrace tak, aby se lišila od výše uvedené faktorem 10. Není­li to možné z důvodu kritéria 1 % z LC
50
nebo z důvodu kritéria meze detekce, může být použit nižší faktor než 10 nebo by mělo být zváženo použití zkušební látky značené 14C. Žádná koncentrace by neměla překročit rozpustnost látky.
Je­li použito rozpouštěcí činidlo, neměla by být jeho koncentrace vyšší než 0,1 ml/l a mělo by být stejné ve všech zkušebních nádržích. Jeho příspěvek, společně s příspěvkem zkušební látky, k celkovému obsahu organického uhlíku ve zkušební vodě by měl být znám. Avšak maximální snaha by měla být vynaložena k zamezení použití takovýchto látek .
XIII.1.8.2.8 Kontroly
Vedle zkušební série by měla být založena kontrola sestávající z ředicí vody, která popřípadě obsahuje rozpouštěcí činidlo, pokud bylo zjištěno, že toto činidlo nemá žádné účinky na ryby. Není-li tomu tak, měly by být založeny obě kontroly.
XIII.1.8.3 Četnost měření kvality vody
V průběhu zkoušky by měly být v každé nádrži měřeny množství rozpuštěného kyslíku, TOC, pH a teplota. Celková tvrdost a popřípadě salinita by měly být měřeny v kontrolách a v jedné nádrži s vyšší (nejvyšší) koncentrací. Množství rozpuštěného kyslíku a popřípadě salinita by měly být měřeny alespoň třikrát – na začátku, přibližně uprostřed a na konci fáze příjmu – a jednou týdně ve fázi vylučování. Hodnota TOC by měla být měřena na začátku zkoušky (24 hodin a 48 hodin před započetím fáze příjmu) před nasazením ryb a alespoň jednou týdně jak v průběhu fáze příjmu, tak v průběhu fáze vylučování. Teplota by měla být měřena denně, pH na začátku a na konci každé fáze a tvrdost vody jednou v průběhu zkoušky. Teplota by měla být měřena nejlépe nepřetržitě alespoň v jedné nádrži.
XIII.1.8.4 Odběr vzorků a analýza ryb a vody
XIII.1.8.4.1 Časový rozvrh odebírání vzorků ryb a vody
Voda ze zkušebních nádrží se pro stanovení koncentrace zkušební látky odebírá před nasazením ryb a během fáze příjmu i během fáze vylučování. Voda se odebírá alespoň ve stejnou dobu jako ryby a před krmením. Během fáze příjmu se stanovují koncentrace zkušební látky, aby se ověřilo, že jsou v souladu s kritérii validity.
Ryby se odebírají alespoň pětkrát během fáze příjmu a alespoň čtyřikrát během fáze vylučování. Vzhledem k tomu, že v mnoha případech bude obtížné s tímto počtem vzorků vypočítat rozumně přesný odhad hodnoty BCF, zejména jde­li o jinou než jednoduchou kinetiku prvního řádu, může být účelné odebírat vzorky v obou fázích častěji (viz příloha 4). Dodatečné vzorky se uloží a analyzují až poté, co se výsledky prvního kola analýz ukáží jako nedostatečné pro výpočet hodnoty BCF o požadované přesnosti.
Příklad přijatelného časového rozvrhu odběru vzorků je uveden v příloze 4. Jiné plány lze snadno odvodit pomocí jiné předpokládané hodnoty Pov, jejíž pomocí se vypočítá expoziční doba pro 95% příjem.
V odběru vzorků se pokračuje během fáze příjmu do ustavení rovnovážného stavu nebo po dobu 28 dnů, podle toho, co nastane dříve. Není­li rovnovážného stavu dosaženo do 28 dnů, v odběru se vzorků se pokračuje do ustavení rovnovážného stavu nebo do 60 dnů, podle toho, co nastane dříve. Před zahájením fáze vylučování se ryby přemístí do čistých nádrží.
XIII.1.8.4.2 Odběr vzorků a příprava vzorků
Vzorky vody pro analýzy se odebírají například odsáváním potrubím z inertního materiálu ze středu zkušební nádrže. Vzhledem k tomu, že se biologicky nedostupná frakce zkušební látky nedá často oddělit od biologicky dostupné frakce ani filtrací, ani odstředěním (zejména v případě superlipofilních chemikálií, tj. chemikálií s log Pov > 5) (1), (5), nemohou být vzorky takto zpracovány. Namísto toho je třeba učinit opatření pro to, aby nádrže byly udržovány co nejčistší, a obsah organického uhlíku by měl být pravidelně monitorován jak během fáze příjmu, tak během fáze vylučování.
Při každém odběru se z nádrží odebere vhodný počet ryb (obvykle alespoň čtyři). Odebrané ryby se rychle omyjí pod tekoucí vodu, osuší se „do sucha“, ihned se usmrtí nejvhodnější humánní metodou a zváží se. Ryby a voda se pokud možno analyzují ihned po odběru s cílem předejít degradaci nebo ztrátám a vypočítat přibližné rychlosti příjmu a vylučování ještě v průběhu zkoušky. Okamžitá analýza rovněž zabrání zpoždění ve stanovení plató při jeho dosažení.
Nedojde­li k okamžité analýze, vzorky se vhodným způsobem uchovají. Před zahájením studie je třeba zjistit informace o řádné metodě uchovávání vzorků s ohledem na dotyčnou zkušební látku – například hluboké zmrazení, udržování při 4 st.C, délka uchovávání, vyluhování atd.
XIII.1.8.4.3 Kvalita analytické metody
Vzhledem k tomu, že celý postup je určen hlavně správností, přesností a citlivostí analytické metody použité pro analýzu zkušební látky, je třeba experimentálně kontrolovat, že přesnost a reprodukovatelnost chemické analýzy a rovněž výtěžek zkušební látky jak z vody, tak ze vzorů ryb jsou pro dotyčnou analytickou metodu dostatečné. Kontroluje se také, zda se zkušební látka nevyskytuje v použité ředicí vodě.
Hodnoty C
w
a C
f
se podle potřeby korigují podle výtěžku a pozaďových hodnot kontrol. Vzorky ryb a vody se zpracovávají tak, aby se minimalizovala kontaminace a ztráty (např. v důsledku absorpce odběrovým zařízením).
XIII.1.8.4.4 Analýza vzorků ryb
Je­li ve zkoušce použit materiál značený radioizotopy, je možné provést analýzu s celkovou aktivitou (tj. s výchozí látkou i s metabolity) nebo lze provést separaci, tak aby mohla být výchozí látka analyzována samostatně. V rovnovážném stavu nebo na konci fáze příjmu, podle toho, k čemu dojde dříve, mohou být stanoveny také hlavní metabolity. Je­li hodnota BCF vypočtená z celkové aktivity reziduí >=? 1 000 %, může být účelné, a pro určité kategorie chemikálií, např. pesticidy, je to důrazně doporučeno, identifikovat a kvantifikovat produkty odbourávání představující >= 10 % celkového množství reziduí v tkáních ryb v rovnovážném stavu. Jsou­li produkty odbourávání představující >= 10 % celkové aktivity reziduí identifikovány a kvantifikovány, doporučuje se také identifikovat a kvantifikovat produkty odbourávání ve vodě.
Koncentrace zkušební látky by měla být obvykle stanovena pro každou jednotlivou zváženou rybu. Není­li to možné, mohou být vzorky při každém odběru sdružovány, avšak sdružování omezuje statistické postupy, které lze na data aplikovat. Pokud na specifickém statistickém postupu a na síle záleží, měl by být ve zkoušce nasazen dostatečný počet ryb vyhovující požadovanému sdružování a požadované síle (6), (7).
Hodnota BCF by měla být vyjádřena jako funkce celkové živé hmotnosti a v případě lipofilních látek také jako funkce obsahu tuku. Obsah tuku v rybách se stanoví pokud možno při každém odběru. Pro stanovení obsahu tuku by měla být použita vhodná metoda (odkazy 8 a 2 v příloze 3). Jako standardní metoda může být doporučena technika extrakce do chloroformu/methanolu (9). Různé metody nedávají stejné hodnoty (10), je proto důležité uvést podrobnosti o použité metodě. Je­li to možné, měla by být analýza tuků provedena na extraktu připravenému pro analýzu zkušební látky, neboť tuky musí být často před chromatografickou analýzou odstraněny. Obsah tuku v rybách (v mg/kg živé hmotnosti) na konci experimentu by se neměl lišit od obsahu na počátku od více než +/-25 %. Měl by být uveden také podíl pevných látek v tkáních, aby bylo možné provést přepočet koncentrace tuků z živé hmotnosti na hmotnost sušiny.
XIII.2 DATA
XIII.2.1 Zpracování výsledků
Křivka příjmu zkušební látky se sestrojí vynesením její koncentrace v rybách nebo na nich (nebo ve specifikovaných tkáních) v průběhu fáze příjmu proti hasu v lineárním měřítku. Dosáhla­li křivka plató, tj. začíná být rovnoběžná s časovou osou, vypočítá se hodnota BCFss v rovnovážném stavu z poměru
 
         C
f
v rovnovážném stavu (střední hodnota) ------------------------------------------- C
w
v rovnovážném stavu (střední hodnota)
Není­li rovnovážného stavu dosaženo, je možné vypočítat hodnotu BCFss s dostatečnou přesností pro posouzení rizika z „rovnovážného stavu v 80% (1,6/k2) nebo 95% (3,0/k2) rovnováze. Také koncentrační faktor BCFk se stanoví jako poměr dvou rychlostních konstant prvního řádu k
1
/k
2
. Rychlostní konstanta vylučování se obvykle stanoví z křivky vylučování (tj. grafu poklesu koncentrace zkušební látky v rybách v čase). Rychlostní konstanta příjmu se poté vypočte pomocí hodnoty k
2
a hodnoty C
f
odvozené z křivky příjmu (viz také příloha 5). Upřednostňovanou metodou pro získání hodnoty BCFk a rychlostních konstant k
1
a k
2
je metoda nelineárního odhadu parametrů s využitím počítače (11). K výpočtu hodnot k
1
a k
2
lze jinak použít grafické metody. Není­li zjevně křivka vylučování křivkou prvního řádu, měly by být použity složitější modely (viz odkazy v příloze 3) a měl by být konzultován biostatistik.
XIII.2.2 Interpretace výsledků
Výsledky by měly být interpretovány opatrně v případě, že naměřené koncentrace zkušebních roztoků se pohybují na úrovních blízkých mezi detekce analytické metody. Jasně vymezené křivky příjmu a úbytku jsou ukazatelem dobré kvality dat o bioakumulaci. Rozdíl konstant příjmu/vylučování pro dvě zkušební koncentrace by měl být nižší než 20 %. Pozorované významné rozdíly v rychlostech příjmu/vylučování mezi dvěma použitými zkušebními koncentracemi by měly být zaznamenány a mělo by být uvedeno jejich možné vysvětlení. Interval spolehlivosti hodnot BCF u dobře navržených studií se všeobecně blíží +/-20 %.
XIII.3 ZPRÁVY
Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:
XIII.3.1 Zkušební látka
— fyzikální povaha a popřípadě fyzikálně­chemické vlastnosti,
— chemické identifikační údaje (včetně obsahu organického uhlíku, je­li to třeba),
— v případě značení radioaktivními izotopy jejich přesná poloha a aktivita příměsí, vyjádřená v procentech.
XIII.3.2 Testovací druh
— vědecký název, kmen, zdroj, případné předběžné ošetření, aklimatizace, stáří, rozpětí velikostí atd.
XIII.3.3 Zkušební podmínky
— použitý zkušební postup (např. průtokový nebo semistatický),
— typ a charakteristiky použitého osvětlení a fotoperioda (fotoperiody),
— uspořádání zkoušky (např. počet a velikost zkušebních nádrží, rychlost výměny objemu vody, počet opakování, počet ryb v jednom opakování, počet zkušeních koncentrací, délka fází příjmu a vylučování, četnost odběru vzorků ryb a vzorků vody),
— metoda přípravy zásobních roztoků a častost jejich obnovování (je­li použito rozpouštěcí činidlo,musí být uvedena jeho koncentrace a jeho příspěvek k obsahu organického uhlíku ve vodě),
— nominální zkušební koncentrace, střední hodnoty naměřených koncentrací ve zkušebních nádržích, jejich směrodatné odchylky a metody jejich stanovení,
— zdroj ředicí vody, popis jakékoliv předchozí úpravy, výsledky jakéhokoliv prokazování schopnosti zkušebních ryb žít v této vodě a charakteristiky vody: hodnota pH, tvrdost, teplota, koncentrace rozpuštěného kyslíku, úroveň zbytkového chloru (je­li měřena), obsah celkového organického uhlíku, obsah suspendovaných látek, (popřípadě) salinita zkušebního média a výsledky jakýchkoliv jiných provedených měření,
— kvalita vody ve zkušebních nádržích, hodnota pH, tvrdost vody, obsah TOC, teplota a koncentrace rozpuštěného kyslíku,
— podrobné informace o krmení (například typ krmiva, zdroj, složení – alespoň pokud možno obsah tuku a bílkovin, podávané množství a četnost),
— informace o zpracování vzorků ryb a vody, včetně podrobností o přípravě, uchovávání, o extrakci a analytických postupech (a přesnosti), pokud jde o zkušební látku a obsah tuku (je­li měřen).
XIII.3.4 Výsledky
— výsledky jakýchkoliv provedených předběžných studií, — úhyn kontrolních ryb a ryb v každé expoziční nádrži a jakékoliv pozorované neobvyklé chování,
— obsah tuku v rybách (je­li stanoven při zkoušce),
— křivky (včetně všech naměřených dat) příjmu a vylučování zkušební chemikálie rybami, doba dosažení rovnovážného stavu,
— hodnoty C
f
a C
w
(popřípadě se směrodatnými odchylkami a rozpětím) pro všechny odběry (hodnota C
f
se vyjadřuje v µg/g živé hmotnosti (ppm) celého těla nebo specifikované tkáně, např. tuku, a C
w
se vyjadřuje v µg/ml (ppm)); hodnoty C
w
pro kontroly (měly by být uvedeny také hodnoty pozadí),
— bioakumulační faktor v rovnovážném stavu (BCFss) a/nebo kinetický koncentrační faktor (BCFk) a popřípadě 95% intervaly spolehlivosti pro rychlostní konstanty příjmu a vylučování (úbytku) (vše vztaženo na celý organismus a na celkový obsah tuku v rybě, je­li stanoven, nebo na její specifikovanou tkáň), intervaly spolehlivosti a směrodatné odchylky (jsou­li k dispozici) a metody výpočtu/analýzy dat pro každou použitou koncentraci zkušební látky,
— v případě použití látek značených radioaktivními izotopy a je­li to nutné, musí být uvedena akumulace jakýchkoliv detekovaných metabolitů,
— všechny zvláštnosti zkoušky, všechny odchylky od těchto postupů a ostatní relevantní informace.
Všem výsledkům typu „nedetekováno při uvedené mezi detekce“ by mělo být předcházeno předběžným odzkoušením metod a uspořádání experimentu, neboť takové výsledky nelze použít pro výpočet rychlostních konstant.
XIII.4 LITERATURA
(1) Connell D.W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102, pp. 117­156.
(2) Bintein S., Devillers J., Karcher W. (1993). Non­linear dependence of fish bioconcentration on n­octanol/water partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, pp. 29­390.
(3) OECD, Paris (1996). Direct phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. No 3.
(4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.
(5) US EPA 822­R­94­002 (1994) Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Document for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994.
(6) US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1, 5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 20852, July 1975.
(7) US EPA (1974). Section 5, A(1). Analysis of Human or animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Environmental Samples, Thompson J. F. (ed.) Research Triangle Park, N.C. 27711.
(8) Compaan H. (1980) in „The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation“, Ch. 2.3, Part II. Government Publishing Office, the Hague, Netherlands.
(9) Gardner et al, (1995). Limn. & Oceanogr. 30, pp. 1099­1105.
(10) Randall R. C., Lee H., Ozretich R. J., Lake J. L., Pruell R. J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp 1431­1436.
(11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow­through method ­ Ring Test Programme, 1984 to 1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen, N. Nyholm.
(12) ASTM E­1022­84 (Reapproved 1988). Standard Practice for conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs.
PŘÍLOHA 1
Chemické charakteristiky přijatelné ředicí vody

--------------------------------------------------------------- ------------------------
         Látka                                                  Koncentrační limit
--------------------------------------------------------------- ------------------------
   1     Nerozpuštěné látky                                                   5 mg/l
   2     Celkový obsah organického uhlíku                                     2 mg/l
   3     Neionizovaný amoniak                                                 1 µg/l
   4     Zbytkový chlor                                                      10 µg/l
   5     Celkové organofosforové pesticidy                                   50 ng/l
   6     Celkové organochlorové pesticidy a polychlorované bifenyly          50 ng/l
   7     Celkový organický chlor                                             25 ng/l
   8     Hliník                                                               1 µg/l
   9     Arsen                                                                1 µg/l
  10     Chrom                                                                1 µg/l
  11     Kobalt                                                               1 µg/l
  12     Měď                                                                  1 µg/l
  13     Železo                                                               1 µg/l
  14     Olovo                                                                1 µg/l
  15     Nikl                                                                 1 µg/l
  16     Zinek                                                                1 µg/l
  17     Kadmium                                                             100 ng/l
  18     Rtuť                                                                100 ng/l
  19     Stříbro                                                             100 ng/l
--------------------------------------------------------------- ------------------------
PŘÍLOHA 2
Doporučené druhy ryb pro zkoušení
--------------------------------------------------------------- --------------------------
               Doporučený druh             Doporučené rozpětí    Doporučená celková délka
                                            zkušební teploty     těla testovacích jedinců
                                                  (st.C)                     (cm)

--------------------------------------------------------------- --------------------------
 1  Danio rerio1 (Teleostei, Cyprinidae)        20 ­ 25                3,0 +/- 0,5
    (Hamilton­Buchanan), danio pruhované

 2  Pimephales promelas (Teleostei,             20 ­ 25                5,0 +/- 2,0
    Cyprinidae) (Rafinesque), střevle

 3  Cyprinus carpio (Teleostei,                 20 ­ 25                5,0 +/- 3,0
    Cyprinidae) (Linnaeus), kapr obecný

 4  Oryzias latipes (Teleostei,                 20 ­ 25                4,0 +/- 1,0
    Poeciliidae) (Temminck and
    Schlegel), halančík japonský

 5  Poecilia reticulata (Teleostei,             20 ­ 25                3,0 +/- 1,0
    Poeciliidae) (Peters), živorodka
    duhová

 6  Lepomis macrochirus (Teleostei,             20 ­ 25                5,0 +/- 2,0
    Centrarchidae) (Rafinesque),
    slunečnice

 7  Oncorhynchus mykiss (Teleostei,             13 ­ 17                8,0 +/- 4,0
    Salmonidae) (Walbaum), pstruh duhový

 8  Gasterosteus aculeatus (Teleostei           18 ­ 20                3,0 +/- 1,0
    Gasterosteidae) (Linnaeus), koljuška
    tříostná
--------------------------------------------------------------- --------------------------
1 Meyer A., Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, Series B.,
  Vol. 252, p. 231
V různých zemích byly použity různé druhy estuarinních a mořských druhů, například:

ryba z čeledi Scienidae (Smuhovití)     Leiostomus xanthurus

halančík                                Cyprinodon variegatus

ryba z čeledi Argentinidae              Menidia beryllina
(Stříbronicovití)

ryba z čeledi Enbiotocidae              Cymatogaster aggregata
(Příbojkovití)

platýz z čeledi Pleuronectidae          Parophrys vertulus

vranka z čeledi Cottidae                Leptocottus armatus

koljuška tříostná                       Gasterosteus aculeeatus

mořčák z čeledi Moronidae               Dicentracus labrax

ouklej obecná                           Alburnus alburnus

Dostupnost ryb
Sladkovodní ryby uvedené v seznamu se snadno chovají a/nebo jsou dobře dostupné po celý rok, zatímco dostupnost mořských nebo estuarijních ryb je omezena na určité země. Lze je množit a chovat buď v rybích farmách, nebo v laboratoři za kontrolovaných zdravotních a parazitologických podmínek tak, aby ryby byly zdravé a byly známého původu. Tyto ryby jsou dostupné v mnoha částech světa.
PŘÍLOHA 3
Předpověď délky fáze příjmu a fáze vylučování
1. Předpověď délky fáze příjmu
Před provedením zkoušky lze získat odhad hodnoty k
2
a odtud lze získat dobu nezbytnou pro dosažení určitého stupně rovnovážného stavu (v procentech) z empirických vztahů mezi k
2
a rozdělovacím koeficientem n­oktanol/voda (Pov) nebo mezi k
2
a rozpustností ve vodě (s).
     
     Odhad hodnoty k
2
(den
-1
) lze získat například z následujícího empirického vztahu (1): log
10
k
2
= - 0,414 log
10
(P
ov
) + 1,47 (r
2
= 0,95) (1) Další vztahy viz odkaz 2. Není-li rozdělovací koeficient (P
ov
) znám, lze jej odhadnout (3) ze znalosti rozpustnosti látky ve vodě (s) pomocí vztahu: log
10
(P
ov
) = 0,862 log
10
(s) + 0,710(r
2
= 0,994) (2) kde s = rozpustnost (v mol/l): (n = 36). Tyto vztahy platí pouze pro chemikálie s hodnotou log P
ov
od 2 do 6,5 (4). Dobu, za kterou dojde k dosažení určitého stupně rovnovážného stavu vyjádřeného v procentech, lze získat pomocí odhadu hodnoty k
2
, z obecné rovnice kinetiky popisující příjem a vylučování (kinetika prvního řádu): dC
f
----- = k1 . C
w
- k
2
. C
f
dt nebo je-li C
w
konstanta: k
1
C
f
= ----- . C
w
(1 - e
-k2t
) (3) k
2
Blíží-li se rovnovážný stav (t->nekonečno), může být rovnice 3 zjednodušena (5), (6) na k
1
C
f
= ------ . C
w
nebo C
f
/C
w
, = k
1
/k
2
= BCF k
2
Pak k
1
/k
2
. C
w
přiblížením koncentrace v rybách v "rovnovážném stavu"(C
f,s
). Rovnice 3 může být přepsána na rovnici: C
f
C
f
= C
f,s
(1 - e
-k2t
) nebo ----- = 1 - e
-k2t
(4) C
fs
Použitím rovnice 4 lze předpovědět dobu potřebnou k dosažení určitého stupně rovnovážného stavu vyjádřeného v procentech, je-li hodnota k
2
předem odhadnuta z rovnice 1 nebo 2. Je pravidlem, že statisticky optimální délka fáze příjmu pro získání statisticky přijatelných dat (BCF
k
) je doba nezbytná k tomu, aby křivka sestrojená vynesením logaritmu koncentrace zkušební látky v rybách proti času v lineárním měřítku dosáhla svého středního bodu, popřípadě 1,6 k
2
, neboli 80 % rovnovážného stavu, ale ne více než 3,0 k
2
, neboli 95 % rovnovážného stavu (7). Doba nezbytná pro dosažení 80 % rovnovážného stavuje při použití rovnice 4: 1,6 0,80 = 1 - e-
kt2 80
nebo t
80
= ------ (5). k
2
Podobně 95 % rovnovážného stavu je dosaženo: 3,0 t
95
= ----- (6). k
2
Například délka fáze příjmu (up) pro zkušební látku s log P
ov
= 4 je (při použití rovnic 1, 5 a 6): log
10
k
2
= - 0,414 . (4) + 1,47 k
2
= 0,652 den
-1
up (80 %) = 1,6/0,652, tj. 2,45 dnů (59 hodin) nebo up (95 %) = 3,0/0,652, tj. 4,60 dnů (110 hodin). Podobně pro zkušební látku s hodnotou s = 10
-5
mol/l (log(s) = 5,0) je délka fáze (při použití rovnic 1, 2, 5 a 6): log
10
(P
ov
) = 0,862 (- 5,0) + 0,710 = 5,02 log
10
k
2
= - 0,414 (5,02) + 1,47 k
2
= 0,246 den
-1
up (80 %) = 1,6/0,246, tj. 6,5 dnů (156 hodin) nebo up (95 %) = 3,0/0,246, tj. 12,2 dnů (293 hodin). Rovnice t
eq
= 6,54 x 10
-3
P
ov
+ 55,31 (hodin) může být eventuelně použita pro výpočet doby potřebné pro dosažení efektivního rovnovážného stavu (4).
2. Předpověď délky fáze vylučování Předpověď doby nezbytné pro snížení obsahu látky v organismu na určitou procentuální úroveň počáteční koncentrace může být rovněž získána z obecné rovnice kinetiky popisující příjem a vylučování (kinetika prvního řádu) (1), (8):


    V případě fáze vylučování se
C
w
předpokládá rovna nule. Rovnice může být zjednodušena na rovnici: dC
f
----- = k
1
. C
w
nebo C
f
= C
f,0
. e
-k2t
dt kde C
t,0
je koncentrace na počátku fáze vylučování. 50 % vyloučení bude dosaženo v čase (t
50
): C
f
1 0,693 ----- = --- e
-k2t
nebo t
50
= ------- C
t,0
2 k
2
Podobně 95 % vyloučení bude dosaženo v čase 3,0 t
95
= ----- k
2
Je­li pro první fázi zvoleno dosažení 80% příjmu (1,6/k
2
) a pro fázi vylučování je zvoleno dosažení 95% úbytku (3,0/k
2
), je délka fáze vylučování přibližně dvojnásobkem délky fáze příjmu. Je však důležité poznamenat, že odhady jsou založeny na předpokladu, že se příjem a vylučování řídí kinetikou prvního řádu. Neřídí­li se zjevně kinetikou prvního řádu, měl by být použit složitější model (např. odkaz (1)).
Literatura (k příloze 3)
(1) Spacie A., Hamelink J. L. (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1, pp. 309­320.
(2) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of BCFs derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute.
(3) Chiou C. T., Schmedding D. W. (1982). Partitioning of organic compounds in octanol­water systems. Environ. Sci. Technol. 16 (1), pp. 4­10.
(4) Hawker D. W., Connell D. W. (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22 (6), pp. 701­707.
(5) Branson D. R., Blau G. E., Alexander H. C., Neely W. B. (1975). Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), pp. 785­792.
(6) Ernst W. (1985). Accumulation in Aquatic organisms. In: Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by Sheehman P., Korte F., Klein W., Bourdeau P. H. Part 4.4, pp. 243­255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd N.Y.
(7) Reilly P. M., Bajramovic R., Blau G. E., Branson D. R., Sauerhoff M. W. (1977). Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kisnetic models, Can. J. Chem. Eng. 55, pp. 614­622.
(8) Könemann H., Van Leeuwen K. (1980). Toxicokinetics in fish: Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. Chemosphere, 9, pp. 3­19.
PŘÍLOHA 4
Teoretický příklad plánu odběru vzorků pro bioakumulační zkoušky látek s logP
ov
= 4

--------------------------------------------------------------------
Odběr    Plán dob odběru vzorků      Počet    Počet ryb na vzorek
vzorků ryb                           vzorků
                                     vody
            Minimální   Dodatečný                        
           požadovaná     odběr
             četnost     vzorků
              (dny)
--------------------------------------------------------------------              
   Fáze        –1                     2(*)      Přídavek 45 až 80
  příjmu        0                       2              ryb

    1.        0,3         0,4           2               4
                                       (2)             (4)

    2.        0,6         0,9           2               4
                                       (2)             (4)

    3.        1,2         1,7           2               4
                                       (2)             (4)

    4.        2,4         3,3           2               4
                                       (2)             (4)

    5.        4,7                       2               6
--------------------------------------------------------------------    
   Fáze                                          Přenesení ryb do
vylučování                                      vody neobsahující
                                               zkušební chemikálii
    6.        5,0         5,3                           4
                                                       (4)
    7.        5,9         7,0                           4
                                                       (4)
    8.        9,3        11,2                           4
                                                       (4)
    9.       14,0        17,5                           6
                                                       (4)
--------------------------------------------------------------------                                                       
(*) Odběr vzorku vody po dodání alespoň tří „objemů nádrže“. Hodnoty v závorkách jsou počty vzorků (vody, ryb), které mají být odebrány, je prováděn dodatečný odběr.
Poznámka: Předběžný odhad k
2
pro logP
ov
rovný 4,0 je 0,652 den
-1
. Celková délka experimentu je stanovena na
3 × up = 3 × 4,6 dnů, tj. 14 dnů. Odhad hodnoty „up“ viz příloha 3.
PŘÍLOHA 5
Omezení modelu
U většiny bioakumulačních dat se předpokládá, že jsou „rozumně“ dobře popsány jednoduchým modelem se dvěma kompartmenty/dvěma parametry, jak je patrné z přímky, která aproximuje body pro koncentrace v rybách během fáze vylučování, je­li vynesena na semilogaritmickém papíru. (Nelze­li tyto body popsat přímkou, měl by být použit složitější model (viz například Spacie a Hamelik, odkaz 1 v příloze 3).
Grafická metoda stanovení rychlostní konstanty vylučování (úbytku) k
2
Koncentrace zkušební látky nalezená v každém vzorku ryb se vynese na semi­logaritmickém papíru proti času odběru vzorků. Směrnice této přímky je rovna k
2
.
     


Je třeba si všimnout, že odchylky od přímky mohou znamenat složitější model vylučování, než je kinetika prvního řádu. Pro analýzu typů vylučování, které se odchylují od kinetiky prvního řádu, mohou být použity grafické metody.
Grafická metoda stanovení rychlostní konstanty příjmu k1
Při dané konstantě k
2
se k
1
vypočte následujícím způsobem: CLk
2
k
1
= ------------------- (1) C
w
x (1 - e
-k2t
) Hodnota C
f
se odečte ze středního bodu hladké křivky příjmu vytvořené vynesením logaritmu koncentrace proti času (v lineárním měřítku).
Metoda výpočtu rychlostních konstant příjmu a vylučování (úbytku) s využitím počítače
Upřednostňovanou metodou pro získání hodnoty bioakumulačního faktoru a rychlostních konstant k
1
a k
2
je metoda nelineárního odhadu parametrů s využitím počítače. Těmito programy se naleznou hodnoty k
1
a k
2
založené na sadě po sobě jdoucích dat koncentrací a na modelu:
           
                       
           k
1
C
f
= C
w
. ---- x (1 - e
-k2t
) 0 < t < tc (2) k
2
(2) k
1
C
f
= C
w
. ---- x (e
-k2 (t - t )tc
- e
-k2t
) t < t
c
(3) k
2
kde t
c
= čas konce fáze příjmu.
Tento přístup poskytuje odhady směrodatné odchylky k
1
a k
2
. Vzhledem k tomu, že ve většině případů lze odhadnout k
2
z křivky vylučování s relativně vysokou přesností a vzhledem k tomu, že mezi těmito dvěma parametry k
1
a k
2
existuje silná korelace, jsou­li odhadovány současně, může být účelné nejdříve vypočítat k
2
pouze z dat vylučování a následně vypočítat k
1
z dat příjmu pomocí nelineární regrese.
XIV. METODA PRO STANOVENÍ RŮSTU NA NEDOSPĚLÝCH RYBÁCH – METODA C.14 PODLE PŘÍLOHY SMĚRNICE KOMISE 2001/59/ES ZE DNE 6. SRPNA 2001, KTEROU SE PO DVACÁTÉ OSMÉ PŘIZPŮSOBUJE TECHNICKÉMU POKROKU SMĚRNICE RADY 67/548/EHS O SBLIŽOVÁNÍ SPRÁVNÍCH A PRÁVNÍCH PŘEDPISŮ TÝKAJÍCÍCH SE KLASIFIKACE, BALENÍ A OZNAČOVÁNÍ NEBEZPEČNÝCH LÁTEK (DÁLE JEN „SMĚRNICE 2001/59/ES“)
XIV.1 METODA
Metoda růstové zkoušky pro stanovení toxicity je replikou metody OECD TG 215 (2000).
XIV.1.1 ÚVOD
Zkouška je určena k posouzení účinků dlouhodobé expozice chemickým látkám na růst nedospělých ryb. Je založena na metodě pro posouzení účinků chemických látek na růst nedospělého pstruha duhového (Oncorynchus mykiss) při průtokových podmínkách, která byla vyvinuta v Evropské unii a testována v okružních testech (1, 3). Mohou být použity také jiné dobře popsané druhy. Byly například získány zkušenosti z růstových zkoušek s daniem pruhovaným (Danio rerio) (2, 4, 5) a halančíkem japonským (Oryzias latipes) (6, 7, 8). Viz také obecný úvod, část C.
XIV.1.2 DEFINICE
Nejnižší koncentrace s pozorovanými účinky (Lowest observed effect concentration, LOEC): je nejnižší zkoušená koncentrace zkoušené látky, při níž jsou u látky pozorovány významné účinky ve srovnání s kontrolou (na úrovni pravděpodobnosti falešně pozitivního hodnocení p < 0,05). Všechny zkoušené koncentrace vyšší než LOEC musí mít stejné nebo vážnější škodlivé účinky, než účinky pozorované při koncentraci LOEC.
NOEC (no observed effect concentration, koncentrace bez pozorovaných účinků): je zkušební koncentrace bezprostředně nižší než LOEC.
ECx: je pro tuto metodu koncentrace zkoušené látky, která vyvolává x% změnu rychlosti růstu ryb ve srovnání s kontrolami.
Velikost násady: je živá hmotnost ryb v jednotce objemu vody.
Hustota obsádky: je počet ryb v jednotce objemu vody. Individuální specifická rychlost růstu ryby: vyjadřuje rychlost růstu jedince vycházející z jeho výchozí hmotnosti.
Průměrná specifická rychlost růstu pro nádrž: vyjadřuje střední rychlost růstu populace v nádrži při určité koncentraci.
Pseudospecifická rychlost růstu: vyjadřuje rychlost růstu jednotlivce vycházející ze střední počáteční hmotnosti populace v nádrži.
XIV.1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Nedospělé ryby v exponenciální fázi růstu se po zvážení umístí do zkušebních nádrží a vystaví se řadě subletálních koncentrací zkoušené látky nejlépe za průtokových podmínek, nebo, pokud možno za vhodných semistatických podmínek (statické podmínky s obnovením média). Zkouška trvá 28 dnů. Ryby se krmí denně. Přísun potravy se řídí počáteční hmotností ryb a může být po 14 dnech nově vypočten. Na konci zkoušky se ryby opět zváží. Účinky na rychlost růstu se analyzují pomocí regresního modelu s cílem odhadnout koncentraci, která vyvolává x% změnu rychlosti růstu, tj. ECx (např. EC10, EC20 nebo EC30). Data mohou být popřípadě porovnána s hodnotami pro kontrolní skupiny s cílem stanovit nejnižší koncentraci s pozorovanými účinky (LOEC) a tím i koncentraci bez pozorovaných účinků (NOEC).
XIV.1.4 INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE
Výsledky zkoušky akutní toxicity (viz zkušební metoda C.1) provedené nejlépe na druhu zvolenému pro tuto zkoušku již musí být předloženy. To znamená, že jsou známy rozpustnost zkoušené látky ve vodě a tlak jejích par a je k dispozici vhodná analytická metoda pro kvantitativní stanovení látky ve zkušebních roztocích, a to se známou a doloženou správností a známou mezí stanovitelnosti.
Užitečnými informacemi jsou strukturní vzorec, čistota látky, její stálost ve vodě a na světle, pKa, P
o/v
a výsledky zkoušky snadné biologické rozložitelnosti (viz zkušební metoda C.4).
XIV.1.5 VALIDITA ZKOUŠKY
Má-li být zkouška platná, musí být splněny následující podmínky:
— mortalita v kontrolních zkouškách nesmí být na konci zkoušky větší než 10 %,
— nárůst střední hodnoty hmotnosti ryb v kontrolní skupině (skupinách) musí být dostatečný na to, aby umožnil rozeznat minimální významnou změnu rychlosti růstu. Okružní test (3) ukázal, že u pstruha duhového musí střední hmotnost ryb v kontrolních skupinách vzrůst alespoň o polovinu (tj. o 50 %) jejich počáteční hmotnosti za 28 dnů; např. počáteční hmotnost: 1 g/rybu (= 100 %), konečná hmotnost po 28 dnech: >= 1,5 g/rybu (>= 150 %),
— koncentrace rozpuštěného kyslíku musí dosahovat alespoň 60 % hodnoty nasycení vzduchem (ASV) po celou dobu zkoušky,
— teplota vody se po celou dobu zkoušky nesmí mezi zkušebními nádržemi lišit o více než +/- 1 st.C a měla by být udržována v rozpětí 2 st.C v rozsahu teplot stanovených pro zkušební druh (dodatek 1).
XIV.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
XIV.1.6.1 Přístroje a pomůcky
Normální laboratorní vybavení a zejména:
a) oxymetr a pH metr;
b) vybavení pro stanovení tvrdosti vody a alkality;
c) vhodné zařízení pro regulaci teploty a pro její pokud možno nepřetržité sledování;
d) nádrže z chemicky inertního materiálu o vhodném objemu vzhledem k doporučenému nasazování a obsádce (viz bod 1.8.5 a dodatek 1);
e) vhodné přesné váhy (tj. vážící s přesností na +/- 0,5 %).
XIV.1.6.2 Voda
Jako zkušební voda může být použita jakákoli voda, v níž zkušební druh dlouhodobě přežívá a roste. Měla by mít po celou dobu zkoušky stejnou kvalitu. Hodnota pH vody by měla být v rozmezí 6,5 až 8,5, avšak během zkoušky by se pH nemělo lišit o více než +/- 0,5. Doporučuje se tvrdost nad 140 mg/l (jako CaCO
3
). S cílem zajistit, aby ředicí voda neměla nadměrný vliv na výsledek zkoušky (například v důsledku tvorby komplexů zkušební látky), by měly být v určitých intervalech odebírány vzorky k analýze. Je­li kvalita ředicí vody relativně konstantní, mělo by být stanovení těžkých kovů (např. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd a Ni), hlavních aniontů a kationtů (např. Ca, Mg, Na, K, Cl a SO
4
), pesticidů (např. celkový obsah organických fosforových a chlorových pesticidů), celkový obsah organického uhlíku a suspendovaných látek provedeno např. každé tři měsíce. Je­li prokázáno, že kvalita vody je konstantní po dobu alespoň jednoho roku, mohou být stanovení méně častá a intervaly lze prodloužit (např. každých šest měsíců). Některé chemické charakteristiky přijatelné ředicí vody jsou uvedeny v dodatku 2.
XIV.1.6.3 Zkušební roztoky
Zkušební roztoky o zvolených koncentracích se připraví ředěním zásobního roztoku.
Zásobní roztok by měl být připraven nejlépe jednoduchým mechanickým mícháním nebo protřepáváním zkoušené látky v ředicí vodě (např. mechanickým mícháním nebo sonifikací). Pro dosažení vhodné koncentrace zásobního roztoku mohou být použity saturační kolony.
V některých případech může být pro vytvoření zásobního roztoku o vhodné koncentraci nezbytné použití rozpouštědel nebo dispergátorů (solubilizačních činidel). Ke vhodným rozpouštědlům patří aceton, ethanol, methanol, dimethylsulfoxid, dimethylformamid a triethylenglykol. Ke vhodným dispergátorům patří Cremophor RH40, Tween 80, 0,01% methylcelulosa a HCO- 40. Snadno biologicky rozložitelná činidla (např. aceton) nebo vysoce těkavé sloučeniny je třeba používat rozvážně, neboť mohou způsobit problémy s růstem bakterií v průtokových zkouškách. Je­li použito solubilizační činidlo, nesmí mít významné účinky na růst ryb ani viditelné nepříznivé účinky na nedospělé ryby, což musí být prokázáno na kontrolní skupině vystavené pouze rozpouštědlu.
Při průtokových zkouškách je pro zajištění řady koncentrací nezbytný systém, který nepřetržitě dávkuje a ředí zásobní roztok zkoušené látky (např. dávkovací čerpadlo, zařízení pro proporcionální ředění, saturační systém). Průtok zásobních roztoků a ředicí vody by měl být v průběhu zkoušky kontrolován v určitých intervalech, nejlépe denně, a neměl by se v průběhu zkoušky měnit o více než 10 %. Okružní test (3) ukázal, že u pstruha duhového je přijatelná výměna vody 6 litrů na gram ryb za den (viz bod 1.8.2.2).
U semistatických zkoušek (s obnovením média) bude častost obnovování média záviset na stálosti zkoušené látky, avšak doporučuje se obnovovat vodu denně. Není­li podle předběžných zkoušek stálosti (viz bod 1.4) koncentrace zkoušené látky mezi obnoveními média stálá, (tj. nepohybuje se v intervalu 80 – 120 % nominální koncentrace nebo klesá pod 80 % naměřené počáteční koncentrace), měla by být zvážena průtoková zkouška.
XIV.1.6.4 Výběr druhů
Pstruh duhový (Oncorhynchus mykiss) je doporučeným druhem pro tuto zkoušku, neboť u něj bylo v okružních testech získáno nejvíce zkušeností (1, 3). Mohou však být použity jiné dobře popsané druhy, může však být nutné zkušební postup upravit, aby byly vytvořeny vhodné zkušební podmínky. Jsou například zkušenosti s daniem pruhovaným (Danio rerio) (4, 5) a halančíkem japonským (Oryzias latipes) (6, 7, 8). V takovém případě by měly být uvedeny v závěrečné zprávě důvody pro výběr druhu a experimentální podmínky.
XIV.1.6.5 Chov ryb
Testovací ryby by měly pocházet z jednoho chovu (nejlépe ze stejného tření), který se alespoň dva týdny před zkouškou udržuje v podmínkách kvality vody a osvětlení, které jsou podobné podmínkám použitým ve zkoušce. V průběhu chovu a v průběhu zkoušky by měly být krmeny množstvím potravy odpovídajícím minimálně 2 % tělesné hmotnosti za den a nejlépe 4 % tělesné hmotnosti za den.
Po 48hodinové aklimatizaci se zaznamená mortalita a použijí se následující kritéria:
— mortality vyšší než 10 % populace za sedm dnů: vyměnit celou obsádku;
— mortality od 5 % do 10 % populace: aklimatizace dalších sedm dnů; je­li mortalita během následujících sedmi dnů vyšší než 5 %, vymění se celá obsádka,
— mortalita nižší než 5 % populace za sedm dnů: obsádka se přijme.
Dva týdny před zkouškou nebo v průběhu zkoušky nesmí být léčeny u ryb žádné nemoci.
XIV.1.7 USPOŘÁDÁNÍ ZKOUŠKY
„Uspořádáním zkoušky“ se rozumí výběr počtu zkušebních koncentrací a jejich odstupňování, počet nádrží pro každou koncentraci a počet ryb v nádrži. Uspořádání by mělo být v ideálním případě zvoleno s ohledem na:
a) cíl studie;
b) metodu statistické analýzy, která bude použita;
c) dostupnost a cenu prostředků pro experiment.
Požadováno je stanovení statistické významnosti, s jakou má být daná velikost změny (např. změny rychlosti růstu) rozeznána, nebo přesnost, s jakou má být odhadnuta hodnota EC
x
(např. x = 10, 20 nebo 30, pokud možno ne méně než 10). Bez toho nelze stanovit přesný rozsah studie.
Je důležité vzít na vědomí, že uspořádání, které je optimální při použití jedné metody statistické analýzy (nejlépe využívá prostředky), není nezbytně optimální pro jinou metodu. Doporučené uspořádání pro odhad LOEC/NOEC tedy nebývá stejné jako uspořádání pro analýzu regresí.
V mnoha případech se regresní analýze dává přednost před analýzou variance, a to z důvodů diskutovaných Stephanem a Rogersem (9). Není­li však nalezen vhodný regresní model (r2 < 0,9), měl by být stanoven poměr NOEC/LOEC.
XIV.1.7.1 Uspořádání pro analýzu regresí
Pro uspořádání zkoušky, která má být analyzována regresí, jsou důležité tyto zřetele:
a) koncentrace použité ve zkoušce musí v každém případě pokrývat koncentraci vyvolávající účinek (např. EC
10,20,30
) a rozsah koncentrací, při nichž dochází ke sledovanému účinku. Přesnost, s jakou mohou být odhadnuty koncentrace vyvolávajících účinek, bude nejlepší, bude­li koncentrace vyvolávající účinek ležet uprostřed rozsahu zkušebních koncentrací. Při výběru vhodných zkušebních koncentrací mohou být užitečné předběžné orientační zkoušky.
b) aby mohl být vytvořen uspokojivý statistický model, měla by zkouška zahrnovat alespoň jednu kontrolní nádrž a pět dalších nádrží o různých koncentracích. Podle vhodnosti by při použití solubilizačního činidla měla být vedle zkušebních skupin nasazena jedna kontrolní skupina vystavená koncentraci solubilizačního činidla použité při nejvyšší zkušební koncentraci (viz body 1.8.3 a 1.8.4);
c) může být použita vhodná geometrická nebo logaritmická řada koncentrací (10) (viz dodatek 3). Upřednostňuje se logaritmické stupňování koncentrací;
d) je­li k dispozici více než šest nádrží, měly by být další nádrže použity buď pro duplicitní stanovení, nebo by měly být použity pro koncentrace rozložené v rozsahu koncentrací tak, aby se zmenšily rozestupy mezi koncentracemi. Obě použití lze doporučit stejnou měrou.
XIV.1.7.2 Uspořádání pro odhad NOEC/LOEC analýzou variance (ANOVA)
Pro každou koncentraci by měly být nejlépe k dispozici nádrže pro duplicitní stanovení, statistická analýza by měla být provedena pro každou jednotlivou nádrž (11). Bez duplicitních nádrží není možné zohlednit jinou variabilitu mezi nádržemi, než jaká je důsledkem rozdílů mezi jednotlivými rybami. Zkušenosti ale ukazují (12), že variabilita mezi nádržemi byla velmi malá ve srovnání s variabilitou v rámci nádrže (tj. mezi rybami). Relativně přijatelnou alternativou je tedy provedení statistické analýzy pro jednotlivé ryby.
Zpravidla se použije alespoň pět zkušebních koncentrací tvořících geometrickou řadu s faktorem nepřekračujícím 3,2.
Provádí-li se zkouška s duplicitními nádržemi, měl by být počet duplicitních kontrolních nádrží, a tedy i počet ryb, dvojnásobkem počtu ryb pro každou zkoušenou koncentraci, který by měl být pro všechny koncentrace stejný (13, 14, 15). Nejsou­li naproti tomu duplicitní nádrže použity, měl by být v kontrolní skupině stejný počet ryb jako ve skupině pro každou zkušební koncentraci.
Je­li ANOVA založena na nádržích namísto jednotlivých rybách (což by znamenalo buď ryby jednotlivě označit nebo použít „pseudospecifickou“ rychlost růstu (viz bod 2.1.2)), je nezbytné počet nádrží dostatečně znásobit, aby bylo možné stanovit odchylku pro nádrže v rámci jednotlivé koncentrace. To znamená, že by měl být počet stupňů volnosti pro chybu v analýze variance alespoň 5 (11). Jsou­li duplicitně použity pouze kontroly, existuje nebezpečí, že bude variabilita chyby vychýlena, neboť může narůstat se střední hodnotou dotyčné rychlosti růstu. Vzhledem k tomu, že rychlost růstu s největší pravděpodobností klesá s rostoucí koncentrací, povede to k nadhodnocení variability.
XIV.1.8 POSTUP
XIV.1.8.1 Výběr a vážení testovacích ryb
Je důležité minimalizovat rozdíly v hmotnostech ryb na začátku zkoušky. Vhodná rozpětí velikostí ryb různých druhů doporučených pro tuto zkoušku jsou uvedena v dodatku 1. Rozpětí individuálních hmotností na začátku zkoušky by mělo být pro celou násadu ryb použitých ve zkoušce nejlépe +/- 10 % aritmetického průměru hmotností a v žádném případě by nemělo překročit 25 %. Doporučuje se zvážit před zkouškou menší vzorek ryb s cílem odhadnout střední hodnotu hmotnosti.
24 hodin před zahájením zkoušky se obsádka ryb přestane krmit. Poté se provede náhodný výběr ryb. Za použití běžného anestetika (např. vodný roztok trikainmethansulfonátu (MS 222) o koncentraci 100 mg/l neutralizovaný přídavkem dvou dílů hydrogenuhličitanu sodného na jeden díl MS 222) se ryby jednotlivě s přesností uvedenou v dodatku 1 zváží za účelem stanovení živé hmotnosti (po osušení do sucha). Ryby s hmotností v požadovaném rozsahu se náhodně rozdělí do nádrží. Zaznamená se celková živá hmotnost ryb v každé zkušební nádrži. Při manipulaci s rybami za použití anestetik (včetně osušení a zvážení) může u nedospělých ryb, a zejména u druhů o malé velikosti, dojít ke stresu a poranění. S nedospělými rybami se tedy musí manipulovat s nejvyšší opatrností, aby nedošlo u zkušebních ryb ke stresu a poranění.
Ryby se opět zváží po 28 dnech zkoušky (viz bod 1.8.6). Považuje­li se však za nezbytné nově vypočítat přísun potravy, mohou být ryby opět zváženy po 14 dnech zkoušky (viz bod 1.8.2.3). Ke stanovení změn velikosti ryb, na jejichž základě se upravuje přísun potravy, může být použita jiná metoda, např. fotografická metoda.
XIV.1.8.2 Podmínky expozice
XIV.1.8.2.1 Délka expozice
Zkouška trvá více než 28 dnů.
XIV.1.8.2.2 Velikost násady a hustota obsádky
Je důležité, aby velikost násady a hustota obsádky vyhovovaly použitému zkušebnímu druhu (viz dodatek 1). Je­li hustota obsádky příliš vysoká, dojde ke stísnění vedoucímu ke snížené rychlosti růstu a popřípadě k nemocem. Je­li příliš nízká, může vyvolat teritoriální chování, což by mohlo rovněž ovlivnit růst. V každém případě by měla být velikost násady tak nízká, aby bylo možné udržet koncentraci rozpuštěného kyslíku na alespoň 60 % ASV bez provzdušňování. Okružní test (3) ukázal, že u pstruha duhového je velikost násady 16 ryb o hmotnosti 3 – 5 g do objemu 40 litrů přijatelná. Doporučené obnovování vody během zkoušky je 6 litrů na gram ryb za den.
XIV.1.8.2.3 Krmení
Ryby by měly být krmeny dostatečným množstvím vhodného krmiva (dodatek 1), aby byla umožněna přijatelná rychlost růstu. Je třeba dbát na to, aby nedošlo k růstu mikroorganismů a k zakalení vody. U pstruha duhového by mělo těmto požadavkům vyhovovat množství odpovídající 4 % jejich tělesné hmotnosti za den (3, 16, 17, 18). Denní množství může být rozděleno na dva stejné podíly a podáno rybám dvakrát za den s odstupem alespoň pěti hodin.
Množství se řídí počáteční hmotností ryb v jednotlivé zkušební nádrži. Ryby se opět zváží 14. den a množství se nově vypočte. 24 hodin před vážením se ryby přestanou krmit. Nespotřebovaná potrava a výkaly se ze zkušebních nádrží každý den odstraní důkladným odsátím ze dna každé nádrže.
XIV.1.8.2.4 Světlo a teplota
Fotoperioda a teplota vody by měly vyhovovat zkušebním druhům (dodatek 1).
XIV.1.8.3 Zkušební koncentrace
Obvykle je nutných pět koncentrací zkoušené látky, a to bez ohledu na uspořádání zkoušky (viz bod 1.7.2). Při volbě vhodných zkušebních koncentrací by měla pomoci předcházející znalost toxicity zkoušené látky (např. ze zkoušek akutní toxicity nebo z orientačních studií). Použije­li se méně než pět koncentrací, mělo by být uvedeno odůvodnění. Nejvyšší zkušební koncentrace by neměla překročit rozpustnost látky ve vodě.
Použije­li se k usnadnění přípravy zásobního roztoku solubilizační činidlo, neměla by být jeho konečná koncentrace vyšší než 0,1 ml/l a měla by být ve všech zkušebních nádržích stejná (viz bod 1.6.3). Měla by však být vynaložena maximální snaha takové látky nepoužívat.
XIV.1.8.4 Kontrolní skupiny
Počet kontrolních skupin v ředicí vodě závisí na uspořádání zkoušky (viz body 1.7 až 1.7.2). Použije­li se solubilizační činidlo, měl by být nasazen stejný počet kontrolních skupin se solubilizačním činidlem jako s ředicí vodou.
XIV.1.8.5 Častost analytických stanovení a měření
Během zkoušky se v pravidelných intervalech (viz níže) stanovují koncentrace zkoušené látky
Při průtokových zkouškách se průtok zásobních roztoků toxické látky a ředicí vody kontroluje v určitých intervalech, nejlépe denně, a neměl by se v průběhu zkoušky měnit o více než 10 %. Očekávají-li se změny koncentrace zkoušené látky v rozmezí +/- 20 % nominálních hodnot (tj. od 80 – 120 %, viz body 1.6.2 a 1.6.3), doporučuje se, aby byly nejnižší a nejvyšší zkoušené koncentrace analyzovány na začátku zkoušky a poté v týdenních intervalech. U zkoušek, u nichž se (na základě dat o stálosti látky) nepředpokládá, že se bude koncentrace zkoušené látky pohybovat v rozmezí +/- 20 % nominální hodnoty, je nezbytné analyzovat všechny zkušební koncentrace, a to stejně často jako u stabilních látek.
U semistatických zkoušek (s obnovením média), u nichž se má zkušební koncentrace pohybovat v rozmezí +/- 20 % nominálních hodnot, se doporučuje analyzovat nejvyšší a nejnižší zkušební koncentrace na začátku studie ihned po jejich přípravě a bezprostředně před obnovením a poté v týdenních intervalech. U zkoušek, u nichž se nepředpokládá, že se bude zkušební koncentrace pohybovat v rozmezí +/- 20 nominální hodnoty, musí být všechny koncentrace analyzovány stejně často jako u stabilnějších látek.
Doporučuje se zakládat výsledky na naměřených koncentracích. Lze-li však prokázat, že po celou dobu zkoušky byla koncentrace zkoušené látky v roztoku uspokojivě udržována v rozmezí +/-20 % nominální hodnoty, mohou být výsledky založeny na nominálních nebo naměřených hodnotách.
Může být nezbytné vzorky filtrovat (např. přes filtr velikostí pórů 0,45 µm) nebo odstředit. Doporučuje se odstřeďování. Filtrace je přípustná jen neadsorbuje­li se zkoušená látka na filtry.
V průběhu zkoušky se měří v každé zkušební nádrži množství rozpuštěného kyslíku, pH a teplota. Celková tvrdost, alkalita a popřípadě solnost se měří v kontrolních nádržích a v jedné nádrži s nejvyšší koncentrací. Množství rozpuštěného kyslíku a solnost (podle potřeby) se měří alespoň třikrát (na začátku, uprostřed a na konci zkoušky). U semistatických zkoušek se doporučuje měřit množství rozpuštěného kyslíku častěji, nejlépe před každým obnovením média a po něm, nebo alespoň jednou týdně. pH se měří na začátku a na konci každé výměny vody u statických zkoušek a alespoň týdně u průtokových zkoušek. Tvrdost vody a alkalita se měří v každé zkoušce jednou. Teplota se měří nejlépe nepřetržitě alespoň v jedné zkušební nádrži.
XIV.1.8.6 Pozorování
Hmotnost: na konci každé zkoušky se musí ryby, které přežily, zvážit za účelem XIV.stanovení živé hmotnosti (po osušení do sucha), a to buď jako skupina pro každou zkušební nádrž, nebo jednotlivě. Vážení ryb jako skupin se upřednostňuje před vážením jednotlivých ryb, které vyžaduje, aby byly ryby jednotlivě označeny. V případě vážení jednotlivých ryb pro stanovení individuální specifické rychlosti růstu by neměla zvolená technika označení vyvolávat u ryb stres (alternativou ke značení ryb vymražením značky může být popřípadě použití barevného rybářského vlasce).
Ryby se v průběhu zkoušky vyšetřují denně a zaznamenávají se jakékoli odchylky (hemoragie, odbarvení) a neobvyklé chování. Každý úhyn se zaznamená a uhynulé ryby se co nejdříve odstraní. Uhynulé ryby se nenahrazují, neboť velikost násady a hustota obsádky by měly být dostatečné na to, aby nedošlo k ovlivnění růstu v důsledku změn počtu ryb. Bude však nutné upravit množství krmiva.
XIV.2 DATA A ZPRÁVY
XIV.2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ
Doporučuje se, aby se návrhu zkoušky i analýzy výsledků zkoušky účastnil statistik, neboť tato zkušební metoda umožňuje značné variace v experimentálním uspořádání, například v počtu zkušebních nádrží, v počtu zkušebních koncentrací, v počtu ryb. Pokud jde o možnosti uspořádání zkoušky, nejsou zde uvedeny žádné pokyny. Rychlost růstu se nevypočítává pro zkušební nádrže, v nichž mortalita překročila 10 %. Velikost mortality se ale uvede pro všechny zkušební koncentrace. Bez ohledu na použitou metodu je hlavním ukazatelem specifická rychlost růstu r od okamžiku t
1
do t
2
. Může být definována několika způsoby v závislosti na tom, zda jsou či nejsou ryby individuálně značeny nebo zda se požaduje průměrná hodnota pro nádrž.
      
                               
  


kde: r
1
= individuální specifická rychlost růstu ryby r
2
= průměrná specifická rychlost růstu pro nádrž r3 = „pseudospecifická“ rychlost růstu w
1
, w
2
= hmotnosti určité ryby v čase t1 a t2 loge w
1
= logaritmus hmotnosti jednotlivé ryby na začátku vyšetřovacího intervalu loge w
2
= logaritmus hmotnosti jednotlivé ryby na konci vyšetřovacího intervalu loge w
1
= průměr logaritmů hodnot w1 pro ryby v nádrži na začátku vyšetřovacího intervalu loge w
2
= průměr logaritmů hodnot w2 pro ryby v nádrži na konci vyšetřovacího intervalu t
1
, t
2
= čas (ve dnech) začátku a konce vyšetřovacího intervalu r
1
, r
2
, r
3
mohou být vypočteny pro interval 0 – 28 dnů a popřípadě (bylo­li provedeno měření 14. den) pro intervaly 0 – 14 a 14 – 28 dnů.
XIV.2.1.1 Analýza výsledků regresí (modelování závislosti koncentrace – odezva)
Touto metodou se závislostí mezi specifickou rychlostí růstu a koncentrací proloží vhodná matematická funkce, a to umožní odhadnout „EC
x
“, tj. jakoukoli požadovanou hodnotu EC. U této metody není nutný výpočet r pro jednotlivou rybu (r
1
) a namísto toho se analýza založí na průměrné hodnotě r (r
2
) pro nádrž. Dává se přednost posledně uvedené metodě. Je také vhodnější při použití velmi malých druhů.
Průměrné specifické rychlosti růstu pro nádrž (r
2
) se graficky vynesou proti koncentraci kvůli kontrole závislosti odezvy.
K vyjádření závislosti r
2
na koncentraci se zvolí vhodný model; jeho volba musí být řádně zdůvodněna. Liší­li se pro jednotlivé nádrže počty ryb, které přežily, prokládá se vážený model s cílem zohlednit různé velikosti skupin.
Metoda proložení modelu musí umožnit odhadnout například hodnotu EC
20
a stanovit její rozptyl (buď směrodatnou odchylku nebo interval spolehlivosti). Graf proloženého modelu se vynese spolu s daty, aby byla zřejmá vhodnost použitého modelu (9, 19, 20, 21).
XIV.2.1.2 Analýza výsledků pro stanovení LOEC
Bylo­li ve zkoušce použito pro každou koncentraci více nádrží, může být odhad LOEC založen na analýze variance (ANOVA) průměrné specifické rychlosti růstu pro nádrž (viz bod 2.1) následované vhodným srovnáním průměrné hodnoty r pro každou koncentraci s průměrnou hodnotou r pro kontrolní skupiny (např. Dunnettovým nebo Williamsovým testem (13, 14, 15, 22)), aby se zjistila nejmenší koncentrace, u níž je na úrovni pravděpodobnosti 0,05 rozdíl významný. Nejsou­li předpoklady pro použití parametrických metod splněny, kvůli jinému než normálnímu rozdělení (např. se použije Shapiro-Wilkův test) nebo kvůli heterogennímu rozptylu (Bartlettův test), měla by být před provedením ANOVA zvážena transformace dat za účelem homogenizace rozptylů nebo by měla být provedena vážená ANOVA.
Není-li pro každou koncentraci počet nádrží znásoben, nebude ANOVA u jednotlivé nádrže citlivá nebo bude nemožná. V takovém případě je přijatelným kompromisem založit ANOVA na „pseudospecifické“ rychlosti růstu r3 nebo na jednotlivých rybách.
Průměrná hodnota r3 pro každou koncentraci může být poté porovnána s průměrnou hodnotou r3 pro kontrolní skupiny. Hodnotu LOEC lze poté nalézt výše uvedeným způsobem. Je třeba vzít na vědomí, že tato metoda neumožňuje zohlednit variabilitu mezi nádržemi ve větší míře, než s jakou se počítá v důsledku variability mezi rybami, a ani před ní nechrání. Ukázalo se však (9), že variabilita mezi nádržemi byla ve srovnání s variabilitou v rámci nádrže (tj. mezi rybami) velmi malá. Nejsou­li v analýze využity jednotlivé ryby, musí být ve zprávě uvedena metoda nalezení odlehlých hodnot a její použití musí být zdůvodněno.
XIV.2.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ
Výsledky je třeba interpretovat opatrně, leží-li naměřené hodnoty koncentrací toxické látky v roztocích blízko meze stanovitelnosti analytické metody, nebo klesá­li u semistatických zkoušek koncentrace zkoušené látky od okamžiku přípravy roztoku do jeho obnovení.
XIV.2.3 PROTOKOL O ZKOUŠCE
Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:
XIV.2.3.1 Zkoušená látka
— fyzikální stav a relevantní fyzikálně­chemické vlastnosti,
— údaje o chemické identitě včetně údajů o čistotě a podle potřeby o metodě kvantitativního stanovení zkoušené látky.
XIV.2.3.2 Testovací druh
— vědecký název, podle možnosti,
— kmen, velikost, původ, jakákoli příprava atd.,
XIV.2.3.3 Zkušební podmínky
— použitý zkušební postup (např. semistatický/s obnovením, průtokový, nasazování, hustota obsádky atd.),
— uspořádání zkoušky (např. počet zkušebních nádrží, zkušební koncentrace a znásobení počtu nádrží, počet ryb v nádrži),
— metoda přípravy zásobních roztoků a častost obnovování (je­li použito, uvede se solubilizační činidlo a jeho koncentrace),
— nominální zkušební koncentrace, střední hodnota naměřených hodnot v jednotlivých nádržích, její směrodatná odchylka a metody jejich stanovení a důkazy toho, že naměřené hodnoty odpovídají koncentracím zkoušené látky v pravém roztoku,
— charakteristiky ředicí vody: pH, alkalinita, tvrdost, teplota, koncentrace rozpuštěného kyslíku, koncentrace zbytkového chloru (je­li měřena), obsah celkového organického uhlíku, obsah suspendovaných látek, popřípadě solnost zkušebního média a výsledky jakýchkoli jiných provedených měření,
— kvalita vody ve zkušebních nádržích: pH, tvrdost, teplota a koncentrace rozpuštěného kyslíku,
— podrobné informace o krmení (např. druh krmiva (krmiv), původ, podávané množství a frekvence krmení).
XIV.2.3.4 Výsledky
— doklady o tom, že kontrolní skupiny vyhověly kriteriu přežití, a data o mortalitě pro každou zkušební koncentraci,
— použité metody statistické analýzy, statistiky založené na znásobeném počtu nádrží nebo na jednotlivých rybách, zpracování dat a zdůvodnění použitých metod,
— data ve formě tabulky o individuálních a středních hodnotách hmotností ryb v den 0, 14 (bylo­li prováděno vážení) a 28, hodnoty průměrných rychlostí růstu pro nádrž nebo popřípadě pseudospecifických rychlostí růstu pro intervaly 0 – 28 dnů nebo popřípadě 0 – 14 a 14 – 28 dnů,
— výsledky statistické analýzy (tj. regresní analýzy nebo ANOVA) nejlépe ve formě tabulky nebo v grafické formě a hodnota LOEC (p = 0,05) a NOEC nebo ECx, popřípadě se směrodatnými odchylkami,
— výskyt jakýchkoli neobvyklých reakcí ryb a viditelné účinky vyvolané zkoušenou látkou.
XIV.3 LITERATURA
(1) Solbe J. F. de LG (1987). Environmental Effects of Chemicals (CFM 9350 SLD). Report on a UK Ring Test of a Method for Studying the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. WRc Report No PRD 1388- M/2.
(2) Meyer, A., Bierman, C. H., Orti, G. (1993). The phylogenetic position of the zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology: an invitation to the comparative method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252, 231-236.
(3) Ashley S., Mallett M. J., Grandy N. J. (1990). EEC Ring Test of a Method for Determining the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of the European Communities. WRc Report No EEC 2600-M.
(4) Crossland N. O. (1985). A method to evaluate effects of toxic chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, 1855-1870.
(5) Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P. D., Market M., Munk R., Scholz N., Höfte B. B. (1991). Effect of 3,4-dichloroaniline on the early life stages of the Zebrafish (Brachydanio rerio): results of a comparative laboratory study. Ecotox. Environ. Safety, 21, 157-164.
(6) Yamamoto, Tokio. (1975). Series of stock cultures in biological field. Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku Publish. Tokio, Japonsko.
(7) Holcombe, G. W., Benoit D. A., Hammermeister, D. E., Leonard, E. N., Johnson, R. D. (1995). Acute and long-term effects of nine chemicals on the Japanese medaka (Oryzias latipes). Arch. Environ. Contam. Toxicol. 28, 287-297.
(8) Benoit, D. A., Holcombe, G. W., Spehar, R. L. (1991). Guidelines for conducting early life toxicity tests with Japanese medaka (Oryzias latipes). Ecological Research Series EPA-600/3-91- 063. US Environmental Protection Agency, Duluth, Minnesota.
(9) Stephan C. E., Rogers J. W. (1985). Advantages of using regression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Symposium, ASTM STP 891, R. C. Bahner, D. J. Hansen, eds., American Society for Testing and Materials, Filadelfie, 328-338.
(10) Environment Canada (1992). Biological test method: toxicity tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, coho salmon, or atlantic salmon). Conservation and Protection, Ontario, Report EPS 1/RM/28, 81 str.
(11) Cox D. R. (1958). Planning of experiments. Wiley Edt.
(12) Pack S. (1991). Statistical issues concerning the design of tests for determining the effects of chemicals on the growth rate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts on Aquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10.– 12. prosinec 1991.
(13) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control, J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121.
(14) Dunnett C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. J. Amer. Statist. Assoc, 20, 482-491.
(15) Williams D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. J. Amer. Statist. Assoc 27, 103-117.
(16) Johnston, W. L., Atkinson, J. L., Glanville N. T. (1994). A technique using sequential feedings of different coloured food to determine food intake by individual rainbow trout, Oncorhynchus mykiss: effect of feeding level. Aquaculture,120, 123-133.
(17) Quinton, J. C., Blake, R. W. (1990). The effect of feed cycling and ration level on the compensatory growth response in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Journal of Fish Biology, 37, 33-41.
(18) Post, G. (1987). Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. Chapter IX in Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, Inc. Neptune City, New Jersey, USA. 288 str.
(19) Bruce, R. D., Versteeg D. J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11, 1485-1494.
(20) DeGraeve, G. M., Cooney, J. M., Pollock, T. L., Reichenbach, J. H., Dean, Marcus, M. D., McIntyre, D. O. (1989). Precision of EPA seven-day fathead minnow larval survival and growth test; intra and interlaboratory study. Report EA-6189 (American Petroleum Institute Publication, No 4468). Electric Power Research Institute, Palo Alto, CA.
(21) Norbert-King T. J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: the ICp approach. US Environmental Protection Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minnesota. Tech. Rep. No 05-88 of National Effluent Toxicity Assesment Center. Sept. 1988. 12 str.
(22) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. J. Amer. Statist. Assoc., 28, 510-531.
DODATEK 1
DRUHY RYB DOPORUČNÉ KE ZKOUŠENÍ A VHODNÉ ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY
------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------
   Druhy     Doporučený Fotoperioda Doporučené     Doporučená     Velikost        Hustota       Krmivo        Délka zkoušky
               rozsah       (h)       rozpětí   přesnost měření    násady         obsádky                          (d)
              zkušební               počáteční                      (g/l)          (l
-1
) teploty hmotnosti (st.C) ryb (g) ------------------------------------------------- -------------------------------------------------------------------------- Doporučené druhy: 12,5-16,0 12-16 1-5 na 100 mg 1,2-2,0 4 sušené >= 28 Oncorhynchus krmivo pro mykiss plůdek pstruh lososovitých duhový ryb Jiné dobře popsané druhy: 21-25 12-16 0,050- na 1 mg 0,2-1,0 5-10 živé krmivo >= 28 Danio rerio 0,100 (Brachionus danio 21-25 12-16 na 1 mg 0,2-1,0 5-20 Artemia) >= 28 pruhované 0,050- živé krmivo Oryzias 0,100 (Brachionus latipes Artemia) halančík japonský ------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------
DODATEK 2
NĚKTERÉ CHEMICKÉ CHARAKTERISTIKY PŘIJATELNÉ ŘEDICÍ VODY
Látka                                                       Koncentrace
Nerozpuštěné látky                                          < 20  mg/l
Celkový organický uhlík                                     < 2 mg/l
Nedisociovaný amoniak                                       < 1µg/l
Zbytkový chlor                                              < 10  µg/l
Celkové organofosforové pesticidy                           < 50  ng/l
Celkové organochlorové pesticidy a polychlorované bifenyly  < 50  ng/l
Celkový organický chlor                                     < 25  ng/l
DODATEK 3
LOGARITMICKÁ ŘADA KONCENTRACÍ VHODNÁ PRO ZKOUŠKU TOXICITY (9)
Sloupec (počet koncentrací mezi 100 a 10, nebo mezi 10  a 1) (1)
-------------------------------------------------------
1       2       3        4       5       6        7

100     100     100      100     100     100      100
32      46      56       63      68      72       75
10      22      32       40      46      52       56
3,2     10      18       25      32      37       42
1,0     4,6     10       16      22      27       32
        2,2     5,6      10      15      19       24
        1,0     3,2      6,3     10      14       18
                1,8      4,0     6,8     10       13
                1,0      2,5     4,6     7,2      10
                         1,6     3,2     5,2      7,5
                         1,0     2,2     3,7      5,6
                                 1,5     2,7      4,2
                                 1,0     1,9      3,2
                                         1,4      2,4
                                         1,0      1,8
                                                  1,3
                                                  1,0
-------------------------------------------------------                            

1  Ze  sloupců může být zvolena řada pěti (nebo více)  po
 sobě   jdoucích   koncentrací.   Mezilehlé   body    pro
 koncentrace  ve  sloupci  (x) jsou  uvedeny  ve  sloupci
 (2x  +  1).  Uvedené  hodnoty  mohou  být  koncentracemi
 vyjádřenými  v  objemových nebo hmotnostních  procentech
 (mg/l  nebo  µg/l).  Hodnoty  mohou  být  podle  potřeby
 násobeny  nebo  děleny jakoukoli mocninou  10.  Řada  ve
 sloupci  1  by  mohla být použita při značné  nejistotě,
 pokud jde stupeň toxicity.
XV. METODA PRO STANOVENÍ TOXICITY NA RYBÍCH EMBRYÍCH A POTĚRU - KRÁTKODOBÁ ZKOUŠKA – metoda C.15 podle přílohy směrnice 2001/59/ES
XV.1 METODA
Tato zkouška krátkodobé toxicity je replikou metody OECD TG 212 (1998).
XV.1.1 ÚVOD
Tato zkouška krátkodobé toxicity na rybím embryu a váčkovém plůdku je krátkodobou zkouškou, při níž jsou exponována životní stádia od čerstvě oplodněných jiker do stadia váčkových plůdků. Při zkoušce na embryu a na váčkovém plůdku se nekrmí, zkouška by tedy měla být ukončena dokud je váčkový plůdek stále vyživován ze žloutkového váčku.
Zkouška je určena k zjištění letálních a v omezené míře subletálních účinků chemických látek na specifická stadia a testovací druhy. Tato zkouška by měla poskytnout užitečné informace, neboť by a) mohla být přechodem mezi letálními a subletálními zkouškami, b) mohla být použita jako screeningová zkouška pro úplnou zkoušku toxicity na časných vývojových stadiích nebo pro zkoušky chronické toxicity a c) mohla by být použita pro zkoušení na druzích, u nichž nejsou dostatečně rozvinuty chovné techniky, aby pokryly období od endogenního k exogennímu vyživování.
Je třeba mít na paměti, že pouze zkoušky pokrývající celý životní cyklus ryb obecně umožňují odhadnout chronickou toxicitu chemické látky pro ryby a že jakékoli omezení expozice nějakého životního stadia může snížit citlivost a tím podhodnotit chronickou toxicitu. Očekává se tedy, že zkouška na embryu a váčkovém plůdku je méně citlivá než úplná zkouška na časných vývojových stádiích, zejména pokud jde o vysoce lipofilní chemické látky (log P
o/v
> 4) a chemické látky se specifickým mechanismem účinku. V citlivostech těchto dvou zkoušek se však očekávají menší rozdíly v případě chemických látek s nespecifickým, narkotickým mechanismem účinku (1).
Před publikováním této zkoušky bylo nejvíce zkušeností s touto zkouškou na embryu a váčkovém plůdku získáno u sladkovodní ryby Danio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae – obecný název danio pruhované). Podrobnější pokyny pro zkoušku s tímto druhem jsou tedy uvedeny v dodatku 1. To nevylučuje použití jiného druhu, pro který jsou zkušenosti rovněž k dispozici (tabulky IA a IB).
XV.1.2 DEFINICE
Nejnižší koncentrace s pozorovanými účinky (Lowest observed effect concentration, LOEC): je nejnižší zkoušená koncentrace zkoušené látky, při níž jsou pozorovány významné účinky ve srovnání s kontrolou (na úrovni pravděpodobnosti falešně pozitivního hodnocení p < 0,05). Všechny zkoušené koncentrace vyšší než LOEC musí mít stejné nebo vážnější škodlivé účinky, než účinky pozorované při koncentraci LOEC.
NOEC (no observed effect concentration, koncentrace bez pozorovaných účinků): je zkušební koncentrace bezprostředně nižší než LOEC.
XV.1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Embrya a váčkové plůdky se vystaví rozsahu koncentrací zkoušené látky rozpuštěné ve vodě. Zkouška umožňuje volit mezi semistatickým a průtokovým uspořádáním. Volba závisí na povaze zkoušené látky. Zkouška se zahájí umístěním oplodněných jiker do zkušebních nádrží a ukončí se těsně před tím, než dojde k úplné absorpci žloutkového váčku čerstvých plůdků v některé ze zkušebních nádrží, nebo než začne v kontrolních skupinách docházet k úhynu v důsledku hladovění. Posoudí se letální a subletální účinky a porovnají se s kontrolními hodnotami s cílem stanovit nejnižší koncentraci s pozorovanými účinky, tedy koncentraci bez pozorovaných účinků. Účinky mohou být eventuálně analyzovány za použití regresního modelu s cílem odhadnout koncentraci, která způsobuje určitý procentuálně vyjádřený účinek (tj. LC/ECx, kde x je definovaný procentuální účinek).
XV.1.4 INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE
Měly by být dostupné výsledky zkoušky akutní toxicity (viz metoda C.1) provedené nejlépe na druhu zvolenému pro tuto zkoušku. Výsledky mohou být užitečné při výběru vhodného rozsahu zkušebních koncentrací ve zkoušce na časných vývojových stádiích. Měly by být známy rozpustnost látky ve vodě (včetně rozpustnosti ve zkušební vodě) a tlak par látky. Měla by být k dispozici vhodná analytická metoda pro kvantitativní stanovení látky ve zkušebních roztocích, a to se známou a doloženou správností a známou mezí stanovitelnosti.
Užitečnými informacemi o zkoušené látce pro účely stanovení zkušebních podmínek jsou strukturní vzorec, čistota látky, stálost na světle, pKa, P
o/v
a výsledky zkoušky snadné biologické rozložitelnosti (viz metoda C.4).
XV.1.5 VALIDITA ZKOUŠKY
Má-li být zkouška platná, musí být splněny následující podmínky:
— celková míra přežití oplodněných jiker v kontrolních skupinách a podle potřeby v nádržích, do nichž bylo přidáno pouze rozpouštědlo, musí být vyšší nebo rovna limitům stanoveným v dodatcích 2 a 3,
— koncentrace rozpuštěného kyslíku musí ležet mezi 60 a 100 % nasycení vzduchem (ASV) po celou dobu zkoušky,
— teplota vody se po celou dobu zkoušky nesmí mezi zkušebními nádržemi nebo den ode dne lišit o více než +/- 1,5 st.C a měla by být udržována v rozpětí teplot stanoveném pro zkušební druh (dodatky 2 a 3).
XV.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
XV.1.6.1 Zkušební nádrže
Mohou být použity jakékoli nádrže ze skla nebo z jiného inertního materiálu. Rozměry zkušebních nádrží by měly být dostatečné k tomu, aby vyhovovaly velikosti násady (viz bod 1.7.1.2). Doporučuje se, aby byly nádrže umístěny ve zkušebním prostoru náhodně. Uspořádání do náhodných bloků s možností expozice v každém bloku se upřednostňuje před zcela náhodným uspořádáním, když existují systémové účinky v laboratoři, které mohou být blokovým uspořádáním kontrolovány. Je­li použito blokové uspořádání, mělo by být zohledněno při následné analýze dat. Nádrže by měly být chráněny před nežádoucími rušivými vlivy.
XV.1.6.2 Výběr druhů ryb
Doporučené druhy ryb jsou uvedeny v tabulce 1A. To nevylučuje použití jiného druhu (příklady jsou uvedeny v tabulce 1B), zkušební postup musí být ale upraven, aby byly vytvořeny vhodné zkušební podmínky.V takovém případě by měly být uvedeny důvody pro výběr druhu a experimentální podmínky.
XV.1.6.3 Chov matečných ryb
Podrobnosti o chovu matečných ryb v uspokojivých podmínkách jsou uvedeny v metodě OECD TG 210 (1) a v literatuře (2, 3, 4, 5, 6).
XV.1.6.4 Chov embryí a plůdků
Embrya a čerstvě vykulené plůdky mohou být exponovány v hlavní nádrži v menších nádobách s pletivovými stěnami nebo uzávěry, aby jimi mohl proudit zkušební roztok. Nevířivého průtoku nádobami lze dosáhnout jejich zavěšení do ramen, pomocí nichž lze pohybovat nádobami nahoru a dolů, přičemž organismy zůstanou stále ponořeny; lze rovněž použít syfonový systém přítoku a výpusti. Oplodněné jikry lososovitých ryb mohou ležet na podložce nebo pletivu s dostatečně velkými oky, aby jimi mohly plůdky po vylíhnutí propadnout. K přemístění embryí a plůdků v semistatické zkoušce s každodenní úplnou výměnou média je vhodné použít Pasteurovy pipety. (viz bod 1.6.6).
Jsou­li k udržení jiker v hlavní nádrži použity nádoby, mřížky nebo pletiva, měly by být po vylíhnutí plůdků odstraněny (1), pokud ovšem nemají být ponechány k zamezení úniku ryb. Je­li třeba plůdky přemístit, neměly by být vystaveny vzduchu a neměly by se k jejich vytažení z nádob používat síťky (taková opatrnost není nutná u méně křehkých druhů, např. u kapra). Okamžik přemístění se liší podle druhu a nemusí být vždy nutný. U semistatických technik mohou být použity kádinky nebo mělké nádobky a podle potřeby mohou být opatřeny sítem umístěným nepatrně nad dnem kádinky. Je­li objem těchto nádob dostatečný, aby vyhovoval požadavkům na nasazování (viz bod 1.7.1.2) nemusí být přemístění embryí nebo plůdků nutné.
_________________________________________________________
(1) OECD, Paris 1992, Test Guideline 210, Fish, Early-life
    Toxicity Test
XV.1.6.5 Voda
Pro tuto zkoušku je vhodná jakákoliv voda, která vyhovuje chemickým charakteristikám přijatelné ředicím vody, jak jsou uvedeny v dodatku 4 a v níž testovací druhy kontrolních skupin přežívají alespoň tak, jak je uvedeno v dodatcích 2 a 3. Měla by mít po celou dobu zkoušky stejnou kvalitu. pH by se nemělo měnit o více než +/- 0,5. Pro ujištění, že ředící voda nebude mít přílišný vliv na výsledky zkoušky (například tvorbou komplexů se zkoušenou látkou) nebo nepříznivý vliv na stav matečných ryb, by měly být odebírány v pravidelných intervalech její vzorky pro analýzu. Je­li kvalita ředicí vody relativně konstantní, mělo by být stanovení těžkých kovů (např. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd a Ni), hlavních aniontů a kationtů (např. Ca, Mg, Na, K, Cl a SO4), pesticidů (např. celkový obsah organických fosforových a chlorových pesticidů), celkový obsah organického uhlíku a suspendovaných látek provedeno např. každé tři měsíce. Je­li prokázáno, že kvalita vody je konstantní po dobu alespoň jednoho roku, mohou být stanovení méně častá a intervaly lze prodloužit (např. každých šest měsíců).
XV.1.6.6 Zkušební roztoky
Zkušební roztoky o zvolených koncentracích se připraví ředěním zásobního roztoku.
Zásobní roztok by měl být nejlépe připraven jednoduchým mechanickým mícháním nebo protřepáváním zkoušené látky v ředicí vodě (např. mechanickým mícháním a sonifikací). Pro dosažení vhodné koncentrace zásobního roztoku mohou být použity saturační kolony. Neměla by být používána rozpouštědla nebo dispergátory (solubilizační činidla), v některých případech však může být použití takových látek pro vytvoření zásobního roztoku o vhodné koncentraci nezbytné. Ke vhodným rozpouštědlům patří aceton, ethanol, methanol, dimethylformamid a triethylenglykol. Ke vhodným dispergátorům patří Cremophor RH40, Tween 80, 0,01% methylcelulosa a HCO-40. Snadno biologicky rozložitelná činidla (např. aceton) nebo vysoce těkavé sloučeniny je třeba používat rozvážně, neboť mohou způsobit problémy s růstem bakterií v průtokových zkouškách. Je­li použito solubilizační činidlo, nesmí mít významné účinky na přežití ani viditelné nepříznivé účinky na časná vývojová stádia, což musí být prokázáno na kontrolní skupině vystavené pouze rozpouštědlu. Měla by však být vynaložena maximální snaha takové látky nepoužívat.
U semistatických technik mohou být použity dva různé postupy obměny; buď i) se do čistých nádob připraví nové zkušební roztoky a přežívající jikry a plůdky se s malým objemem starého roztoku opatrně přemístí do nových nádob, aniž by se vystavily vzduchu, nebo ii) se testovací organismy ponechají v nádobě a vymění se určitý podíl (alespoň tři čtvrtiny) zkušební vody. Častost obnovování média bude záviset na stálosti zkoušené látky, avšak doporučuje se obnovovat médium denně. Není­li podle předběžných zkoušek stálosti (viz bod 1.4) koncentrace zkoušené látky mezi obnoveními média stálá, (tj. nepohybuje se v intervalu 80 – 120 % nominální koncentrace nebo klesá pod 80 % naměřené počáteční koncentrace), měla by být zvážena průtoková zkouška. V každém případě je třeba dbát na to, aby plůdky nebyly při obnovování vody vystaveny stresu.
Při průtokových zkouškách je pro zajištění řady koncentrací nezbytný systém, který nepřetržitě dávkuje a ředí zásobní roztok zkoušené látky (např. dávkovací čerpadlo, zařízení pro proporcionální ředění, saturační systém). Průtok zásobních roztoků a ředicí vody by měl být kontrolován v určitých intervalech, nejlépe denně, a neměl by se v průběhu zkoušky měnit o více než 10 %. Jako vhodný by shledán průtok zajišťující výměnu alespoň pěti objemů nádrže za 24 h (2).
XV.1.7 POSTUP
Užitečné informace o provádění zkoušek toxicity na rybím embryu a váčkovém plůdku jsou dostupné v literatuře, přičemž některé literární zdroje (7, 8, 9) jsou uvedeny v tomto textu v oddílu s literaturou.
XV.1.7.1 Podmínky expozice
XV.1.7.1.1 Délka expozice
Zkouška se zahájí nejlépe do 30 minut po oplodnění jiker. Embrya se ponoří do zkušebního roztoku před započetím rýhování blastuly, nebo co nejdříve po něm, a v každém případě před počátkem stádia gastruly. U jiker získaných od komerčního dodavatele nemusí být možné zahájit zkoušku ihned po oplodnění. Vhledem k tomu, že citlivost zkoušky může být závažně ovlivněna zpoždění začátku zkoušky, měla by být zkouška zahájena do osmi hodin po oplodnění. Vzhledem k tomu, že se plůdky v průběhu expozice nekrmí, ukončí se zkouška těsně před tím, než dojde k úplné absorpci žloutkového váčku u plůdků v některé ze zkušebních nádrží, nebo než začne v kontrolních skupinách docházet k úhynu v důsledku hladovění. Délka zkoušky bude záviset na použitém druhu. Některé doporučené délky zkoušky jsou uvedeny v dodatcích 2 a 3.
XV.1.7.1.2 Nasazování
Počet oplodněných jiker na začátku zkoušky by měl být dostatečný ke splnění statistických požadavků. Měly by být k expozici náhodně rozděleny a na jednu koncentraci by mělo být rozděleno alespoň 30 jiker rovným dílem (nebo alespoň jak je to jen možné s ohledem na to, že u některých druhů může být obtížné získat stejně velké podíly) mezi alespoň tři další zkušební nádrže. Velikost násady (biomasa v jednotce objemu) by měla být tak nízká, aby bylo možné udržet koncentraci rozpuštěného kyslíku na alespoň 60 % ASV bez provzdušňování. U průtokových zkoušek se doporučuje nasazování nepřekračující 0,5 g/l za 24 h a v žádném okamžiku nepřekračující 5 g/l roztoku (2).
XV.1.7.1.3 Světlo a teplota
Fotoperioda a teplota zkušební vody by měly vyhovovat zkušebním druhům (dodatky 2 a 3). Pro sledování teploty může sloužit další zkušební nádrž.
XV.1.7.2 Zkušební koncentrace
Obvykle je nezbytných pět koncentrací zkoušené látky lišících se od sebe faktorem nepřekračujícím 3,2. Při výběru rozsahu zkušebních koncentrací by měla být zohledněna křivka závislosti hodnoty LC
50
na délce expozice ve studii akutní toxicity. Za určitých okolností může být oprávněné použít méně než pět koncentrací, např. v limitní zkoušce, a užší rozsah koncentrací. Použití méně než pěti koncentrací by mělo být zdůvodněno. Koncentrace látky, které jsou vyšší než 96hodinová LC
50
nebo vyšší než 100 mg/l, podle toho, co je nižší, nemusí být zkoušeny. Látky by neměly být zkoušeny pro koncentrace vyšší, než je jejich rozpustnost ve zkušební vodě.
Použije­li se k usnadnění přípravy zásobního roztoku solubilizační činidlo (viz bod 1.6.6), neměla by být jeho konečná koncentrace ve zkušební nádrži vyšší než 0,1 ml/l a měla by být ve všech zkušebních nádržích stejná.
XV.1.7.3 Kontrolní skupiny
Jako další zkušební sady by měly být nasazeny kontrolní skupina v ředicí vodě (příslušným způsoben znásobená) a podle potřeby také jedna kontrolní skupina se solubilizačním činidlem (příslušným způsoben znásobená).
XV.1.7.4 Častost analytických stanovení a měření
Během zkoušky se koncentrace zkoušené látky stanovují v pravidelných intervalech.
U semistatických zkoušek, pokud se předpokládá, že se bude zkušební koncentrace pohybovat v rozmezí +/- 20 % nominálních hodnot (tj. od 80 do 120 %, viz bod 1.4 a 1.6.6), se doporučuje analyzovat nejvyšší a nejnižší zkušební koncentrace na začátku studie ihned po jejich přípravě a bezprostředně před obnovením alespoň v nejméně třech nádržích (tj. analýzy se provedou na vzorku téhož roztoku – ihned po jeho přípravě a při jeho výměně).
U zkoušek, u nichž se (na základě dat o stálosti látky) předpokládá, že se bude koncentrace zkoušené látky pohybovat v rozmezí větším než +/- 20 % nominální hodnoty, je nezbytné analyzovat všechny zkoušené koncentrace ihned po jejich přípravě a před jejich výměnou, a to stejně často (tj. alespoň ve třech okamžicích rovnoměrně rozložených přes celkovou dobu zkoušky). Stanovení koncentrací zkoušené látky před obnovením je třeba provést pro každou koncentraci pouze u jedné paralelní nádrže. Stanovení se provádějí v odstupu ne více než 7 dnů. Doporučuje se zakládat výsledky na naměřených koncentracích. Lze-li však prokázat, že po celou dobu zkoušky byla koncentrace uspokojivě udržována v rozmezí +/- 20 % nominální hodnoty, mohou být výsledky založeny na nominálních nebo naměřených počátečních hodnotách.
Pro průtokové zkoušky je vhodný podobný vzorkovací režim, jako je popsán u semistatických zkoušek (v tomto případě se však neprovádí měření Dstarých“ roztoků). Je­li zkouška delší než sedm dnů, doporučuje se zvýšit počet odběrů v prvním týdnu (např. tři sady měření) pro ujištění, že jsou zkušební koncentrace stálé.
Může být nezbytné vzorky odstředit nebo filtrovat (např. přes filtr s velikostí pórů 0,45 µm). Vzhledem k tomu, že však odstředění ani filtrace vždy neoddělí od sebe biologicky dostupný a biologicky nedostupný podíl zkušební látky, nemusí být vzorky takto zpracovány.
V průběhu zkoušky se měří v každé zkušební nádrži množství rozpuštěného kyslíku, pH a teplota. Celková tvrdost a solnost se měří v kontrolních nádržích a v jedné nádrži s nejvyšší koncentrací. Množství rozpuštěného kyslíku a solnost (podle potřeby) se měří alespoň třikrát (na začátku, uprostřed a na konci zkoušky). U semistatických zkoušek se doporučuje měřit množství rozpuštěného kyslíku častěji, nejlépe před každým obnovením média a po něm, nebo alespoň jednou týdně. pH se měří na začátku a na konci každé výměny vody u semistatických zkoušek a alespoň týdně u průtokových zkoušek. Tvrdost vody se měří v každé zkoušce jednou. Teplota se měří denně, nejlépe nepřetržitě alespoň v jedné zkušební nádrži.
XV.1.7.5 Pozorování
XV.1.7.5.1 Stádia vývoje embrya
Embryonální stádium (tj. stadium gastruly) na začátku expozice zkoušené látce by mělo být identifikováno co nejpřesněji. Lze to provést za použití reprezentativního vzorku vhodně uchovávaných a očištěných jiker. Popis a vyobrazení embryonálních stádií lze také nalézt v literatuře (2, 5, 10, 11).
XV.1.7.5.2 Líhnutí a přežívání
Líhnutí a přežívání se pozoruje alespoň jednou denně a zaznamenávají se počty. Může být žádoucí provádět na začátku zkoušky častější pozorování (např. každých 30 min během prvních tří hodin), neboť v některých případech mohou být důležitější doby přežití než pouhé počty úhynů (např. dochází­li k akutním toxickým účinkům). Uhynulá embrya a plůdky se odstraní ihned po nalezení, neboť se rychle rozkládají. Při odstraňování uhynulých jedinců se postupuje s mimořádnou opatrností, aby se nezasáhlo do sousedních jiker/plůdků nebo aby se tyto fyzicky nepoškodily, neboť jsou mimořádně subtilní a citlivé. Kritéria uhynutí se u životních stádií liší:
— u jiker: zejména v časných stádiích zřetelná ztráta průsvitnosti a změna ve zbarvení vyvolané koagulací a/nebo sražením bílkovin vedoucími k bílému zakalení,
— u embryí: absence pohybu nebo tepu srdce nebo neprůsvitné zbarvení u druhů, jejichž embrya jsou za normálních okolností průsvitná,
— u plůdků: nepohyblivost nebo absence dýchacích pohybů nebo tepu srdce nebo bílé neprůsvitné zbarvení centrálního nervového systému a nedostatečná reakce na mechanické podněty.
XV.1.7.5.3 Neobvyklý vzhled
Počet plůdků vykazujících neobvyklý tělesný vzhled nebo pigmentaci a stav absorpce žloutkového váčku se zaznamenávají v přiměřených intervalech závisejících na délce zkoušky a na povaze popisované odchylky. Je třeba si uvědomit, že neobvyklá embrya a plůdky se přirozeně vyskytují a u některých druhů jich může být v kontrolních skupinách řádově několik procent. Neobvyklí jedinci by měli být ze zkušební nádrže odstranění pouze v případě uhynutí.
XV.1.7.5.4 Neobvyklé chování
Odchylky, např. hyperventilace, nekoordinované plavání a netypická nečinnost se zaznamenávají v přiměřených intervalech závisejících na délce zkoušky. Tyto účinky, přestože je obtížné je kvantifikovat, mohou – jsou­li pozorovány – napomoci interpretovat data o mortalitě, tj. mohou poskytnout informace o mechanismu toxického působení látky.
XV.1.7.5.5 Tělesná délka
Na konci zkoušky se doporučuje změřit individuální délku: může být změřena standardní délka, délka těla (the fork lenght) nebo celková délka. Došlo­li však k uhnití ocasní ploutve nebo k erozi ploutví, použije se standardní délka. Obecně by měl být v dobře provedených zkouškách variační koeficient pro délku mezi jednotlivými kontrolními skupinami 20 %.
XV.1.7.5.6 Hmotnost
Na konci se zkoušky lze stanovit jednotlivé hmotnosti; hmotnost za sucha (24 h při 60 st.C) se upřednostňuje před živou váhou (po osušení do sucha). Obecně by měl být v dobře provedených zkouškách variační koeficient pro hmotnost mezi jednotlivými kontrolními skupinami 20 %.
Tato pozorování povedou k některým nebo ke všem následujícím údajům, které budou k dispozici pro statistickou analýzu:
— kumulativní mortalita,
— počet zdravých plůdků na konci zkoušky,
— čas začátku líhnutí a konce líhnutí (tj. 90% vylíhnutí v každé paralelní skupině),
— počet plůdků vylíhnutých každý den,
— délka (a hmotnost) ryb, které přežily do konce zkoušky,
— počet plůdků, které jsou deformované nebo mají neobvyklý vzhled,
— počet plůdků vykazujících neobvyklé chování.
XV.2 DATA A ZPRÁVY
XV.2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ
Doporučuje se, aby se návrhu zkoušky i analýzy výsledků zkoušky účastnil statistik, neboť tato zkušební metoda umožňuje značné variace v experimentálním uspořádání, například v počtu zkušebních nádrží, v počtu zkušebních koncentrací, ve výchozím počtu oplodněných jiker v měřených parametrech. Pokud jde o možnosti uspořádání zkoušky, nejsou zde uvedeny žádné pokyny.
Mají­li být odhadnuty hodnoty LOEC/NOEC, bude nezbytné analyzovat odchylky pro každou sadu paralelních skupin pomocí analýzy variance (ANOVA) nebo pomocí kontingenční tabulky. K vícenásobnému porovnání výsledků pro jednotlivé koncentrace a pro kontrolní skupiny může být užitečný Dunnettův test (12, 13). K dispozici jsou další užitečné příklady (14, 15). Vypočte se a uvede stupeň účinku, který lze prokázat pomocí ANOVA nebo jiných metod (tj. vypovídací schopnost zkoušky). Je třeba si uvědomit, že ne všechna pozorování uvedená v bodě 1.7.5.6 jsou vhodná pro statistickou analýzu pomocí ANOVA. Například kumulativní mortalita a počet zdravých plůdků na konci zkoušky by mohly být analyzovány probitovými metodami.
Mají­li být odhadnuty LC nebo ECx, proloží se daty vhodná křivka (vhodné křivky), jako např. logaritmická křivka, a to statistickou metodou, např. metodou nejmenších čtverců nebo nelineární metodou nejmenších čtverců. Křivka nebo křivky by měly být tak parametrizovány, aby bylo možné přímo odhadnout požadované hodnoty LC nebo ECx a jejich směrodatné odchylky. To značně usnadňuje výpočet intervalů spolehlivosti pro hodnoty LC nebo ECx. Pokud nejsou dobré důvody pro upřednostnění jiných intervalů spolehlivosti, uvede se oboustranný 95% interval spolehlivosti. Metoda proložení by měla pokud možno umožnit posouzení závažnosti nedostatků proložení. Proložení lze provést graficky. Regresní analýza je vhodná pro všechna pozorování uvedená v bodě 1.7.5.6.
XV.2.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ
Výsledky by měly být interpretovány opatrně v případě, že se naměřené koncentrace toxické látky ve zkušebních roztocích pohybují na úrovních blízkých mezi stanovitelnosti analytické metody. Interpretace výsledků pro koncentrace vyšší než je rozpustnost látky ve vodě by měla být rovněž opatrná.
XV.2.3 PROTOKOL O ZKOUŠCE
Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:
XV.2.3.1 Zkoušená látka
— fyzikální stav a relevantní fyzikálně­chemické vlastnosti,
— údaje o chemické identitě včetně údajů o čistotě a podle potřeby o metodě kvantitativního stanovení zkoušené látky.
XV.2.3.2 Testovací druh
— vědecký název, kmen, počet matečných ryb (tj. kolik samiček bylo ve zkoušce použito pro opatření požadovaného počtu jiker), zdroj a metoda sběru oplodněných jiker a následné zpracování.
XV.2.3.3 Zkušební podmínky
— použitá zkušební metoda (např. semistatická nebo průtoková metoda, doba od oplodnění do začátku zkoušky, nasazování atd.),
— fotoperioda (fotoperiody),
— uspořádání zkoušky (např. počet zkušebních nádrží a jejich znásobení, počet embryí v nádrži),
— metoda přípravy zásobních roztoků a častost obnovení (je­li použito, uvede se solubilizační činidlo a jeho koncentrace),
— nominální zkušební koncentrace, naměřené hodnoty ve zkušebních nádržích, jejich střední hodnoty a směrodatné odchylky a metody jejich stanovení a je­li zkoušená látka rozpustná ve vodě v koncentracích nižších, než jsou vyšetřované koncentrace, uvede se důkaz toho, že naměřené koncentrace odpovídají koncentraci zkoušené látky v roztoku,
— charakteristiky ředicí vody: hodnota pH, tvrdost, teplota, koncentrace rozpuštěného kyslíku, koncentrace zbytkového chloru (je­li měřena), obsah celkového organického uhlíku, obsah suspendovaných látek, popřípadě salinita zkušebního média a výsledky jakýchkoli jiných provedených měření,
— kvalita vody ve zkušebních nádržích: pH, tvrdost, teplota a koncentrace rozpuštěného kyslíku.
XV.2.3.4 Výsledky
— výsledky případných předběžných studií stálosti zkoušené látky,
— doklady o tom, že kontrolní skupiny splnily obecné požadavky na přijatelnost přežití pro testovací druh (dodatky 2 a 3),
— údaje o mortalitě nebo přežití v embryonálním stádiu a ve stádiu plůdku a údaje o celkové mortalitě nebo přežití,
— doba do vylíhnutí, počet vylíhnutých jedinců,
— údaje o délce (a hmotnosti),
— výskyt a popis morfologických odchylek, pokud se vyskytly,
— výskyt a popis účinků na chování, pokud se vyskytly,
— statistická analýza a zpracování dat,
— u zkoušek analyzovaných pomocí ANOVA nejnižší koncentrace s pozorovanými účinky (LOEC) na úrovni pravděpodobnosti falešně pozitivního hodnocení p = 0,05 a koncentrace bez pozorovaných účinků (NOEC) pro každou posuzovanou reakci, včetně popisu použité statistické metody a údaje o tom, jak velký účinek bylo možné odhalit,
— u zkoušek analyzovaných pomocí regresních metod, hodnoty LC a ECx a intervaly spolehlivosti a graf proloženého modelu použitého pro jejich výpočet,
— vysvětlení jakékoli odchylky od této zkušební metody.
XV.3 LITERATURA
(1) Kristensen P. (1990). Evaluation of the Sensitivity of Short Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS Test Methods. Final report to the Commission of the European Communities, 60 str., červen 1990.
(2) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials. E 1241-88. 26 str.
(3) Brauhn J. L., Schoettger R. A. (1975). Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel Catfish and Bluegills. str. 54, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota.
(4) Brungs W. A., Jones B. R. (1977). Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures. str. 128, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota.
(5) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Biol. 10, 121-173.
(6) Legault R. (1958). A Technique for Controlling the Time of Daily Spawning and Collecting Eggs of the Zebrafish, Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, 328-330.
(7) Dave G., Damgaard B., Grande M., Martelin J. E., Rosander B., Viktor T. (1987). Ring Test of an Embryo-larval Toxicity Test with Zebrafish (Brachydanio rerio) Using Chromium and Zinc as Toxicants. Environ. Toxicol. Chem., 6, 61-71.
(8) Birge J. W., Black J. A., Westerman A. G. (1985). Short-term Fish and Amphibian Embryo- larval Tests for Determining the Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and Estimating Chronic Values for Single Compounds and Complex Effluents. Environ. Toxicol. Chem., 4, 807-821.
(9) Van Leeuwen C. J., Espeldoorn A., Mol F. (1986). Aquatic Toxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related Compounds. III. Embryolarval Studies with Rainbow Trout (Salmo gairdneri). J. Aquatic Toxicology, 9, 129-145.
(10) Kirchen R. V., W. R. West (1969). Teleostean Development. Carolina Tips 32(4): 1-4. Carolina Biological Supply Company.
(11) Kirchen R. V., W. R. West (1976). The Japanese Medaka. Its care and Development. Carolina Biological Supply Company, North Carolina. 36 str.
(12) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121.
(13) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Control. J. Amer. Statist. Assoc, 20, 482-491.
(14) Mc Clave J. T., Sullivan J. H., Pearson J.G. (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data. Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Filadelfie.
(15) Van Leeuwen C. J., Adema D. M. M., Hermes J. (1990). Quantitative Structure-Activity Relationships for Fish Early Life Stage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, 321-334.
(16) Environment Canada. (1992). Toxicity Tests Using Early Life Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon or Atlantic Salmon). Biological Test Method Series. Report EPS 1/RM/28, prosinec 1992, 81 str.
(17) Dave G., Xiu R. (1991). Toxicity of Mercury, Nickel, Lead and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish, Brachydanio rerio. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 21, 126-134.
(18) Meyer A., Bierman C. H., Orti G. (1993). The phylogenetic position of the Zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology – an invitation to the comperative methods. Proc. Royal Society of London, Series B, 252: 231-236.
(19) Ghillebaert F., Chaillou C., Deschamps F., Roubaud P. (1995). Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two Reference Molecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicol. Environ. Safety, 32, 19-28.
(20) US EPA, (1991). Guidelines for Culturing the Japanese Medaka, Oryzias latipes. EPA report EPA/600/3-91/064, Dec. 1991, EPA, Duluth.
(21) US EPA, (1991). Guidelines for Conducting Early Life Stage Toxicity Tests with Japanese Medaka, (Oryzias latipes). EPA report EPA/600/3-91/063, prosinec. 1991, EPA, Duluth.
(22) De Graeve G. M., Cooney J. D., McIntyre D. O., Poccocic T. L., Reichenbach N. G., Dean J. H., Marcus M. D. (1991). Validity in the performance of the seven-day Fathead minnow (Pimephales promelas) larval survival and growth test: an intra- and interlaboratory study. Environ. Toxicol. Chem. 10, 1189-1203.
(23) Calow P. (1993). Handbook of Ecotoxicology, Blackwells, Oxford. Vol. 1, Chapter 10: Methods for spawning, culturing and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estuarine and Marine fish.
(24) Balon E. K. (1985). Early life history of fishes: New developmental, ecological and evolutionary perspectives, Junk Publ., Dordrecht, 280 str.
(25) Blaxter J. H. S. (1988). Pattern and variety in development, v: W. S. Hoar, D. J. Randall eds., Fish Physiology, Vol. XIA, Academic press, 1-58.
TABULKA 1A: Druhy ryb doporučené pro zkoušku
 
Sladkovodní
Oncorhynchus mykiss
pstruh duhový (9, 16)

Danio rerio
danio pruhované (7, 17, 18)

Cyprinus caprio
kapr obecný (8, 19)

Oryzias latipes
halančík japonský (20, 21)

Pimephales promelas
střevle (8, 22)
TABULKA 1B: Příklady dalších dobře popsaných druhů, které byly také použity
 
Sladkovodní                  Mořské

Carassius auratus            Menidia peninsulae
karas zlatý (8)              (23, 24, 25)

Lepomis macrochirus          Clupea harengus
slunečnice modrá (8)         sleď (24, 25)

                             Gadus morhua
                             treska (24, 25)

                             Cyprinodon variegatus
                             (23, 24, 25)
DODATEK 1
NÁVOD K PROVEDENÍ ZKOUŠKY TOXICITY NA EMBRYÍCH A VÁČKOVÝCH PLŮDCÍCH DANIA PRUHOVANÉHO (BRACHYDANIO RERIO)
ÚVOD
Danio pruhované pochází z indického pobřeží Coromandel, kde žije v bystřinách. Je běžnou akvarijní rybou z čeledi kaprovitých. Informace o péči o něj a o jeho chovu jsou uvedeny v standardních příručkách o tropických rybách. Přehled jeho biologie a použití ve výzkumu ryb podává Laale (1).
Ryba zřídka dorůstá délky více než 45 mm. Má válcové tělo se 7 – 9 horizontálními tmavě modrými stříbřitými pruhy. Pruhy pokračují přes ocasní a řitní ploutve. Hřbet má olivově zelený. Samečci jsou štíhlejší než samičky. Samičky jsou stříbrnější a mají rozšířené břicho, zejména před třením.
Dospělé ryby dokáží snášet velké kolísání teploty, pH a tvrdosti vody. Mají­li se získat zdravé ryby poskytující jikry dobré kvality, měly by být zajištěny optimální podmínky.
Při tření sameček sleduje samičku, doráží na ni a při vypuzení jiker je oplodní. Jikry, které jsou průsvitné a nejsou přilnavé, dopadají na dno, kde mohou být pozřeny rodiči. Na tření má vliv světlo. Při odpovídajícím ranním světle se ryby třou v prvních hodinách po rozednění. Samička může klást v odstupu jednoho týdne dávky o několika tisících jiker.
PODMÍNKY PRO MATEČNÉ RYBY, REPRODUKCE A ČASNÁ VÝVOJOVÁ STÁDIA
Vybere se vhodný počet zdravých ryb, které se alespoň dva týdny před předpokládaným třením udržují ve vhodné vodě (např. dodatek 4). Skupiny ryb by měly mít možnost se před kladením jiker pro zkoušku alespoň jednou vytřít. Hustota obsádky ryb by v tomto období neměla přesáhnout 1 gram ryb na litr. Pravidelná výměna vody nebo použití přečišťovacího systému umožní obsádku zvýšit. Teplota v chovných nádržích se má udržovat na 25 +/- 2 st.C. Ryby by měly dostávat rozmanitou stravu, která může obsahovat například komerční suché krmivo, čerstvě vylíhnuté Arthemia, chironomidy, dafnie, bílé červy (Enchytraeids). Dále jsou uvedeny dvě metody, které v praxi vedly k získání dostatečného množství zdravých oplodněných jiker pro provedení zkoušky:
i) Osm samiček a 16 samečků se umístí do nádrže obsahující 50 litrů ředicí vody, chráněné před přímým světlem a ponechají se alespoň 48 h co nejvíce v klidu. Na dno nádrže se odpoledne v den před započetím zkoušky umístí podložka pro tření. Podložka pro tření se skládá z 5 – 7 mm vysokého rámu (z plexiskla nebo jiného vhodného materiálu) s 2 – 5mm hrubým roštem nahoře a s 10 – 30µm jemným roštem vespod. Na hrubém roštu je připevněn třecí substrát vyrobený z nylonových vláken. Poté co byly ryby drženy 12 h v temnu se slabě nasvítí, čímž se vyvolá tření. Dvě až čtyři hodiny po vytření se podložka pro tření vyjme a jikry se seberou. Podložka pro tření zabrání rybám v požírání jiker a zároveň umožní snadný sběr jiker. Skupiny ryb by se měly před třením určeným k produkci jiker pro zkoušku vytřít alespoň jednou.
ii) Pět až deset samečků a samiček se alespoň dva týdny před zamýšleným třením chová odděleně. Po 5 až 10 dnech se břicha samiček rozšíří a zviditelní se jejich pohlavní papily. Samečci papily nemají. Tření se provede v třecích nádržích opatřených falešným dnem z pletiva (jako výše). Nádrž se naplní ředicí vodou tak, aby voda sahala 5 – 10 cm nad rošt. Jedna samička a dva samečci se umístí do nádrže den před zamýšleným třením. Teplota vody se postupně zvýší jeden stupeň nad aklimatizační teplotu. Vypne se osvětlení a nádrž se ponechá co nejvíce v klidu. Ráno se slabě nasvítí, čímž se vyvolá tření. Po 2 – 4 h se ryby vyjmou a jikry se seberou. Je­li potřeba více dávek jiker, než lze získat od jedné samičky, nasadí se paralelně dostatečný počet třecích nádrží. Zaznamenáním reprodukční úspěšnosti (množství a kvality) jednotlivých samiček před zkouškou, lze vybrat pro chov samičky s nejvyšší úspěšností.
Jikry se přenesou do zkušebních nádrží skleněnou trubičkou (o vnitřním průměru ne menším než 4 mm) opatřenou pružným nasávacím balónkem. Množství vody, které se přenáší s jikrami, by mělo být co nejmenší. Jikry jsou těžší než voda a z trubičky vypadnou do vody. Je třeba zabránit tomu, aby jikry (a plůdky) přišly do kontaktu se vzduchem. Mikroskopickým vyšetřením vzorku (vzorků) jiker se ověří, že v prvních stádiích vývoje nedošlo k nepravidelnostem. Desinfekce jiker není přípustná.
Mortalita jiker je nejvyšší během prvních 24 h po oplodnění. V této době je často pozorována mortalita 5 – 40 %. Jikry degenerují v důsledku neúspěšného oplodnění nebo vývojových vad. Zdá se, že kvalita dávek jiker závisí na samičce, neboť některé samičky soustavně kladou jikry dobré kvality, jakou jiné samičky neposkytují. Rovněž rychlost vývoje a líhnutí se mezi snůškami liší. Úspěšně oplodněné jikry a plůdky se žloutkovým váčkem přežívají dobře, obvykle jich přežívá více než 90 %. Při 25 st.C se z jiker líhnou jedinci po 3 – 5 dnech po oplodnění a žloutkový váček je absorbován přibližně po 13 dnech po oplodnění.
Embryonální vývoj byl dobře popsán Hisaokou a Battlem (2). Díky průsvitnosti jiker a plůdků čerstvě po vylíhnutí lze vývoj ryb dobře sledovat a lze pozorovat malformace. Přibližně čtyři hodiny po vytření lze rozlišit neoplodněné jikry od oplodněných (3). K tomuto vyšetření se jikry a plůdky umístí do nádobky o malém objemu a prohlížejí se pod mikroskopem.
Zkušební podmínky požadované pro časná vývojová stádia jsou uvedena v dodatku 2. Optimální hodnoty pH a tvrdosti vody jsou 7,8 a 250 mg/l, vyjádřeno jako CaCO
3
.
VÝPOČTY A STATISTIKA
Navrhuje se dvoufázový přístup. V první fázi se statisticky analyzují data o mortalitě, nenormálním vývoji a době líhnutí. Poté se pro ty koncentrace, při nichž nebyly pozorovány žádné nepříznivé účinky na tyto parametry, statisticky vyhodnotí tělesná délka. Tento přístup se doporučuje, neboť toxická látka může selektivně usmrcovat menší ryby, prodlužovat dobu líhnutí a indukovat makroskopické malformace a tedy zkreslovat délku. Kromě toho tak bude pro každou expozici měřen zhruba stejný počet ryb, čímž se zajistí validita statistiky zkoušky.
STANOVENÍ LC
50
a EC
50
Procento  přežití jiker a čerstvých plůdků se  vypočte  a
zkoriguje  na  mortalitu  v kontrolních  skupinách  podle
Abbottovy rovnice (4):

          C - P'
 P = 100 --------- x 100
             C
kde:
P = korigované procento přežití
P' = procento přežití pozorované ve zkušební koncentraci
C = procento přežití v kontrolní skupině
Podle možnosti se vhodnou metodou stanoví hodnota LC
50
na konci zkoušky.
Požaduje­li se, aby byly do statistiky pro EC
50
zahrnuty morfologické odchylky, lze k tomu nalézt návod v práci Stephana (5).
ODHAD LOEC A NOEC
Cílem zkoušky na jikrách a váčkových plůdcích je porovnat koncentrace, u nichž byl pozorovatelný účinek, s kontrolními skupinami, tj. stanovit LOEC. Použije se tedy metoda vícenásobného srovnání (6, 7, 8, 9, 10).
LITERATURA
(1) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, 121-173.
(2) Hisaoka K. K., Battle H. I. (1958). The Normal Development Stages of the Zebrafish Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan), J. Morph., 102, 311 str.
(3) Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrab‰rbling (Brachydanio rerio Hamilton- Buchanan). J. Appl. Ichthyol., 2, 173-181.
(4) Finney D. J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, Great Britain, 1-333.
(5) Stephan C. E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 766, J. G. Pearson, R. B. Foster, W. E. Bishop, Eds., American Society for Testing and Materials, 69-81.
(6) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121.
(7) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Control. J. Amer. Statist. Assoc, 20, 482-491.
(8) Williams D. A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. J. Amer. Statist. Assoc, 27, 103-117.
(9) Williams D. A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with a Zero Dose Control. J. Amer. Statist. Assoc 28, 519-531.
(10) Sokal R. R., Rohlf F. J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of Statistics in Biological Research, W. H. Freeman, Co., San Francisco.
DODATEK 2
ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY, DÉLKA ZKOUŠKY A KRITÉRIA PŘEŽITÍ PRO DOPORUČENÉ DRUHY
------------------------------------------------------------------------- -------------------------------------------
    Druh          Teplota      Salinita Fotoperioda      Délka stádií        Typická délka           Přežití
                    (st.C)         (‰)        (h)              (d)                zkoušky           v kontrolních
                                                                                                    skupinách
                                                                                                (minimální hodnota
                                                                                                       v %)
                                                     Embryo  Váčkový                           Úspěšnost  Po
                                                             plůdek                            líhnutí    vylíhnutí
------------------------------------------------------------------------- -------------------------------------------
SLADKOVODNÍ                                                                                               

Brachydanio   25 +/- 1         —        12-16        3-5     8-10          Pokud  možno  ihned 80         90
rerio                                                                      od   oplodnění  (od
Danio                                                                      časného      stádia
pruhované                                                                  gastruly) do 5  dnů
                                                                           po  vylíhnutí (8  -
                                                                           10 dnů)

Oncorhynchus  10 +/- 1 (1)     —        0(3)         30-35   25-30         Pokud  možno  ihned 66         70
mykiss        12 +/- 1 (2)                                                 od   oplodnění  (od
Pstruh duhový                                                              časného      stádia
                                                                           gastruly) do 20 dnů
                                                                           po vylíhnutí (50  -
                                                                           55 dnů)

Cyprinus      21-25            —        12-16        5       > 4        Pokud  možno  ihned 80         75
carpio                                                                     od   oplodnění  (od
Kapr obecný                                                                časného      stádia
                                                                           gastruly) do 4  dnů
                                                                           po  vylíhnutí (8  -
                                                                            9 dnů)

Oryzias       24 +/- 1 (1)     —        12-16        8-11    4-8           Pokud  možno  ihned 80         80
latipes       23 +/- 1 (2)                                                 od   oplodnění  (od
Halančík                                                                   časného      stádia
japonský                                                                   gastruly) do 5  dnů
                                                                           po vylíhnutí (13  -
                                                                            16 dnů)

Pimephales    25 +/- 2         —        16           4-5     5             Pokud  možno  ihned 60         70
promelas                                                                   od   oplodnění  (od
Střevle                                                                    časného      stádia
                                                                           gastruly) do 4  dnů
                                                                           po  vylíhnutí (8  -
------------------------------------------------------------------------- -------------------------------------------                                                                            9 dnů)
1 Pro embrya.
2 Pro plůdky.
3 Temno  pro embrya a plůdky do jednoho týdne po vylíhnutí, s výjimkou  okamžiků
  prohlídky. Poté po dobu zkoušky tlumené světlo.
DODATEK 3
ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY, DÉLKA ZKOUŠKY A KRITÉRIA PŘEŽITÍ PRO JINÉ DOBŘE POPSANÉ DRUHY
------------------------------------------------------------------------- -------------------------------------------
      Druh          Teplota    Salinita Fotoperioda      Délka stádií        Typická délka           Přežití
                     (st.C)        (‰)        (h)               (d)               zkoušky           v kontrolních
                                                                                                    skupinách
                                                                                                (minimální hodnota
                                                                                                       v %)

                                                      Embryo   Váčkový                         Úspěšnost     Po
                                                                plůdek                          líhnutí   vylíhnutí
------------------------------------------------------------------------- -------------------------------------------
SLADKOVODNÍ                                                                                                

Carassius        24 +/- 1      —        —            3-4      > 4        Pokud  možno  ihned —          80
auratus                                                                    od   oplodnění  (od
karas zlatý                                                                časného      stádia
                                                                           gastruly) do 4  dnů
                                                                           po        vylíhnutí
                                                                           (7 dnů)

Leopomis         21 +/- 1      —        16           3        > 4        Pokud  možno  ihned —          75
macrochirus                                                                od   oplodnění  (od
slunečnice modrá                                                           časného      stádia
                                                                           gastruly) do 4  dnů
                                                                           po        vylíhnutí
                                                                           (7 dnů)

MOŘSKÝ                                                                                                     

Menidia          22-25         15-22    12           1,5      10            Pokud  možno  ihned 80         60
peninsulae                                                                 od   oplodnění  (od
                                                                           časného      stádia
                                                                           gastruly) do 5  dnů
                                                                           po  vylíhnutí (6  -
                                                                            7 dnů)

Clupea harengus  10 +/- 1      8-15     12           20-25    3-5           Pokud  možno  ihned 60         80
Sleď                                                                       od   oplodnění  (od
                                                                           časného      stádia
                                                                           gastruly) do 3  dnů
                                                                           po vylíhnutí (23  -
                                                                            27 dnů)

Gadus morhua     5 +/- 1       5-30     12           14-16    3-5           Pokud  možno  ihned 60         80
Treska                                                                     od   oplodnění  (od
                                                                           časného      stádia
                                                                           gastruly) do 3  dnů
                                                                           po        vylíhnutí
                                                                           (18 dnů)

Cyprinodon       25 +/- 1      15-30    12           —        —             Pokud  možno  ihned > 75    80
variegatus                                                                 od   oplodnění  (od
                                                                                   časného      stádia
                                                                           gastruly)        do
                                                                           4/7     dnů      po
                                                                           vylíhnutí (28 dnů)
------------------------------------------------------------------------- -------------------------------------------
DODATEK 4
NĚKTERÉ CHEMICKÉ CHARAKTERISTIKY PŘIJATELNÉ ŘEDICÍ VODY
Látka                                                          Koncentrace

Nerozpuštěné látky                                             < 20 mg/l
Celkový organický uhlík                                        < 2 mg/l
Nedisociovaný amoniak                                          < 1 µg/l
Zbytkový chlor                                                 < 10 µg/l
Celkové organofosforové pesticidy                              < 50 ng/l
Celkové organochlorové pesticidy a polychlorované bifenyly     < 50 ng/l
Celkový organický chlor                                        < 25 ng/l
XVI. METODA PRO STANOVENÍ AKUTNÍ ORÁLNÍ TOXICITY PRO VČELU MEDONOSNOU – metoda C.16 podle přílohy směrnice 2001/59/ES
XVI.1 METODA
Tato zkouška akutní toxicity je replikou metody OECD TG 213 (1998).
XVI.1.1 ÚVOD
Tato zkouška toxicity je laboratorní metodou určenou k posouzení orální akutní toxicity přípravků na ochranu rostlin a jiných chemických látek pro dospělou dělnici včely medonosné. Při posuzování a hodnocení toxických charakteristik látek může být nezbytné stanovení akutní orální toxicity pro včelu medonosnou, např. může-li dojít k expozici včel dané chemické látce. Zkouška akutní orální toxicity se provádí s cílem stanovit vlastní toxicitu pesticidů a jiných chemických látek pro včely. Výsledky této zkoušky by měly být použity pro formulování potřeby dalšího posuzování. Tato metoda může být použita zejména ve stupňovaných programech hodnocení nebezpečnosti pesticidů pro včely založených na postupném přechodu od laboratorních zkoušek k semi-polním experimentům (1). Pesticidy mohou být zkoušeny ve formě účinné látky (ú. l.) nebo ve formě formulovaných přípravků.
K ověření citlivosti včel a přesnosti zkušebního postupu se použije referenční látka.
XVI.1.2 DEFINICE
Akutní orální toxicita: je nepříznivý účinek, ke kterému dojde nejpozději do 96 h od orálního podání jedné dávky zkoušené látky.
Dávka: je množství požité zkoušené látky. Dávka se vyjadřuje hmotností (µg) zkoušené látky na jeden testovací organismus (µg na včelu). Skutečnou dávku u každé včely nelze vypočítat, neboť se včely krmí kolektivně. Lze však odhadnout průměrnou dávku (celkové požité množství zkoušené látky dělené počtem včel v klícce).
LD
50
(střední letální dávka) orálně: je statisticky vypočtená jednotlivá dávka látky, která může po orálním podáním způsobit úhyn 50 % jedinců. Hodnota LD
50
se vyjadřuje v µg zkoušenou látky na jednu včelu. U pesticidů muže být zkoušenou látkou buď účinná látka (ú. l) nebo formulovaný přípravek obsahující jednu nebo více účinných látek.
Mortalita: jedinec se považuje za uhynulý, jeli zcela nepohyblivý.
XVI.1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Dospělé dělnice včely medonosné (Apis mellifera) se exponují řadě dávek zkoušené látky rozptýlené do cukerného roztoku. Včely jsou poté krmeny stejným roztokem neobsahujícím zkoušenou látku. Mortalita se zaznamenává denně během alespoň 48 hodin a porovnává se s kontrolními hodnotami. Jestliže mortalita v průběhu 24 a 48 h roste, zatímco kontrolní mortalita zůstává na přijatelné úrovni, tj. =< 10 %, je vhodné zkoušku prodloužit na maximálně 96 h. Výsledky zkoušky se analyzují s cílem vypočítat LD
50
pro 24 h a 48 h a v případě prodloužené studie pro 72 h a 96 h.
XVI.1.4 VALIDITA ZKOUŠKY
Má-li být zkouška platná, musí být splněny následující podmínky:
— průměrná mortalita u všech kontrolních skupin nesmí na konci zkoušky překročit 10 %,
— LD
50
pro referenční látku odpovídá předpokládané hodnotě .
XVI.1.5 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
XVI.1.5.1 Včelstvo
Použijí se mladé dospělé včely dělnice z téhož plemena, tj. včely stejného stáří, stejně krmené, stejného druhu atd. Včely by měly být získány z přiměřeně krmeného, zdravého včelstva s matkou, pokud možno bez nemocí a se známou anamnézou a fyziologickým stavem. Měly by být vybrány ráno v den zkoušky nebo by měly být vybrány večer před zkouškou a drženy v podmínkách zkoušky do příštího dne. Vhodné jsou včely z plástů bez plůdků. Včely by neměly být vybírány brzy na jaře nebo pozdě na podzim, neboť se během těchto období fyziologicky mění. Musí-li být zkoušky provedeny brzy na jaře nebo pozdě na podzim, měly by se včely vylíhnout v inkubátoru a měly by být živeny plástovým pylem (pyl sebraný z plástu) a cukrovým roztokem. Včely ošetřované chemickými látkami, jako jsou antibiotika a prostředky proti varoáze, by neměly být použity pro zkoušky toxicity po čtyři týdny od konce posledního ošetření.
XVI.1.5.2 Podmínky chovu a krmení
Použijí se snadno čistitelné a dobře větrané klícky. Lze použít jakýkoli vhodný materiál, např. klícky z korozivzdorné oceli, pletiva, plastu nebo jednorázové dřevěné klícky atd. Nasazují se pokud možno skupiny po 10 včelách. Velikost zkušebních klícek by měla vyhovovat počtu včel, tj. měla by poskytovat dostatek prostoru.
Včely by měly být drženy v temnu v experimentální místnosti při teplotě 25 +/- 2 st.C. Po dobu zkoušky se zaznamenává relativní vlhkost, která je obvykle 50 – 70 %. Obsluha, včetně exponování a pozorování, může být prováděna za (denního) světla. Jako potrava se používá vodný roztok cukru o konečné koncentraci 500 g*l
-1
(50% (m/V)). Po podání zkušební dávky se podává potrava podle libosti. Systém krmení by měl umožňovat zaznamenání příjmu potravy pro každou klícku (viz bod 1.6.3.1). Lze použít skleněnou trubičku (přibližně 50 mm dlouhou, s průměrem 10 mm, zúženou na otevřeném konci na průměr asi 2 mm).
XVI.1.5.3 Příprava včel
Shromážděné včely se náhodně rozdělí do klícek, které se náhodně umístí v experimentální místnosti.
Před začátkem zkoušky mohou včely až 2 h hladovět. Doporučuje se, aby nebyla včelám před expozicí podávána potrava, aby byly na začátku zkoušky rovnocenné, pokud jde o obsah zažívacího ústrojí. Včely v agónii se před zahájením zkoušky nahradí zdravými včelami.
XVI.1.5.4 Příprava dávek
Je-li zkoušená látka mísitelná s vodou, může být rozptýlena přímo v 50% cukerném roztoku. U technických přípravků a látek s nízkou rozpustností ve vodě mohou být použita vehikula, jakou jsou organická rozpouštědla, emulgátory nebo dispergátory s nízkou toxicitou pro včely (např. aceton, dimethylformamid, dimethylsulfoxid). Koncentrace vehikula závisí na rozpustnosti zkoušené látky a měla by být stejná pro všechny zkoušené koncentrace. Obecně je přiměřená 1% koncentrace vehikula a neměla by být překračována.
Připraví se vhodné kontrolní roztoky, tzn. Použijí-li se k rozpuštění zkoušené látky rozpouštědlo nebo dispergátor, použijí se dvě samostatné kontrolní skupiny: roztok ve vodě a cukerný roztok s rozpouštědlem/nosičem v koncentraci použité v dávkách.
XVI.1.6 POSTUP
XVI.1.6.1 Zkušební a kontrolní skupiny
Počet zkoušených dávek a jejich opakování by měl splňovat statistické požadavky na stanovení LD
50
na úrovni spolehlivosti 95 %. Zpravidla se pro zkoušku požaduje alespoň pět zkušebních koncentrací tvořících geometrickou řadu s faktorem nepřekračujícím 2,2 a pokrývajících rozsah pro LD
50
. Ředicí faktor a počet koncentrací pro dávkování se však stanoví s ohledem na směrnici křivky toxicity (dávka versus mortalita) a s ohledem na statistickou metodu zvolenou pro analýzu výsledků. Vhodné koncentrace pro dávky je možné zvolit pomocí orientační zkoušky.
Každá zkušební koncentrace se podá alespoň třem paralelním zkušební skupinám o 10 včelách. Vedle zkušebních skupin se nasadí alespoň tři kontrolní skupiny, každá o 10 včelách. Nasadí se také zkušební skupiny pro použité rozpouštědlo nebo nosič (viz bod 1.5.4).
XVI.1.6.2 Referenční látka
V rámci zkušebních skupin se použije referenční látka. Vyberou se alespoň tři dávky pokrývající očekávanou hodnotu LD
50
. Pro každou zkušební dávku se nasadí alespoň tři paralelní klícky po deseti včelách. Přednostní referenční látkou je dimethoát, pro nějž se uvádí LD
50
, 24 h, orálně v rozmezí 0,10 – 0,35 µg účinné látky na včelu (2). Jsou však přijatelné i jiné referenční látky, pokud lze předložit dostatek údajů pro ověření očekávané reakce na dávku (např. parathion).
XVI.1.6.3 Expozice
XVI.1.6.3.1 Podávání dávek
Každé zkušební skupině včel se podá 100 – 200 µl 50% vodného cukerného roztoku obsahujícího zkoušenou látku ve vhodné koncentraci. Větší objem je nezbytný u látek s nízkou rozpustností, nízkou toxicitou nebo nízkou koncentrací ve formulaci, neboť v cukerném roztoku musí být použit větší podíl. Sleduje se množství spotřebované potravy se zkoušenou látkou. Po spotřebování potravy (obvykle do 3 – 4 h) se z klícky odebere krmicí zařízení a nahradí se krmicím zařízením obsahujícím pouze cukerný roztok. Cukerný roztok se poté podává podle libosti. U některých sloučenin může vést odmítnutí potravy s vysokými koncentracemi k tomu, že je spotřebováno málo potravy nebo že se nespotřebuje žádná potrava. Po maximálně 6 h se nespotřebovaná potrava se zkoušenou látkou nahradí samotným cukerným roztokem. Stanoví se množství spotřebované potravy se zkoušenou látkou (např. měřením objemu nebo zvážení nespotřebované stravy).
XVI.1.6.3.2 Délka zkoušky
Zkouška trvá 48 h od okamžiku, kdy byl zkušební roztok nahrazen samotným cukerným roztokem. Vzroste-li mortalita během prvních 24 h o 10 %, zkouška se prodlouží na 96 h, pokud mortalita v kontrolních skupinách nepřekročí 10 %.
XVI.1.6.4 Pozorování
Mortalita se zaznamená po 4 h od zahájení zkoušky a poté po 24 h a 48 h (rozumí se po podání dávky). Jeli nezbytné pozorování prodloužit, provedou se další vyhodnocení v 24hodinových intervalech až do maximálně 96 hodin, pokud mortalita v kontrolních skupinách nepřekračuje 10 %.
Odhadne se množství spotřebované potravy. Porovnáním rychlostí spotřebování potravy se zkoušenou látkou a bez ní lze získat informaci o přijatelnosti potravy se zkoušenou látkou. Zaznamená se neobvyklé chování pozorované během doby zkoušky.
XVI.1.6.5 Limitní zkouška
V některých případech (např. očekává-li se u látky nízká toxicita) může být provedena limitní zkouška za použití 100 µg účinné látky na včelu s cílem prokázat, že LD
50
je vyšší než tato hodnota. Při ní se postupuje stejným způsobem, tj. nasadí se tři paralelní zkušební skupiny pro každou zkušební koncentraci, odpovídající kontrolní skupiny, stanoví se množství spotřebované potravy s účinnou látkou a použije se referenční látka. Dojde-li k úhynům, musí se provést úplná studie. Jsou-li pozorovány subletální účinky (viz bod 1.6.4), zaznamenají se.
XVI.2 DATA A ZPRÁVY
XVI.2.1 DATA
Data se shrnou do tabulky, přičemž se pro každou zkušební skupinu, kontrolní skupiny a skupiny s referenční látkou uvede počet použitých včel, mortalita v každém pozorovacím čase a počet včel s nepříznivě ovlivněným chováním. Údaje o mortalitě se analyzují vhodnými statistickými metodami (např. probitovou analýzou, klouzavým průměrem, proložením binomického rozdělení) (3, 4). Sestrojí se křivky závislosti dávka-odezva pro každý čas pozorování a vypočtou se směrnice křivek a střední letální dávky (LD
50
) s 95% intervalem spolehlivosti. Korekce na mortalitu ve kontrolních skupinách lze provést Abbottovou korekcí (4, 5). Pokud nebyla potrava zcela spotřebována, stanoví se spotřebovaná dávka zkoušené látky na skupinu. LD
50
se vyjádří v µg zkoušené látky na včelu.
XVI.2.2 PROTOKOL O ZKOUŠCE
Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:
XVI.2.2.1 Zkoušená látka
— fyzikální stav a relevantní fyzikálněchemické vlastnosti (např. stálost ve vodě, tlak par),
— údaje o chemické identitě včetně strukturního vzorce, čistota, (tj. u pesticidů identita a koncentrace účinné látky (účinných látek)).
XVI.2.2.2 Testovací druh
— vědecký název, plemeno, přibližné stáří (v týdnech), metoda výběru včel, datum výběru,
— informace o včelstvech použitých pro výběr testovacích včel, včetně informací o zdravotním stavu, nemocech dospělců, o případné přípravě atd.
XVI.2.2.3 Zkušební podmínky
— teplota a relativní vlhkost v experimentální místnosti,
— podmínky chovu včetně typu, velikosti a materiálu klícek,
— metody přípravy zásobních a zkušebních roztoků (jeli použito, uvede se rozpouštědlo a jeho koncentrace),
— metoda přípravy zásobních roztoků a častost obnovení (jeli použito, uvede se solubilizační činidlo a jeho koncentrace),
— uspořádání zkoušky, např. použité zkušební koncentrace a jejich počet, počet kontrolních skupin, pro každou koncentraci a kontrolu počet paralelních klícek a počet včel na klícku,
— datum zkoušky.
XVI.2.2.4 Výsledky
— výsledky předběžné orientační zkoušky, byla-li provedena,
— primární údaje: mortalita pro každou zkoušenou koncentraci v každém čase pozorování,
— graf křivek závislosti dávka-odezva na konci zkoušky,
— hodnoty LD
50
s 95% intervaly spolehlivosti pro každý doporučený čas pozorování a to pro zkoušenou látku a pro referenční látku,
— statistické metody použité pro stanovení LD
50
,
— mortalita v kontrolních skupinách,
— jiné pozorované nebo naměřené biologické účinky, např. neobvyklé chování včel (včetně odmítnutí zkušební dávky), rychlost spotřebování potravy v exponovaných a neexponovaných skupinách,
— jakákoli odchylka od zde popsaného zkušebního postupu a jiné důležité informace.
XVI.3 LITERATURA
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision- Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.1, str. 151 – 165. březen 1993.
(2) Gough, H. J., McIndoe, E. C., Lewis, G. B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.), 1981 – 1992. J. Apicultur. Res. 22, str. 119 – 125.
(3) Litchfield, J. T., Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J. Pharm. Exper. Ther., 96, str. 99 – 113.
(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York.
(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. J. Econ. Entomol. 18, str. 265 – 267.
XVII. METODA PRO STANOVENÍ AKUTNÍ KONTAKTNÍ TOXICITY PRO VČELU MEDONOSNOU – metoda C.17 podle přílohy směrnice 2001/59/ES
XVII.1 METODA
Tato zkouška akutní toxicity je replikou metody OECD TG 214 (1998).
XVII.1.1 ÚVOD
Tato zkouška toxicity je laboratorní metodou určenou k posouzení akutní kontaktní toxicity přípravků na ochranu rostlin a jiných chemických látek pro dospělou dělnici včely medonosné. Při posuzování a hodnocení toxických charakteristik látek může být nezbytné stanovení akutní kontaktní toxicity pro včelu medonosnou, např. může­li dojít k expozici včel dané chemické látce. Zkouška akutní kontaktní toxicity se provádí s cílem stanovit vlastní toxicitu pesticidů a jiných chemických látek pro včely. Výsledky této zkoušky by měly být použity pro formulování potřeby dalšího posuzování. Tato metoda může být použita zejména ve stupňovaných programech hodnocení nebezpečnosti pesticidů pro včely založených na postupném přechodu od laboratorních zkoušek k semi-polním experimentům (1). Pesticidy mohou být zkoušeny ve formě účinné látky (ú. l.) nebo ve formě formulovaných přípravků. K ověření citlivosti včel a přesnosti zkušebního postupu se použije referenční látka.
XVII.1.2 DEFINICE
Akutní kontaktní toxicita: je nepříznivý účinek, ke kterému dojde nejpozději do 96 h od lokální aplikace jedné dávky zkoušené látky. Dávka: je množství aplikované zkoušené látky. Dávka se vyjadřuje v hmotnosti (µg) zkoušené látky na jednoho zkušebního živočicha (µg na včelu).
LD
50
(střední letální dávka) kontaktně: je statisticky vypočtená jednotlivá dávka látky, která může po kontaktní aplikaci způsobit úhyn 50 % jedinců. Hodnota LD
50
se vyjadřuje v µg zkoušené látky na jednu včelu. U pesticidů muže být zkoušenou látkou buď účinná látka (ú. l) nebo formulovaný přípravek obsahující jednu nebo více účinných látek.
Mortalita: jedinec se považuje za uhynulý, je­li zcela nepohyblivý.
XVII.1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Dospělé dělnice včely medonosné (Apis mellifera) se exponují řadě dávek zkoušené látky rozpuštěné ve vhodném nosiči přímou aplikací na hrudník (jako kapičky). Zkouška trvá 48 h. Jestliže mortalita v průběhu 24 a 48 h roste, zatímco kontrolní mortalita zůstává na přijatelné úrovni, tj. 10 %, je vhodné zkoušku prodloužit na maximálně 96 h. Mortalita se zaznamenává denně a porovnává se s kontrolními hodnotami. Výsledky zkoušky se analyzují s cílem vypočítat LD
50
pro 24 h a 48 h a v případě prodloužené studie pro 72 h a 96 h.
XVII.1.4 VALIDITA ZKOUŠKY
Má-li být zkouška platná, musí být splněny následující podmínky:
— průměrná mortalita u všech kontrolních skupin nesmí na konci zkoušky překročit 10 %,
— LD
50
pro referenční standard odpovídá specifikovanému rozsahu.
XVII.1.5 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
XVII.1.5.1 Výběr včel
Použijí se mladé dospělé včely dělnice z téhož plemena, tj. včely stejného stáří, stejně krmené, stejného druhu atd. Včely by měly být získány z přiměřeně krmeného, zdravého včelstva s matkou, pokud možno bez nemocí a se známou anamnézou a fyziologickým stavem. Měly by být vybrány ráno v den zkoušky nebo by měly být vybrány večer před zkouškou a drženy v podmínkách zkoušky do příštího dne. Vhodné jsou včely z plástů bez plůdků. Včely by neměly být vybírány brzy na jaře nebo pozdě na podzim, neboť se během těchto období fyziologicky mění. Musí-li být zkoušky provedeny brzy na jaře nebo pozdě na podzim, měly by se včely vylíhnout v inkubátoru a měly by být živeny plástovým pylem (pyl sebraný z plástu) a cukrovým roztokem. Včely ošetřované chemickými látkami, jako jsou antibiotika a prostředky proti varoáze, by neměly být použity pro zkoušky toxicity po čtyři týdny od konce posledního ošetření.
XVII.1.5.2 Podmínky chovu a krmení
Použijí se snadno čistitelné a dobře větrané klícky. Lze použít jakýkoli vhodný materiál, např. klícky z korozivzdorné oceli, pletiva, plastu nebo jednorázové dřevěné klícky atd. Velikost zkušebních klícek by měla vyhovovat počtu včel, tj. klícky by měly poskytovat dostatek prostoru. Nasazují se pokud možno skupiny po 10 včelách.
Včely by měly být drženy v temnu v experimentální místnosti při teplotě 25 +/- 2 st.C. Po dobu zkoušky se zaznamenává relativní vlhkost, která je obvykle 50 – 70 %. Obsluha, včetně exponování a pozorování, může být prováděna za (denního) světla. Jako potrava se používá vodný roztok cukru o konečné koncentraci 500 g*l
-1
(50% (m/V)) a podává se za použití včelího krmítka po dobu zkoušky podle libosti. Lze použít skleněnou trubičku (přibližně 50 mm dlouhou, s průměrem 10 mm, zúženou na otevřeném konci na průměr asi 2 mm).
XVII.1.5.3 Příprava včel
Shromážděné včely mohou být za účelem aplikace zkušební látky narkotizovány oxidem uhličitým nebo dusíkem. Množství anestetika v době expozice by mělo být minimalizováno. Včely v agónii se před zahájením zkoušky nahradí zdravými včelami.
XVII.1.5.4 Příprava dávek
Zkušební látka se aplikuje jako roztok v nosiči, tj. v organickém rozpouštědle nebo ve vodě se smáčedlem. Jako organické rozpouštědlo se upřednostňuje aceton, mohou však být použity i jiná rozpouštědla s nízkou toxicitou pro včely (např. dimethylformamid, dimethylsulfoxid). U formulovaných přípravků dispergovaných ve vodě a u silně polárních organických látek nerozpustných v organických nosičových rozpouštědlech lze aplikaci usnadnit jejich rozpuštění ve slabém roztoku komerčního smáčedla (např. smáčedla Agral, Cittowett, Lubrol, Triton, Tween). Připraví se vhodné kontrolní roztoky, tzn. použijí­li se k rozpuštění zkušební látky rozpouštědlo nebo dispergátor, použijí se dvě samostatné kontrolní skupiny: roztok ve vodě a roztok s rozpouštědlem/nosičem.
XVII.1.6 POSTUP
XVII.1.6.1 Zkušební a kontrolní skupiny
Počet zkoušených dávek a jejich paralelních experimentů by měl splňovat statistické požadavky na stanovení LD
50
na hladině spolehlivosti 95 %. Zpravidla se pro zkoušku požaduje alespoň pět zkušebních koncentrací tvořících geometrickou řadu s faktorem nepřekračujícím 2,2 a pokrývajících rozsah pro LD
50
. Počet dávek se však stanoví s ohledem na směrnici křivky toxicity (dávka versus mortalita) a s ohledem na statistickou metodu zvolenou pro analýzu výsledků. Vhodné dávky je možné zvolit pomocí orientační zkoušky.
Každá zkušební koncentrace se podá alespoň třem paralelním zkušební skupinám o 10 včelách. Vedle zkušebních skupin se nasadí alespoň tři kontrolní skupiny, každá o 10 včelách. Je­li použito organické rozpouštědlo nebo smáčedlo, zařadí se další tři kontrolní skupiny po 10 včelách pro rozpouštědlo a smáčedlo.
XVII.1.6.2 Referenční látka
V rámci zkušebních skupin musí být použita referenční látka. Vyberou se alespoň tři dávky pokrývající očekávanou hodnotu LD
50
. Pro každou zkušební dávku se nasadí alespoň tři paralelní klícky po 10 včelách. Upřednostňovanou referenční látkou je dimethoát, pro nějž se uvádí LD
50
, 24 h, kontaktně v rozmezí 0,10 – 0,30 µg účinné látky na včelu (2). Jsou však přijatelné i jiné referenční látky, pokud lze předložit dostatek údajů pro ověření očekávané reakce na dávku (např. parathion).
XVII.1.6.3 Expozice
XVII.1.6.3.1 Podávání dávek
U narkotizovaných včel se jednotlivě provede lokální aplikace. Včely se náhodně rozdělí do různých zkušebních a kontrolních skupin. Objem 1 µl roztoku obsahující zkušební látku ve vhodné koncentraci se aplikuje mikroaplikátorem na zádovou oblast hrudníku každé včely. Mohou být použity i jiné objemy, je­li to opodstatněné. Po aplikaci se včely umístí do zkušebních klícek a zásobí se cukerným roztokem.
XVII.1.6.3.2 Délka expozice
Zkouška má trvat nejlépe 48 h. Jestliže mortalita v průběhu 24 a 48 h roste, je vhodné zkoušku prodloužit na maximálně 96 h, pokud kontrolní mortalita nepřekračuje 10 %.
XVII.1.6.4 Pozorování
Mortalita se zaznamená po 4 h od aplikace a poté po 24 h a 48 h. Je­li nezbytné pozorování prodloužit, provedou se další vyhodnocení v 24hodinových intervalech až do maximálně 96 h, pokud mortalita v kontrolních skupinách nepřekračuje 10 %.
Zaznamená se neobvyklé chování pozorované během doby zkoušky.
XVII.1.6.5 Limitní zkouška
V některých případech (např. očekává­li se u látky nízká toxicita) může být provedena limitní zkouška za použití 100 µg účinné látky na včelu s cílem prokázat, že LD
50
je vyšší než tato hodnota. Postupuje se stejným způsobem, včetně nasazení tří paralelních zkušebních skupin pro každou zkušební dávku, odpovídajících kontrolních skupin a použití referenční látky. Dojde­li k úhynům, musí se provést úplná studie. Jsou-li pozorovány subletální účinky (viz bod 1.6.4), zaznamenají se.
XVII.2. DATA A ZPRÁVY
XVII.2.1 DATA
Data se shrnou do tabulky, přičemž se pro každou zkušební skupinu, kontrolní skupiny a skupiny s referenční látkou uvede počet použitých včel, mortalita v každém pozorovacím čase a počet včel s nepříznivě ovlivněným chováním. Údaje o mortalitě se analyzují vhodnými statistickými metodami (např. probitovou analýzou, klouzavým průměrem, proložením binomického rozdělení) (3, 4). Sestrojí se křivky závislosti dávka­reakce pro každý čas pozorování (tj. 24 h, 48 h a podle potřeby 72 h, 96 h) a vypočtou se směrnice křivek a střední letální dávky (LD
50
) s 95% intervalem spolehlivosti. Korekce na mortalitu v kontrolních skupinách lze provést Abbottovou korekcí (4, 5). LD
50
se vyjádří v µg zkušební látky na včelu.
XVII.2.2 PROTOKOL O ZKOUŠCE
Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:
XVII.2.2.1 Zkoušená látka
— fyzikální stav a fyzikálně­chemické vlastnosti (např. stálost ve vodě, tlak par),
— údaje o chemické identitě včetně strukturního vzorce, čistota, (tj. u pesticidů identita a koncentrace účinné látky (účinných látek)).
XVII.2.2.2 Testovací druh
— vědecký název, plemeno, přibližné stáří (v týdnech), metoda výběru shromáždění včel, datum výběru,
— informace o včelstvech použitých pro shromáždění testovacích včel, včetně informací o zdravotním stavu, nemocech dospělců, o případné přípravě atd.
XVII.2.2.3 Zkušební podmínky
— teplota a relativní vlhkost v experimentální místnosti,
— podmínky chovu včetně typu, velikosti a materiálu klícek,
— metody aplikace zkoušené látky, např. použité nosné rozpouštědlo, aplikovaný objem zkušebního roztoku, použité anestetikum,
— uspořádání zkoušky, např. použité zkušební dávky a jejich počet, počet kontrolních skupin, pro každou dávku a kontrolu počet paralelních klícek a počet včel na klícku,
— datum zkoušky.
XVII.2.2.4 Výsledky
— výsledky předběžné orientační zkoušky, byla­li provedena,
— primární data: data: mortalita pro každou zkoušenou dávku v každém čase pozorování,
— graf křivek závislosti dávka­odezva na konci zkoušky;
— hodnoty LD
50
s 95% intervaly spolehlivosti pro každý doporučený čas pozorování, a to pro zkoušenou látku a referenční látku,
— statistické metody použité pro stanovení LD
50
,
— mortalita v kontrolních skupinách,
— jiné pozorované nebo změřené biologické účinky a jakékoli neobvyklé reakce včel,
— jakákoli odchylka od zde popsaného zkušebního postupu metody a jiné důležité informace.
XVII.3 LITERATURA
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision- Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.1, str. 151 – 165. March 1993.
(2) Gough, H. J., McIndoe, E. C., Lewis, G. B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.), 1981 – 1992. J. Apicultur. Research 22, str. 119 – 125.
(3) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J. Pharmacol. Exper. Ther., 96, str. 99 – 113.
(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York.
(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. J. Econ. Entomol. 18, str. 265 – 267.
XVIII. METODA PRO STANOVENÍ ADSORPCE / DESORPCE V ROVNOVÁŽNÉM STAVU – metoda C.18 podle přílohy směrnice 2001/59/ES
XVIII.1. METODA
Tato metoda je replikou metody OECD TG 106 pro stanovení půdní adsorpce/desorpce násadovou rovnovážnou metodou (Batch Equilibrium Method) (2000).
XVIII.1.1 ÚVOD
Tato metoda se opírá o okružní testy a seminář o výběru půd pro vývoj zkoušky adsorpce (1, 2, 3, 4) a rovněž o existující národní metodiky (5, 6, 7, 8, 9, 10, 11).
Studie adsorpce/desorpce jsou užitečné pro získávání důležitých informací o mobilitě a distribuci chemických látek v půdních, vodních a vzdušných složkách biosféry (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21). Informace lze použít k předpovědi nebo např. odhadu dostupnosti chemické látky pro rozklad, (22, 23), transformace a příjmu organismy (24), vymývání půdním profilem, (16, 18, 19, 21, 25, 26, 27, 28); těkání z půdy (21, 29, 30); odtoku z půdního povrchu do vod (18, 31, 32). Data o adsorpci mohou být použita pro účely porovnání a modelování (19, 33, 34, 35).
Rozdělení chemické látky mezi půdu a vodní fázi je složitý proces, který závisí na řadě různých faktorů: na chemické povaze látky (12, 36, 37, 38, 39, 40), na charakteristikách půdy (4, 12, 13, 14, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49) a na klimatických faktorech, jako jsou srážky, teplota, sluneční svit a vítr. Početné fenomény a mechanismy účastnící se adsorpce chemické látky v půdě tedy nelze v celém rozsahu definovat zjednodušeným laboratorním modelem, na jakém je založena tato metoda. Přestože nelze tímto pokusem podchytit všechny možné případy z životního prostředí, poskytuje cenné informace o významnosti adsorpce chemické látky z hlediska životního prostředí. Viz také obecný úvod.
XVIII.1.2 POUŽITÍ
Tato metoda je zaměřena na odhad adsorpčního/desorpčního chování látky v půdách. Cílem je získat sorpční charakteristiky, které lze použít pro předpověď rozdělení za nejrůznějších podmínek v životním prostředí; k tomuto účelu se pro chemickou látku stanovují rovnovážné adsorpční koeficienty v různých půdách jako funkce půdních charakteristik (např. obsahu organického uhlíku, obsahu jílu, půdní textury a pH). Pro co nejširšího podchycení interakcí dané látky s půdami vyskytujícími se v přírodě musí být použity při zkoušce různé druhy půd.
V této metodě vyjadřuje adsorpce proces vázání chemické látky na půdní povrch; nerozlišuje se mezi různými adsorpčními procesy (fyzikální a chemickou adsorpcí) a procesy, jako jsou povrchově katalyzovaný rozklad, adsorpce velkých množství nebo chemická reakce. Adsorpce na koloidních částicích (průměr < 0,2 µm) vznikajících v půdě se nebere v úvahu.
Půdními parametry, které jsou považovány za nejdůležitější, jsou: obsah organického uhlíku (3, 4, 12, 13, 14, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48), obsah jílu a půdní textura (3, 4, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48) a pro disociující sloučeniny také pH (3, 4, 42). Dalšími půdními parametry, které mohou mít vliv na adsorpci/desorpci určité látky jsou efektivní kationtová výměnná kapacita (ECEC), obsah amorfních oxidů železa a hliníku, zejména u vulkanických a tropických půd (4) a rovněž měrný povrch (49).
Zkouška je navržena pro posouzení adsorpce chemické látky na různých druzích půd s různým obsahem organického uhlíku, jílu, různou půdní texturou a různým pH. Je trojstupňová:
Stupeň 1: Předběžná zkouška za účelem stanovení:
— poměru půda/roztok,
— rovnovážného adsorpčního času a množství zkoušené látky adsorbovaného v rovnováze,
— adsorpce zkoušené látky na stěnách zkušební nádoby a stálosti zkoušené látky v průběhu zkoušky.
Stupeň 2: Screeningová zkouška: studie adsorpční kinetiky a stanovení distribučních koeficientů Kd a K
ou
pro pět druhů půd a jednu koncentraci.
Stupeň 3: Stanovení Freundlichových isotherm za účelem zjištění vlivu koncentrace na velikost adsorpce na půdách.
Studie desorpce prostřednictvím desorpční kinetiky/ Freundlichových desorpčních isotherm (dodatek 1).
XVIII.1.3 DEFINICE A JEDNOTKY
Symbol           Definice                                                                 Jednotky

A
ti
procento adsorpce v čase t
i
% A
eq
procento adsorpce v adsorpční rovnováze % m
p
ads
(t
i
) množství zkoušené látky adsorbované na půdě v čase ti µg m
p
ads
(delta t
i
) množství zkoušené látky adsorbované na půdě za časový interval µg m
p
ads
(eq) množství zkoušené látky adsorbované na půdě v adsorpční rovnováze µg m
0
množství zkoušené látky ve zkušební nádobě na začátku adsorpční zkoušky µg m
p
ads
(t
i
) množství zkoušené látky naměřené v podílu () v okamžiku ti µg m
v
ads
(eq) množství zkoušené látky v roztoku v adsorpční rovnováze µg m
půda
množství půdní fáze vyjádřené v suché hmotnosti půdy g c
zás.
hmotnostní koncentrace zásobního roztoku látky µg*cm
-3
C
0
počáteční hmotnostní koncentrace zkušebního roztoku v kontaktu s půdou µg*cm
-3
C
vod
ads
(t
i
) hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi v čase ti, kdy je prováděna µg*cm
-3
analýza C
p
ads
(t
i
) množství látky adsorbované na půdě v adsorpční rovnováze µg*cm
-3
C
vod
ads
(eq) hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi v adsorpční rovnováze µg*cm
-3
V
0
počáteční objem vodné fáze v kontaktu s půdou během adsorpční zkoušky cm
3
v
a
A
objem podílu, ve kterém je látka stanovována cm
3
K
d
distribuční koeficient pro adsorpci cm
3
*g
-1
K
ou
adsorpční koeficient normalizovaný na organický uhlík cm
3
*g
-1
K
om
distribuční koeficient normalizovaný na obsah organického materiálu cm
3
*g
-1
K
F
ads
Freundlichův adsorpční koeficient µg1
-1
/n (cm
3
)1/n*g
-1
Freundlichův exponent D
ti
procento desorpce v čase t
i
% Ddelta
ti
procento desorpce za časový interval % K
des
zdánlivý desorpční koeficient cm
3
*g
-1
K
F
des
Freundlichův desorpční koeficient µg1-1/n (cm
3
)1/n*g
-1
m
vod
des
(t
i
) množství zkoušené látky desorbované z půdy v čase ti µg m
vod
des
(deltat
i
) množství zkoušené látky desorbované z půdy za časový interval µg m
vod
des
(eq) analyticky stanovené množství látky ve vodné fázi v desorpční rovnováze µg m
p
des
(deltat
i
) celkové množství zkoušené látky desorbované v desorpční rovnováze µg m
p
des
(deltat
i
) množství látky, která zůstává adsorbovaná na půdě po uplynutí časového µg intervalu delta t m
vod
A
množství látky, které zbylo (aniž se adsorbovalo) po ustavení adsorpční µg rovnováhy, a to v důsledku nekvantitativní výměny objemu vodné fáze C
p
des
(eq) množství zkoušené látky, které zůstalo adsorbované na půdě v desorpční µg*g
-1
rovnováze C
vod
des
(eq) hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi v desorpční rovnováze µg*cm
-3
V
T
celkový objem vodné fáze v kontaktu s půdou během experimentu pro cm
3
studium desorpční kinetiky provedeného sériovou metodou V
R
objem supernatantu odebraného ze zkušební nádoby po dosažení adsorpční cm
3
rovnováhy a nahrazeného stejným objemem 0,01M roztoku CaCl
2
v
a
P
objem podílu odebraného k analýze od okamžiku ti během experimentu pro cm
3
studium desorpční kinetiky provedeného sériovou metodou V
r
i
objem roztoku odebraného ze zkušební nádoby (i) ke stanovení zkoušené cm
3
látky v experimentu pro studium desorpční kinetiky (paralelní metoda) V
r
f
objem roztoku odebraného ze zkušební nádoby ke stanovení zkoušené látky cm
3
v desorpční rovnováze množstevní bilance % m
E
celkové množství zkoušené látky extrahované z půdy a ze stěn zkušební µg nádoby ve dvou krocích V
rec
objem supernatantu získaný po dosažení adsorpční rovnováhy cm
3
P
ov
rozdělovací koeficient oktanol/voda pK
a
disociační konstanta S
v
rozpustnost ve vodě g*l
-1
XVIII.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Známé objemy roztoků zkoušené látky o známé koncentraci, značené nebo neznačené radionuklidy, se v 0,01M CaCl
2
přidají k půdním vzorkům o známé sušině, které byly předběžně uvedeny do rovnováhy s 0,01M CaCl
2
. Směs se přiměřenou dobu protřepává. Půdní suspenze se poté oddělí centrifugací a podle požadavků zfiltruje a vodná fáze se analyzuje. Množství zkoušené látky adsorbované na půdním vzorku se vypočte z rozdílu mezi počátečním množstvím zkoušené látky v roztoku a množstvím, které v něm zbylo na konci experimentu (nepřímá metoda).
Alternativně lze adsorbované množství zkoušené látky stanovit také přímo analýzou půdy (přímá metoda). Tato metoda, která zahrnuje postupnou extrakci vhodným rozpouštědlem se doporučuje v případech, kdy nelze přesně stanovit rozdíl koncentrací látky v roztocích. Jde například o tyto případy: adsorpce zkoušené látky na stěnách zkušebních nádob, nestálost zkoušené látky v poměru k délce experimentu, nízká adsorpce s malou změnou koncentrace v roztoku a vysoká adsorpce, jejímž důsledkem je nízká koncentrace, kterou nelze přesně stanovit. Použije­li se látka značená radioizotopy, lze extrakci půdy obejít analýzou půdní fáze spočívající v jejím spálení a v měření kapalinovou scintilační spektrometrií. Měření kapalinovou scintilační spektrometrií je nespecifickou technikou, která nerozlišuje mezi mateřskými a transformačními produkty; měla by tedy být použita pouze tehdy, je­li zkoušené chemická látka po celou dobu studie stálá.
XVIII.1.5 INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE
Chemikálie musí být analytické čistoty. Doporučuje se použití radioizotopově neznačených zkoušených látek se známým složením a alespoň 95% čistotou, nebo zkoušených látek značených radioizotopy, které mají známé složení a jsou radioizotopově čisté. U stopovačů s krátkým poločasem rozpadu musí být provedena korekce na rozpad.
Před prováděním zkoušek adsorpce­desorpce by měly být o zkoušené látce známy tyto informace:
a) rozpustnost ve vodě (A.6);
b) tlak par (A.4) a/nebo Henryho konstanta;
c) abiotický rozklad: hydrolýza jako funkce pH (C.7);
d) rozdělovací koeficient (A.8);
e) snadná rozložitelnost (C.4) nebo aerobní a anaerobní transformace v půdě;
f) pKa disociovatelných látek;
g) přímá fotolýza ve vodě (tj. UV­Vis absorpční spektrum ve vodě, kvantový výtěžek) a fotodegradace v půdě.
XVIII.1.6 POUŽITELNOST ZKOUŠKY
Zkouška je použitelná u látek, pro něž existuje analytická metoda s dostatečnou správností. Důležitým parametrem, který může ovlivnit spolehlivost výsledku, zejména při nepřímé metodě, je stálost zkoušené látky po celou dobu zkoušky. Je tedy nezbytné ověřit stabilitu v předběžné studii; je-li v průběhu zkoušky pozorována transformace látky, doporučuje se, aby byla v hlavní studii provedena analýza jak půdní, tak vodné fáze.
Obtíže mohou nastat při provádění této zkoušky u látek s nízkou rozpustností ve vodě (Sv < 10-4 g*l
-1
) a rovněž u silně nabitých látek v důsledku toho, že koncentraci ve vodné fázi nelze změřit s dostatečnou správností. V těchto případech musí být podniknuty další kroky. Doporučení pro řešení těchto problémů je uvedeno v příslušných částech této metody.
Při zkoušení těkavých látek je třeba dbát na to, aby nedošlo v průběhu studie ke ztrátám.
XVIII.1.7 POPIS METODY
XVIII.1.7.1 Přístroje, pomůcky a reakční činidla
Standardní laboratorní vybavení, zejména:
a) Zkumavky nebo nádoby pro provedení experimentů. Je důležité, aby tyto zkumavky nebo nádoby
— patřily k centrifuze, aby se minimalizovaly nepřesnosti v důsledku manipulace a přenášení,
— byly z inertního materiálu, který minimalizuje adsorpci zkoušené látky na jejich stěnách.
b) Mísicí zařízení: překlápěcí mísič nebo rovnocenné zařízení; mísič musí v průběhu mísení udržovat půdu v suspenzi.
c) Centrifuga: nejlépe vysokootáčková, např. s odstředivým zrychlením > 3 000 g, s nastavením teploty, schopná odstředit z vodného roztoku částice o průměru větším než 0,2 µm. Kyvety by měly být během třepání a centrifugace opatřeny víčky, aby nedošlo ke ztrátám těkavých látek a vody; aby se minimalizovala adsorpce na víčkách, použijí se víčka z neadsorbujících materiálů, např. víčka se závitem potažená teflonem.
d) Volitelné: filtrační zařízení; filtry o velikosti pórů 0,2 µm, sterilní, na jedno použití. Zvláštní pozornost by měla být věnována volbě filtračního materiálu, aby na něm nedošlo k žádným ztrátám zkoušené látky; u špatně rozpustných zkoušených látek se organický filtrační materiál nedoporučuje.
e) Analytické přístroje vhodné pro měření koncentrace zkoušené látky.
f) Laboratorní sušárna umožňující udržovat teplotu od 103 st.C do 110 st.C.
XVIII.1.7.2 Charakterizace a výběr půd
Půdy by měly být charakterizovány třemi parametry, které jsou považovány za nejdůležitější pro adsorpční kapacitu: obsahem organického uhlíku, obsahem jílu a půdní texturou a hodnotou pH. Jak již bylo uvedeno, (viz oddíl Použití), mohou mít vliv na další adsorpci/desorpci určité látky fyzikálně­chemické charakteristiky půdy a měly by být v takových případech zohledněny.
Metody použité pro charakterizaci půdy jsou velmi důležité a mohou významně ovlivnit výsledky. Doporučuje se tedy, aby bylo podle odpovídající metody ISO (ISO­10390­1) pH měřeno v 0,01M CaCl
2
(jde o roztok použitý při zkoušení adsorpce/desorpce). Doporučuje se rovněž, aby byly ostatní důležité půdní charakteristiky stanoveny standardními metodami (např. ISO „Handbook of Soil Analysis“); to umožní, aby byla analýza sorpčních dat založena na mezinárodně standardizovaných půdních parametrech. Některé existující standardní metody analýzy a charakterizace půdy jsou uvedeny v literatuře (50 – 52). Ke kalibraci metod zkoušení půd se doporučují referenční půdy.
Návod pro výběr půd pro adsorpční/desorpční experimenty je uveden v tabulce 1. Sedm vybraných druhů půd pokrývá půdní druhy vyskytující se v mírném zeměpisném pásmu. V případě disociovatelných zkoušených látek by měly vybrané půdy pokrývat širokých rozsah pH, aby bylo možné hodnotit adsorpci látky v její disociované a nedisociované formě. Návod k volbě počtu různých půd, které mají být použity v jednotlivých stádiích zkoušky, je uveden v bodě 1.9. Provedení zkoušky.
Upřednostňují­li se jiné druhy půd, měly by být charakterizovány stejnými parametry a jejich charakteristiky by se měly pohybovat ve stejném rozpětí jako v tabulce 1, třebaže kritériím neodpovídají přesně.
Tabulka 1: Návod pro výběr půdních vzorků pro adsorpci/desorpci
------------------------------------------------------------------ ------------------------------------
     Druh půdy      Rozsah pH (v 0,01M   Obsah organického uhlíku    Obsah jílu        Textura půdy1
                          CaCl
2
) (%) (%) ------------------------------------------------------------------ ------------------------------------ 1 4,5 - 5,5 1,0 - 2,0 65 - 80 jíl 2 > 7,5 3,5 - 5,0 20 - 40 jílovitohlinitá 3 5,5 - 7,0 1,5 - 3,0 15 - 25 prachovitohlinitá 4 4,0 - 5,5 3,0 - 4,0 15 - 30 hlinitá 5 < 4,0 - 6,0 2 < 0,5 - 1,5 2, 3 < 10 - 15 2 hlinitopísčitá 6 > 7,0 < 0,5 - 1,0 2, 3 40 - 65 jílovitohlinitá/jíl 7 < 4,5 > 10 < 10 písek/hlinitopísčitá ------------------------------------------------------------------ ------------------------------------ 1 Podle FAO a severoamerického systému (85). 2 Hodnoty jednotlivých parametrů by měly pokud možno ležet v uvedeném rozsahu. Vyskytnou­li se obtíže při hledání vhodného půdního materiálu, jsou přijatelné hodnoty ležící pod uvedeným minimem. 3 U půd s obsahem organického uhlíku nižším než 0,3 % může být porušena korelace mezi obsahem organického uhlíku a adsorpcí. Doporučují se tedy půdy s minimálním obsahem organického uhlíku 0,3 %.
XVIII.1.7.3 Sběr a uchovávání půdních vzorků
XVIII.1.7.3.1 Sběr
Není doporučena žádná specifická technika odběru vzorků; technika odběru závisí na účelu studie (53, 54, 55, 56, 57, 58).
Je třeba zohlednit:
a) nezbytné jsou informace o historii lokality; zahrnují informace o lokalitě, vegetaci, použití pesticidů nebo hnojiv, o biologických vnosech nebo náhodné kontaminaci. Pokud jde o popis místa odběru, měla by být dodržena doporučení normy ISO o vzorkování půd (ISO 10381-6);
b) místo odběru musí být definováno souřadnicemi UTM (Universal Transversal Mercator- Projection/European Horizontal Datum) nebo zeměpisnými souřadnicemi; to by mohlo umožnit opakovaný odběr dané půdy v budoucnu nebo usnadnit definování půdy podle různých klasifikačních systémů používaných v různých zemích. Kromě toho by měla být vzorkován pouze horizont A do maximální hloubky 20 cm. Zvláště je­li u půdního druhu č. 7 součástí půdy horizont 0
h
, měl by být zahrnut do vzorkování.
Půdní vzorky by měly být přepravovány v kontejnerech a za teploty, jež zaručí, že nedojde k výrazné změně původních charakteristik půdy.
XVIII.1.7.3.2 Uchovávání
Přednost se dává se použití čerstvě odebraných půd. Pouze není­li to možné, mohou být půdy uchovávány při teplotě okolí, případně vysušené na vzduchu. Pro dobu uchovávání neexistuje žádný doporučený limit, ale půdy uchovávané déle než tři roky by měly být před použitím analyzovány na obsah organického uhlíku, pH a CEC (kationtovou výměnnou kapacitu).
XVIII.1.7.3.3 Zpracování půdních vzorků a jejich příprava ke zkoušce
Půdy se vysuší na vzduchu při teplotě okolí (nejlépe při 20 – 25 st.C). Rozrušení půd se provede minimální silou, aby se původní textura půdy změnila co nejméně. Půdy se prosejí na sítu =< 2 mm; při prosévání by měla být dodržována doporučení normy ISO (ISO 10381-6). Doporučuje se opatrná homogenizace, neboť zlepšuje reprodukovatelnost výsledků. Vlhkost každé půdy se stanoví na třech dílčích vzorcích zahříváním na 105 st.C, dokud se významně mění hmotnost (přibližně 12 h). Ve všech výpočtech je hmotností půdy hmotnost po sušení (sušina), tj. hmotnost půdy korigovaná na obsah vlhkosti.
XVIII.1.7.4 Příprava zkoušené látky pro aplikaci na půdu
Zkoušená látka se rozpustí v 0,01M roztoku CaCl
2
v destilované nebo deionisované vodě; roztok CaCl
2
se použije jako vodná rozpouštědlová fáze ke zlepšení centrifugace a minimalizaci kationtové výměny. Koncentrace zásobního roztoku by měla být nejlépe o tři řády vyšší než mez stanovitelnosti použité analytické metody. Tento práh zabezpečuje přesnost měření s ohledem na metodiku, jež je základem tohoto postupu; kromě toho by měla být koncentrace zásobního roztoku pod rozpustností zkoušené látky ve vodě.
Zásobní roztok se připravuje nejlépe těsně před aplikací na půdní vzorky a uchovává se uzavřený v temnu při 4 st.C. Skladovatelnost závisí na stálosti zkoušené látky a na její koncentraci v roztoku.
Pouze u špatně rozpustných látek (Sv < 10-4 g*l
-1
) může být nezbytné použít solubilizační činidlo, je­li obtížné zkoušenou látku rozpustit. Solubilizační činidlo: a) by mělo být mísitelné s vodou, např. methanol nebo acetonitril, b) jeho koncentrace by neměla překročit 1 % celkového objemu zásobního roztoku a ještě méně by ho mělo být v roztoku přicházejícím do kontaktu s půdou (nejlépe v koncentraci nižší než 0,1 %), a c) nemělo by být surfaktantem nebo by nemělo podléhat solvolytickým reakcím se zkoušenou chemickou látkou. Použití solubilizačního činidla by mělo být uvedeno a odůvodněno v přehledu dat. Jinou možností u špatně rozpustných látek je jejich přimíchání do systému (spiking): zkoušená látka se rozpustí v organickém rozpouštědle a alikvot se přidá do směsi půdy a 0,01M roztoku CaCl
2
v destilované nebo deionisované vodě. Obsah organického rozpouštědla ve vodné fázi by měl být co nejnižší a obvykle by neměl překročit 0,1 %. Nedostatkem přimíchání v organickém rozpouštědle je nereprodukovatelnost objemu. To může znamenat zanesení další nepřesnosti, neboť koncentrace zkoušené látky a spolurozpouštědla nebývají ve všech zkouškách tytéž.
XVIII.1.8 PŘEDPOKLADY PRO PROVEDENÍ ZKOUŠKY ADSORPCE/DESORPCE
XVIII.1.8.1 Analytická metoda
Klíčovými parametry, které mohou mít vliv na správnost měření sorpce, jsou správnost metody analýzy jak roztoku, tak adsorbované fáze, stálost a čistota zkoušené látky, dosažení sorpční rovnováhy, velikost změny koncentrace v roztoku, poměr půda/roztok a změny v půdní struktuře během ustavování rovnováhy (35, 59 – 62). Některé příklady týkající se problematiky správnosti jsou uvedeny v dodatku 2.
Spolehlivost použité analytické metody musí být ověřována při koncentracích, které se mohou vyskytnout v průběhu zkoušky. Je na experimentátorovi, aby vyvinul vhodnou metodu s náležitou správností, přesností, reprodukovatelností, mezí stanovitelnosti a výtěžkem. Návodem k provedení takové zkoušky je níže uvedený experiment.
Vhodný objem 0,01M CaCl
2
, např. 100 cm
3
, se protřepává 4 h s např. 20 g půdy o vysoké adsorpční schopnosti, tj. s vysokým obsahem organického uhlíku a jílu; tato hmotnost a objem se mohou měnit podle požadavků analýzy, avšak poměr půda/roztok 1:5 je vhodnou výchozí hodnotou. Směs se odstředí a vodnou fázi lze zfiltrovat. K vodné fázi se přidá určitý objem zásobního roztoku zkoušené látky, aby bylo dosaženo nominální hodnoty v koncentračním rozsahu, který se může vyskytnou v průběhu zkoušky. Tento objem by neměl překročit 10 % konečného objemu vodné fáze, aby byl charakter roztoku před ustavením rovnováhy změněn co nejméně. Roztok se analyzuje.
Založí se jeden slepý pokus s půdou a roztokem CaCl
2
(bez zkoušené látky) s cílem odhalit náhodné chyby analytické metody a matricové jevy způsobené půdou.
Mezi analytické metody, které mohou být použity v sorpčních měřeních, patří plynová chromatografie s kapalnou stacionární fází, (GLC), vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC), spektrometrie (např. GC/hmotnostní spektrometrie, HPLC/hmotnostní spektrometrie) a kapalinová scintilační spektrometrie (pro látky značené radioizotopy). Bez ohledu na použitou analytickou metodu se za přiměřené považují výtěžky od 90 % do 110 % nominální hodnoty. Má­li být možné provést stanovení a zhodnocení poté, co dojde k rozdělení, musí být meze stanovitelnosti analytické metody alespoň o dva řády nižší než nominální koncentrace.
Charakteristiky a meze stanovitelnosti analytické metody použitelné pro provedení studií adsorpce hrají významnou roli při definování zkušebních podmínek a při celém experimentálním provedení zkoušky. Tato metoda sleduje obecný experimentální postup a obsahuje doporučení a pokyny pro alternativní řešení, jsou­li analytická metoda a laboratorní vybavení omezeny.
XVIII.1.8.2 Výběr optimálních poměrů půda/roztok
Výběr vhodných poměrů půda/roztok pro sorpční studie závisí na distribučním koeficientu Kd a na požadovaném relativním stupni adsorpce. Změna koncentrace látky v roztoku je určující pro statistickou správnost měření v důsledku formy adsorpční rovnice a omezení analytické metodiky při stanovování koncentrace chemické látky v roztoku. V obecné praxi je tedy užitečné určit několik pevných poměrů, pro něž je adsorbovaný podíl vyšší než 20 %, nejlépe > 50 % (62), a dbát na to, aby byla koncentrace zkoušené látky ve vodné fázi dostatečně vysoká pro její správné změření. To je zvláště důležité u vysokých adsorbovaných podílů.
Vyhovující přístup k výběru vhodných poměrů půda/voda je založen na odhadu hodnoty Kd buď předběžnými studiemi, nebo zavedenými metodami odhadu (dodatek 3). Vhodný poměr lze poté vybrat na základě grafického provedení závislosti poměru půda/roztok na Kd pro daný adsorbovaný podíl (obrázek 1). V tomto grafickém vyjádření se předpokládá, že je adsorpční rovnice lineární1. Použitelný poměr se získá upravením rovnice pro Kd (4) do tvaru rovnice (1):
            
   V
0
m
0
------ = (----------- - 1) K
d
(1) m
půda
m
p
ads
(eq) nebo do její logaritmické formy při předpokladu


(2)


Distribuční koeficient K
d
(cm
3
*g
-1
) Obrázek 1. Vztah mezi poměry půda/roztok a hodnotou Kd při různých adsorbovaných podílech zkoušené látky
Na obrázku 1 jsou uvedeny požadované poměry půda/roztok jako funkce Kd pro různé úrovně adsorpce. Například při poměru půda/roztok 1:5 a při Kd rovno 20 by došlo přibližně k 80% adsorpci. Má­li dojít při téže hodnotě Kd k 50% adsorpci, musí být použit poměr 1:25. Tento přístup k výběru vhodných poměrů půda/roztok umožňuje výzkumníkovi pružně vyhovět experimentálním potřebám.
Obtíže nastávají v oblastech, kdy se chemická látka adsorbuje silně nebo velmi slabě. Je­li adsorpce nízká, doporučuje se poměr půda/roztok 1:1, třebaže u některých vysloveně organických druhů půdy může být k získání suspenze nezbytný nižší poměr. Analytická metodika měření malých změn koncentrace roztoku musí být pečlivá; v opačném případě bude měření nepřesné. Na druhé straně se může při velmi vysokých distribučních koeficientech Kd dospět až k poměru půda/roztok 1:100, má­li v roztoku zůstat významné množství chemické látky. Je však třeba dbát na dobré promíchání a musí být ponechána dostatečná doba k tomu, aby systém dosáhl rovnováhy. Jiným přístupem je v těchto extrémních případech, kdy chybí vhodná metodika, odhadnutí hodnoty Kd metodou založenou například na hodnotách Pov (dodatek 3). Může být užitečný zvláště u slabě adsorbovaných polárních chemických látek s Pov < 20 a u lipofilních/silně adsorbovaných chemických látek s Pov > 104.
XVIII.1.9 PROVEDENÍ ZKOUŠKY
XVIII.1.9.1 Zkušební podmínky
Všechny experimenty se provádějí při teplotě okolí a pokud možno při konstantní teplotě od 20 st.C do 25 st.C.
Parametry odstřeďování by měly umožnit odstranit z roztoku částice větší než 0,2 µm. Tuto velikost mají nejmenší částice považované za pevné částice a je hranicí mezi pevnými a koloidními částicemi. Návod ke stanovení parametrů odstřeďování je uveden v dodatku 4.
Nezaručuje­li centrifuga, že budou částice větší než 0,2 µm odstraněny, mohla by být použita kombinace odstřeďování a filtrace přes 0,2µm filtry. Tyto filtry musí být z vhodného inertního materiálu, aby na nich nedošlo k žádným ztrátám zkoušené látky. V každém případě by mělo být ověřeno, že při filtraci nedochází k žádným ztrátám zkoušené látky.
XVIII.1.9.2 Stupeň 1 – předběžná studie
Účel provedení předběžné studie byl již uveden v oddíle Použití. Návodem pro založení takové studie je níže navržený experiment.
XVIII.1.9.2.1 Výběr optimálních poměrů půda/roztok
Použijí se dva půdní druhy a tři poměry půda/roztok (šest experimentů). Jeden půdní druh s vysokým obsahem organického uhlíku a nízkým obsahem jílu a druhý půdní druh s nízkým obsahem organického uhlíku a vysokým obsahem jílu. Jsou navrženy následující poměry půda/roztok:
— 50 g půdy a 50 cm
3
vodného roztoku zkoušené látky (poměr 1/1),
— 10 g půdy a 50 cm
3
vodného roztoku zkoušené látky (poměr 1/5),
— 2 g půdy a 50 cm
3
vodného roztoku zkoušené látky (poměr 1/25).
Minimální množství půdy, se kterým lze experiment provést, závisí na laboratorním vybavení a na účinnostních charakteristikách použitých analytických metod. Doporučuje se však použít alespoň 1 g, a nejlépe 2 g, aby zkouška poskytla spolehlivé výsledky.
Jeden kontrolní vzorek obsahující pouze zkoušenou látku v 0,01M CaCl
2
(bez půdy) se podrobí naprosto stejným krokům jako zkušební systémy, s cílem ověřit stálost zkoušené látky v roztoku CaCl
2
a její možnou adsorpci na stěnách zkušební nádoby.
Stejnému zkušebnímu postupu se podrobí slepý vzorek s každou půdou a celkem 50 cm
3
0,01M roztoku CaCl
2
(bez zkoušené látky). Účelem je kontrola pozaďových hodnot během analýzy s cílem detekovat interferující látky nebo rozeznat kontaminované půdy.
Všechny experimenty včetně kontrolních a slepých vzorků se provedou alespoň dvojmo. Celkový počet vzorků, které by měly být pro studii připraveny, lze odvodit z metodiky, podle které bude postupováno.
Metody pro předběžnou studii a hlavní studii jsou zpravidla stejné, výjimky jsou podle potřeby uvedeny.
Vzorky vysušené na vzduchu se den před experimentem uvedou přes noc (12 h) do rovnováhy protřepáváním s 45 cm
3
0,01M CaCl
2
. Poté se určitým objemem zásobního roztoku zkoušené látky upraví konečný objem na 50 cm
3
. Tento objem přidaného zásobního roztoku: a) by neměl být vyšší než 10 % konečného objemu 50 cm
3
vodné fáze, aby byl charakter roztoku před ustavením rovnováhy změněn co nejméně; a b) měl by zajistit, že bude počáteční koncentrace zkoušené látky v kontaktu s půdou (C0) alespoň o dva řády vyšší než mez stanovitelnosti analytické metody; tento práh zabezpečuje možnost provést přesné měření i při vysoké adsorpci (> 90 %) a později stanovit adsorpční izotermy. Doporučuje se rovněž, aby počáteční koncentrace látky (C0) pokud možno nepřekračovala polovinu hodnoty rozpustnosti látky.
Příklad výpočtu koncentrace zásobního roztoku látky (Czás) je uveden níže. Předpokládá se mez stanovitelnosti 0,01 µg*cm
-3
a 90% adsorpce; počáteční koncentrace zkoušené látky v kontaktu s půdou by tedy měla být nejlépe 1 µg*cm
-3
(o dva řády vyšší, než je mez stanovitelnosti). Za předpokladu, že bude přidán maximální doporučený objem zásobního roztoku, tj. 5 cm
3
do 45 cm
3
0,01M roztoku CaCl
2
pro ustavení rovnováhy, (= 10% přídavek zásobního roztoku v celkovém objemu vodné fáze 50 cm
3
), by měla být koncentrace zásobního roztoku 10 µg*cm
-3
; je o tři řády vyšší než mez stanovitelnosti analytické metody.
Hodnota pH vodné fáze se měří před kontaktem s půdou a po něm, neboť hraje významnou roli v celém adsorpčním procesu, zvláště u disociujících látek.
Směs se protřepává, dokud se neustaví adsorpční rovnováha. Doba nezbytná k dosažení rovnováhy v půdě silně kolísá v závislosti na chemické látce a půdě; zpravidla stačí 24 h (77). V předběžné studii lze vzorky odebírat postupně v průběhu míchání po 48 h (například 4, 8, 24, 48 h). Čas analýzy by měl být volen pružně s ohledem na pracovní plán laboratoře.
Existují dvě možnosti, jak provádět analýzu zkoušené látky ve vodném roztoku: a) paralelní metoda a b) sériová metoda. Je třeba zdůraznit, že ačkoli je paralelní metoda experimentálně náročnější, je její matematické zpracování jednodušší (dodatek 5). Volba metodiky, podle které bude postupováno, se však ponechává na experimentátorovi, který bude muset zvážit dostupné laboratorní vybavení a prostředky.
a) Paralelní metoda: pro každý poměr půda/roztok se připraví tolik vzorků, kolik bude časů, v nichž se má provést vyšetření adsorpční kinetiky. Po centrifugaci a podle požadavku po filtraci se z první zkušební nádoby odebere pokud možno celá vodná fáze a měří se např. po 4 h; vodná fáze druhé zkušební nádoby se takto zpracuje a změří po 8 h, vodná fáze třetí zkušební nádoby se takto zpracuje a změří po 24 h atd.
b) Sériová metoda: pro každý poměr půda/roztok se připraví pouze dva vzorky. V definovaných časových intervalech se směs zcentrifuguje a fáze se oddělí. Malý podíl vodné fáze se ihned analyzuje na zkoušenou látku; v experimentu se poté pokračuje s původní směsí. Následuje­li po centrifugaci filtrace, měla by mít laboratoř zařízení pro filtraci malých podílů vodné fáze. Doporučuje se, aby celkový objem odebraného podílu nepřesahoval 1 % celkového objemu roztoku, aby se významně nezměnil poměr půda/roztok a aby se nesnížilo množství rozpuštěné látky dostupné během zkoušky pro adsorpci.
Procento adsorpce se pro každý čas (ti) vypočte z nominální počáteční koncentrace a naměřené koncentrace v odběrovém čase (ti) po korekci na hodnoty ze slepého pokusu. Sestrojí se křivky závislosti na čase (obrázek 1 v dodatku 5) za účelem odhadu míry dosažení rovnovážného plató2. Rovněž se vypočte hodnota Kd v rovnováze. Na základě této hodnoty Kd se z obrázku 1 vyberou vhodné poměry půda/roztok tak, aby adsorpce dosahovala více než 20 % a nejlépe více než 50 % (61). Všechny příslušné rovnice a zásady pro sestrojování křivek jsou uvedeny v oddíle Data a zprávy a v dodatku 5.
XVIII.1.9.2.2 Stanovení rovnovážného adsorpčního času a množství zkoušené látky adsorbovaného v rovnováze
Jak již bylo uvedeno, umožňuje křivka závislosti nebo na čase odhadnout dobu nezbytnou pro dosažení adsorpční rovnováhy a adsorbované množství zkušební látky v rovnováze. Příklady těchto křivek jsou na obrázcích 1 a 2 v dodatku 5. Rovnovážný čas je čas nezbytný k tomu, aby bylo v systému dosaženo plató.
Nevyskytuje­li se u určité půdy plató, ale nepřetržitý nárůst, může to být způsobeno komplikujícími faktory, jako jsou biologický rozklad a pomalá difuse. Biologický rozklad lze prokázat opakováním experimentu se sterilizovaným vzorkem půdy. Není­li ani v tomto případě dosaženo plató, měl by experimentátor pátrat po jiném jevu, ke kterému by mohlo při jeho studiích docházet; může tak učinit vhodnou změnou experimentálních podmínek (teploty, doby protřepávání, poměrů půda/roztok). Ponechává se na rozhodnutí experimentátora, zda bude pokračovat ve zkušebním postupu i přes případné nedosažení rovnováhy.
XVIII.1.9.2.3 Adsorpce na stěnách zkušební nádoby a stálost zkoušené látky
Některé informace o adsorpci zkoušené látky na stěnách zkušební nádoby a rovněž o stálosti zkoušené látky lze odvodit z analýzy kontrolních vzorků. Pozoruje­li se úbytek větší, než by odpovídalo obvyklé chybě analytické metody, může docházet k abiotickému rozkladu a/nebo adsorpci na stěnách zkušební nádoby. Tyto dva jevy lze rozlišit důkladným omytím stěn nádoby známým objemem vhodného rozpouštědla a analýzou výplachu na zkoušenou látku. Není­li zjištěna adsorpce na stěnách zkušební nádoby, je úbytek důkazem abiotické nestálosti zkoušené látky. Je­li zjištěna adsorpce, je nezbytné změnit materiál zkušebních nádob. Data o adsorpci na stěnách zkušebních nádob získaná v tomto experimentu však nelze přímo extrapolovat na experiment půda/roztok. Přítomnost půdy bude mít na tuto adsorpci vliv.
Další informace o stálosti zkoušené látky lze odvodit z množstevní bilance výchozí látky provedené po určitém čase. To znamená, že se na zkušenou látku analyzují vodná fáze, extrakty půdy a stěny zkušební nádoby. Rozdíl mezi množstvím přidané zkoušené látky a součtem množství zkoušené látky ve vodné fázi, v extraktech půdy a na stěnách zkušební nádoby je roven množství, které se rozložilo, vytěkalo a/nebo se neextrahovalo. Má-li být provedena množstevní bilance, mělo by být v době experimentu dosaženo adsorpční rovnováhy.
Množstevní bilance se provede u obou druhů půd a pro jeden poměr půda/roztok u každé půdy, u něhož je úbytek v rovnováze větší než 20 % a nejlépe větší něž 50 %. Je­li experiment pro nalezení poměru dokončen analýzou posledního vzorku po 48 hodinách, fáze se oddělí centrifugací a podle požadavků filtrací. Odebere se pokud možno veškerá vodná fáze a k půdě se přidá vhodné extrakční rozpouštědlo (extrakční koeficient alespoň 95 %) za účelem extrakce zkoušené látky. Doporučují se alespoň dvě extrakce za sebou. Stanoví se množství zkoušené látky v půdě a v extraktech ze zkušební nádoby a provede se množstevní bilance (rovnice 10, Data a zprávy). Je­li nižší než 90 %, považuje se zkoušená látka za nestálou v poměru k délce zkoušky. Studie však může pokračovat, přičemž se zohlední nestálost zkoušené látky; v takovém případě se doporučuje, aby byly v hlavní studii analyzovány obě fáze.
XVIII.1.9.3 Stupeň 2 – adsorpční kinetika při jedné koncentraci zkoušené látky
Použije se pět druhů půd vybraných z tabulky 1. Je výhodné zahrnout mezi těchto pět půd některé nebo všechny půdy z předběžné studie. V tomto případě nemusí být stupeň 2 opakován pro půdy použité v předběžné studii.
Rovnovážný čas, poměr půda/roztok, hmotnost půdního vzorku, objem vodné fáze v kontaktu s půdou a koncentrace zkoušené látky v roztoku se volí na základě výsledků předběžné studie. Analýzy se provádějí nejlépe po 2, 4, 6, 8 (podle možnosti také po 10) a 24 h kontaktu s půdou; protřepávání může být prodlouženo až na maximálně 48 h u chemických látek, u nichž je pro dosažení rovnováhy podle výsledků předběžných studií nezbytný delší čas. Časy, kdy má být provedena analýza, lze volit pružně.
Každý experiment (s jednou půdou a s jedním roztokem) se provede alespoň dvojmo, aby bylo možné odhadnout rozptyl výsledků. S každým experimentem se provede slepý pokus. Provede se s půdou a s 0,01M roztokem CaCl
2
bez zkoušené látky a se stejnou hmotností a objemem jako v experimentu. Stejnému zkušebnímu postupu se podrobí kontrolní vzorek zkoušené látky v 0,01M roztoku CaCl
2
(bez půdy), který slouží jako pojistka proti nečekaným výsledkům.
Procento absorpce se vypočte pro každý čas () a pro každý interval () (podle potřeby) a vynese se proti času. Rovněž se vypočtou distribuční koeficient Kd v rovnováze a adsorpční koeficient normalizovaný na obsah organického uhlíku Kou (pro nepolární organické chemické látky).
Výsledky zkoušky adsorpční kinetiky
Pro popis sorpčního chování v půdě je zpravidla dostatečně přesný lineární model Kd (35, 78), který je výrazem vlastní mobility chemických látek v půdě. Například chemické látky s Kd 1 cm
3
*g
-1
jsou v zásadě považovány za zcela mobilní. Podobně byla MacCallem et al (16) vyvinuto klasifikační schéma mobility založené na hodnotách Kou. Kromě toho existuje klasifikační schéma vymývatelnosti založené na vztahu mezi Kou a DT-50 (1, 32, 79).
Podle studií statistických chyb (61) nelze z poklesu koncentrace ve vodné fázi přesně odhadnout hodnoty Kd nižší než 0,3 cm
3
*g
-1
, a to ani při nejpříznivějším (z hlediska správnosti) poměru půda/roztok, tj. při poměru 1:1. V takovém případě se doporučuje analýza obou fází – půdy i roztoku.
S ohledem na výše uvedené poznámky se doporučuje pokračovat ve studii adsorpčního chování chemické látky v půdě a její případné mobility stanovením Freundlichových adsorpčních isotherm pro ty systémy, u nichž je přesné stanovení Kd možné postupem, popsaným v této zkušební metodě. Přesné stanovení je možné, je­li součin hodnoty Kd a poměru půda/roztok > 0,3 při měření založeném na poklesu koncentrace ve vodné fázi (nepřímá metoda), nebo je-li > 0,1 při analýze obou fází (přímá metoda) (61).
XVIII.1.9.4 Stupeň 3 – adsorpční isothermy a desorpční kinetika/desorpční isothermy
XVIII.1.9.4.1 Adsorpční isothermy
Použije se pět koncentrací zkoušené látky, nejlépe v rozsahu dvou řádů; při volbě koncentrací se zohlední rozpustnost ve vodě a výsledná rovnovážná koncentrace ve vodné fázi. V průběhu zkoušky se u každé půdy použije tentýž poměr půda/roztok. Adsorpční zkouška se provede výše uvedenou metodou pouze s tím rozdílem, že se vodná fáze analyzuje pouze jednou po uplynutí doby, která je nezbytná pro dosažení rovnováhy a která byla stanovena dříve ve stupni 2. Stanoví se rovnovážné koncentrace v roztoku a adsorbované množství se vypočte z úbytku zkoušené látky v roztoku nebo přímou metodou. Adsorbované množství na jednotku množství půdy se vynese jako funkce rovnovážné koncentrace zkoušené látky (viz oddíl Data a zprávy).
Výsledky z experimentu pro stanovení adsorpčních isotherm
Z dosud navržených matematických modelů adsorpčních isotherm se k popisu adsorpčních procesů používá Freundlichova isotherma nejčastěji. Podrobnější informace o interpretaci a významu adsorpčních modelů jsou uvedeny v literatuře (41, 45, 80, 81, 82).
Poznámka: Je třeba poznamenat, že hodnoty KF (Freundlichových adsorpčních koeficientů) pro různé látky lze porovnávat pouze tehdy, jsou­li hodnoty KF vyjádřeny ve stejných jednotkách (83).
XVIII.1.9.4.2 Desorpční kinetika
Účelem tohoto experimentu je vyšetřit, zda je chemická látka adsorbována na půdě vratně nebo nevratně. Tato informace je důležitá, neboť desorpční proces hraje také důležitou roli v chování chemické látky v půdě. Desorpční data jsou kromě toho užitečným vstupem pro počítačové modelování vyluhování a pro simulaci vyplavování rozpuštěných látek. Je­li studie desorpce požadována, doporučuje se, aby byla níže popsaná studie provedena na každém systému, na kterém bylo v předchozím experimentu pro studii adsorpční kinetiky možné provést přesné stanovení Kd.
Podobně jako u studie adsorpční kinetiky existují dvě možnosti, jak postupovat při experimentu pro studium desorpční kinetiky: a) paralelní metoda a b) sériová metoda. Volba metodiky, podle které bude postupováno, se ponechává na experimentátorovi, který bude muset zvážit dostupné laboratorní vybavení a prostředky.
a) Paralelní metoda: pro každou půdu zvolenou pro pokročení do studie desorpce se připraví tolik vzorků se stejným poměrem půda/roztok, kolik bude časů, v nichž se má studovat desorpční kinetika. Zvolí se nejlépe stejné časové intervaly, jako u experimentu pro studium adsorpční kinetiky; celkový čas se však prodlouží podle potřeby, aby v systému bylo dosaženo rovnováhy. S každým experimentem (s jednou půdou a s jedním roztokem) se provede slepý pokus. Provede se s půdou a s 0,01M roztokem CaCl
2
bez zkoušené látky se stejnou hmotností a objemem jako v experimentu. Stejnému zkušebnímu postupu se podrobí kontrolní vzorek zkoušené látky v 0,01M roztoku CaCl
2
(bez půdy). Všechny směsi půdy s roztokem se protřepávají do ustavení adsorpční rovnováhy (která se zjišťuje postupem uvedeným dříve ve stupni 2). Poté se fáze oddělí centrifugací a vodná fáze se pokud možno kvantitativně odebere. Objem odebraného roztoku se nahradí stejným objemem 0,01M CaCl
2
bez zkoušené látky a nová směs se opět protřepává. Kupříkladu po 2 h se pokud možno kvantitativně odebere a změří vodná fáze první zkušební nádoby, totéž se provede s vodnou fází druhé zkušební nádoby po 4 h, s vodnou fází třetí zkušební nádoby po 6 h atd., až do dosažení desorpční rovnováhy.
b) Sériová metoda: po experimentu pro stanovení adsorpční kinetiky se směs zcentrifuguje a vodná fáze se pokud možno kvantitativně odebere. Objem odebraného roztoku se nahradí stejným objemem 0,01M CaCl
2
bez zkoušené látky. Nová směs se protřepává až do ustavení desorpční rovnováhy. Během této doby se ve stanovených časových intervalech směs centrifuguje za účelem oddělení fází. Malý podíl vodné fáze se ihned analyzuje na zkoušenou látku; v experimentu se poté pokračuje s původní směsí. Objem každého jednotlivého podílu by měl být menší než 1 % celkového objemu. Ke směsi se přidá stejný objem čerstvého 0,01M roztoku CaCl
2
, aby se zachoval poměr půda/roztok, a v protřepávání se pokračuje po další časový interval.
Procento desorpce se vypočte pro každý čas () a pro každý interval () (podle potřeb studie) a vynese se proti času. Rovněž se vypočte hodnota desorpčního koeficientu Kdes v rovnováze. Všechny příslušné rovnice jsou uvedeny v oddíle Data a zprávy a v dodatku 5.
Výsledky z experimentu pro studium desorpční kinetiky
Společný graf křivek závislostí procenta desorpce a adsorpce na čase umožní posoudit vratnost adsorpčního procesu. Je­li desorpční rovnováhy dosaženo do dvojnásobku času potřebného pro adsorpční rovnováhu a je­li celková desorpce vyšší než 75 % adsorbovaného množství, považuje se adsorpce za vratnou.
XVIII.1.9.4.3 Desorpční isothermy
Freundlichovy desorpční isothermy se vyšetřují na půdách použitých ke stanovení adsorpčních isotherm. Zkouška desorpce se provede způsobem popsaným v oddíle Desorpční kinetika, pouze s tím rozdílem, že se vodná fáze analyzuje pouze jednou, a to v desorpční rovnováze. Vypočte se desorbované množství zkoušené látky. Množství zkoušené látky, které zůstalo adsorbované na půdě po dosažení desorpční rovnováhy se vynese jako funkce rovnovážné koncentrace zkoušené látky v roztoku (viz oddíl Data a zprávy a dodatek 5).
XVIII.2 DATA A ZPRÁVY
Data z analýzy se předloží ve formě tabulky (viz dodatek 6). Uvedou se jednotlivá měření a vypočtené průměrné hodnoty. Předloží se grafy adsorpčních isotherm. Výpočty se provedou níže uvedeným způsobem.
Pro účely zkoušky se předpokládá, že hmotnost 1 cm
3
vodného roztoku je 1 g. Poměr půda/roztok může být vyjádřen stejným číslem pro rozměr hmot./hmot. i pro rozměr hmot./obj.
XVIII.2.1 ADSORPCE



XVIII.2.1.1 Adsorpční isothermy
Rovnice Freundlichových adsorpčních isotherm vyjadřují vztah mezi adsorbovaným množstvím zkoušené látky a koncentrací zkoušené látky v roztoku v rovnováze (rovnice 8).
Data se zpracovávají jako v oddíle o adsorpci a pro každou zkušební nádobu se vypočte množství zkoušené látky adsorbované na půdě po adsorpční zkoušce (), jinde označeno jako x/m). Předpokládá se, že rovnováhy bylo dosaženo a že představuje rovnovážnou hodnotu:



(7) (8) (9) kde: = Freundlichův adsorpční koeficient; má rozměr cm
3
*g
-1
pouze tehdy, je­li 1/n = 1; v ostatních případech se směrnice 1/n projeví v rozměru n = regresní konstanta; 1/n se zpravidla pohybuje od 0,7 do 1,0, což znamená, že jsou sorpční data často nelineární. Rovnice (8) a (9) se vyjádří graficky a hodnoty a 1/n se zjistí regresní analýzou s ohledem na rovnici 9. Vypočte se rovněž korelační koeficient r
2
proložení logaritmické rovnice. Příklad takové křivky je uveden na obrázku 2.


Obrázek 2 Freundlichovy adsorpční křivky, normální a linearizovaná forma
XVIII.2.1.2 Hmotnostní bilance
Hmotnostní bilance (MB) je definována jako procentuální podíl látky z nominálního množství látky na začátku zkoušky, který lze znovu analyticky vyzískat po adsorpční zkoušce. Zpracování dat se bude lišit podle toho, zda je rozpouštědlo neomezeně mísitelné s vodou. V případě rozpouštědel mísitelných s vodou mohou být data zpracována pro stanovení množství látky znovu získané extrakcí rozpouštědlem stejným způsobem, jako v oddíle o desorpci. Je­li rozpouštědlo mísitelné s vodou omezeně, musí být provedeno stanovení množství znovu získané látky. Hmotnostní bilance pro adsorpci se vypočte níže uvedeným způsobem; jako mE se označí součet množství zkušební látky extrahovaných organickým rozpouštědlem z půdy a ze stěn zkušební nádoby:
(V
rec
. C
vod
ads
(eq) + m
E
) . 100 MB = ---------------------------------------- % (10) V
0
. C
0
kde: MB = hmotnostní bilance (%) m
E
= celkové množství zkoušené látky extrahované z půdy a ze stěn zkušební nádoby ve dvou krocích (µg) C
0
= počáteční hmotnostní koncentrace zkušebního roztoku v kontaktu s půdou (µg*cm
-3
) V
rec
= objem supernatantu vyzískaný po dosažení adsorpční rovnováhy (cm
-3
)
XVIII.2.2 DESORPCE
Desorpce (D) je definována jako podíl zkušební látky z dříve adsorbovaného množství, který se za zkušebních podmínek desorboval:
                                                      (11)




Podrobné informace o způsobu výpočtu procenta desorpce Dt pro paralelní a sériovou metodu jsou uvedeny v dodatku 5.
Zdánlivý desorpční koeficient (K
des
) je za zkušebních podmínek poměr mezi množstvím zkoušené látky, která zůstala v půdě a hmotnostní koncentrací desorbované látky ve vodném roztoku po dosažení desorpční rovnováhy:
       



(12)
Návod pro výpočet hodnoty je uveden v dodatku 5 v oddíle o desorpci. Poznámka: Provede-li se předcházející adsorpční zkouška paralelní metodou, je objem VT v rovnici 12 roven V0.
XVIII.2.2.1 Desorpční isothermy
Rovnice Freundlichových desorpčních isotherm vyjadřují vztah mezi množstvím zkoušené látky, které zůstalo adsorbované na půdě a koncentrací zkoušené látky v roztoku v desorpční rovnováze (rovnice 16).
Pro každou zkušební nádobu se množství zkoušené látky, které zůstalo v desorpční rovnováze adsorbované na půdě, vypočte takto:
       
                                                      
  


(13) (14) (15) (16) (17)
Rovnice 16 a 17 se vyjádří graficky a hodnoty K
F
des
a 1/n se zjistí regresní analýzou s ohledem na rovnici 17.
Poznámka:
Je­li Freundlichův adsorpční nebo desorpční exponent 1/n roven 1, bude Freundlichova adsorpční nebo desorpční konstanta (KF ads a KF des) rovna adsorpční resp. desorpční rovnovážné konstantě (Kd resp. Kdes) a křivky závislosti Cs na Caq budou lineární. Nejsou­li exponenty rovny 1, křivky závislosti Cp na Cvod budou nelineární a adsorpční a desorpční konstanty se budou podél isotherem lišit.
XVIII.2.2.2 Zpráva o zkoušce
Protokol o zkoušce by měl obsahovat následující informace:
— úplná identifikace použitých půdních vzorků včetně:
— zeměpisné informace o lokalitě (zeměpisná šířka, zeměpisná délka),
— datum odběru vzorku,
— využití půdy (např. zemědělská půda, lesní půda atd.),
— hloubka odběru vzorků,
— obsah písku/prachových částic/jílu,
— pH (v 0,01M CaCl
2
)
— obsah organického uhlíku,
— obsah organického materiálu,
— obsah dusíku,
— poměr C/N,
— kationtová výměnná kapacita (mmol/kg),
— všechny informace týkající se sběru a uchovávání vzorků,
— podle potřeby všechny informace pro interpretaci adsorpce/desorpce zkoušené látky,
— odkaz na metody reference použité pro stanovení jednotlivých parametrů,
— podle potřeby informace o zkoušené látce,
— teplota při experimentu,
— parametry centrifugace,
— analytický postup použitý při analýze zkoušené látky,
— odůvodnění jakéhokoli použití solubilizačního činidla při přípravě zásobního roztoku zkoušené látky,
— vysvětlení korekcí provedených ve výpočtech, je­li to důležité,
— data podle formuláře (dodatek 6) a grafická znázornění,
— všechny informace a pozorování užitečné pro interpretaci výsledků zkoušky.
XVIII.3 LITERATURA
(1) Kukowski H. and Brümmer G., (1987). Investigations on the Adsorption and Desorption of Selected Chemicals in Soils. UBA Report 106 02 045, Part II.
(2) Fränzle O., Kuhnt G., Vetter L., (1987). Selection of Representative Soils in the EC- Territory. UBA Report 106 02 045, Part I.
(3) Kuhnt G., Muntau H. (Eds.) EURO-Soils: Identification, Collection, Treatment, Characterisation. Special Publication No 1.94.60, Joint Research Centre. European Commission, ISPRA, December 1994.
(4) OECD Test Guidelines Programme, Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995 (June 1995).
(5) US Environment Protection Agency: Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N, Chemistry: Environmental Fate, Series 163-1, Leaching and Adsorption/Desorption Studies, Addendum 6 on Data Reporting, 540/09-88-096, Date: 1/1988.
(6) US Environment Protection Agency: Prevention, Pesticides and Toxic Substances, OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 835-Fate, Transport and Transformation Test Guidelines, 0PPTS No: 835.1220 Sediment and Soil Adsorption/Desorption Isotherm. EPA No: 712-C- 96-048, April 1996.
(7) ASTM Standards, E 1195-85, Standard Test Method for Determining a Sorption Constant (Kou) for an Organic Chemical in Soil and Sediments.
(8) Agriculture Canada: Environmental Chemistry and Fate. Guidelines for registration of pesticides in Canada, 15 July 1987.
(9) Netherlands Commission Registration Pesticides (1995): Application for registration of a pesticide. Section G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.
(10) Danish National Agency of Environmental Protection (October 1988): Criteria for registration of pesticides as especially dangerous to health or especially harmful to the environment.
(11) BBA (1990), Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, Biological Research Centre for Agriculture and Forestry, Braunschweig, Germany.
(12) Calvet R., (1989), „Evaluation of adsorption coefficients and the prediction of the mobilities of pesticides in soils“, in Methodological Aspects of the Study of Pesticide Behaviour in Soil (ed. P. Jamet), INRA, Paris, (Review).
(13) Calvet R., (1980), „Adsorption-Desorption Phenomena“ in Interactions between herbicides and the soil. (R. J. Hance ed.), Academic Press, London, str. 83 – 122.
(14) Hasset J. J., Banwart W.L., (1989), „The sorption of nonpolar organics by soils and sediments“ in Reactions and Movement of Organic Chemicals in Soils. Soil Science Society of America (S.S.S.A), Special Publication no. 22, str. 31 – 44.
(15) van Genuchten M. Th., Davidson J. M., Wierenga P. J., (1974), „An evaluation of kinetic and equilibrium equations for the prediction of pesticide movement through porous media“. Soil Sci. Soc. Am. Proc., Vol. 38(1), str. 29 – 35.
(16) McCall P. J., Laskowski D. A., Swann R. L., Dishburger H. J., (1981), „Measurement of sorption coefficients of organic chemicals and their use, in environmental fate analysis“, in Test Protocols for Environmental Fate and Movement of Toxicants. Proceedings of AOAC Symposium, AOAC, Washington DC.
(17) Lambert S. M., Porter P. E., Schieferrstein R. H., (1965), „Movement and sorption of chemicals applied to the soil“. Weeds, 13, str. 185 – 190.
(18) Rhodes R. C., Belasco I. J., Pease H. L., (1970) „Determination of mobility and adsorption of agrochemicals in soils“. J. Agric. Food Chem., 18, str. 524 – 528.
(19) Russell M. H., (1995), „Recommended approaches to assess pesticide mobility in soil“ in Environmental Behavior of Agrochemicals (ed. T. R. Roberts, P. C. Kearney). John Wiley & Sons Ltd. (20) Esser H. O., Hemingway R. J., Klein W., Sharp D. B., Vonk J. W., Holland P. T., (1988), „Recommended approach to the evaluation of the environmental behavior of pesticides“, IUPAC Reports on Pesticides (24). Pure Appl. Chem., 60, str. 901 – 932.
(21) Guth J. A., Burkhard N., D. O. Eberle, (1976), „Experimental models for studying the persistence of pesticides in soils“. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, str. 137 – 157, BCPC, Surrey, UK.
(22) Furminge C. G. L., Osgerby J. M., (1967), „Persistence of herbicides in soil“. J. Sci. Fd. Agric., 18, str. 269 – 273.
(23) Burkhard N., Guth J. A., (1981), „Chemical hydrolysis of 2-Chloro-4,6-bis(alkylamino)- 1,3,5-triazine herbicides and their breakdown in soil under the influence of adsorption“. Pestic. Sci. 12, str. 45 – 52.
(24) Guth J. A., Gerber H. R., Schlaepfer T., (1977), „Effect of adsorption, movement and persistence on the biological availability of soil-applied pesticides“. Proc. Br. Crop Prot. Conf., 3, str. 961 – 971.
(25) Osgerby J. M., (1973), „Process affecting herbicide action in soil“. Pestic. Sci., 4, str. 247 – 258.
(26) Guth J. A., (1972), „Adsorptions- und Einwascheverhalten von Pflanzenschutzmitteln in Böden“. Schr. Reihe Ver. Wass. -Boden- Lufthyg. Berlin-Dahlem, Heft 37, str. 143 – 154.
(27) Hamaker J. W., (1975), „The interpretation of soil leaching experiments“, in Environmental Dynamics of Pesticides (eds R. Haque, V. H. Freed), str. 135 – 172, Plenum Press, NY.
(28) Helling C. S., (1971), „Pesticide mobility in soils“. Soil Sci. Soc. Amer. Proc., 35, str. 732 – 210.
(29) Hamaker J. W., (1972), „Diffusion and volatilization“ in Organic chemicals in the soil environment (C.A.I. Goring and J. W. Hamaker eds), Vol. I, str. 49 – 143.
(30) Burkhard N., Guth J. A., (1981), „Rate of volatilisation of pesticides from soil surfaces; Comparison of calculated results with those determined in a laboratory model system“. Pestic. Sci. 12, str. 37 – 44.
(31) Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R.F., Enfield C.G., (1984), „Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses“, in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, str. 297 – 325, Acs Symp. Ser. 259, American Chemical Society, Washington, DC.
(32) Gustafson D. I., (1989), „Groundwater ubiquity score: a simple method for assessing pesticide leachability“. J. Environ. Toxic. Chem., 8(4), str. 339 – 357.
(33) Leistra M., Dekkers W. A., (1976). „Computed effects of adsorption kinetics on pesticide movement in soils“. J. Soil Sci., 28, str. 340 – 350.
(34) Bromilov R. H., Leistra M., (1980), „Measured and simulated behavior of aldicarb and its oxydation products in fallow soils“. Pest. Sci., 11, str. 389 – 395.
(35) Green R. E., Karickoff S. W., (1990), „Sorption estimates for modeling“, in Pesticides in the Soil Environment: Process, Impacts and Modeling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am., Book Series no. 2, str. 80 – 101,
(36) Lambert S. M., (1967), „Functional relationship between sorption in soil and chemical structure“. J. Agri. Food Chem., 15, str. 572 – 576.
(37) Hance R. J., (1969), „An empirical relationship between chemical structure and the sorption of some herbicides by soils“. J. Agri. Food Chem., 17, str. 667 – 668.
(38) Briggs G. G. (1969), „Molecular structure of herbicides and their sorption by soils“. Nature, 223, 1288. (39) Briggs G. G. (1981). „Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor“. J. Agric. Food Chem., 29, str. 1050 – 1059.
(40) Sabljic A., (1984), „Predictions of the nature and strength of soil sorption of organic polutance by molecular topology“. J. Agric. Food Chem., 32, str. 243 – 246.
(41) Bailey G. W., White J. L., (1970), „Factors influencing the adsorption, desorption, and movement of pesticides in soil“. Residue Rev., 32, str. 29 – 92.
(42) Bailey G. W., J. L. White, Y. Rothberg., (1968), „Adsorption of organic herbicides by montomorillonite: Role of pH and chemical character of adsorbate“. Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 32: str. 222 – 234.
(43) Karickhoff S. W., (1981), „Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils“. Chemosphere 10, str. 833 – 846.
(44) Paya-Perez A., Riaz M., Larsen B., (1989), „Soil Sorption of 6 Chlorobenzenes and 20 PCB Congeners“. Environ. Toxicol. Safety 21, str. 1 – 17.
(45) Hamaker J. W., Thompson J. M., (1972), „Adsorption in organic chemicals“ in Organic Chemicals in the Soil Environment (Goring C. A. I., Hamaker J. W., eds), Vol I and II, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1972, str. 49 – 143.
(46) Deli J., Warren G. F., 1971, „Adsorption, desorption and leaching of diphenamid in soils“. Weed Sci. 19: str. 67 – 69.
(47) Chu-Huang Wu, Buehring N., Davinson J. M., Santelmann, (1975), „Napropamide Adsorption, desorption and Movement in soils“. Weed Sci., Vol. 23, str. 454 – 457.
(48) Haues M. H. B., Stacey M., Thompson J. M., (1968), „Adsorption of s-triazine herbicides by soil organic preparations“ in Isotopes and Radiation in Soil Organic Studies, p.75, International. Atomic Energy Agency, Vienna.
(49) Pionke H. B., Deangelis R. J., (1980), „Methods for distributing pesticide loss in field run-off between the solution and adsorbed phase“, CREAMS, in A Field Scale Model for Chemicals, Run-off and Erosion from Agricultural Management Systems, Chapter 19, Vol. III: Supporting Documentation, USDA Conservation Research report.
(50) ISO Standard Compendium Environment: Soil Quality – General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition (1994).
(51) Scheffer F., Schachtschabel, Lehrbuch der Bodenkunde, F. Enke Verlag, Stuttgart (1982), 11th edition.
(52) Black, Evans D. D., White J. L., Ensminger L. E., Clark F. E., eds. „Methods of Soil Analysis“, Vol 1 a 2, American Society of Agronomy, Madison, WI, 1982.
(53) ISO/DIS 10381-1 Soil Quality — Sampling — Part 1: Guidance on the design of sampling programmes.
(54) ISO/DIS 10381-2 Soil Quality — Sampling — Part 2: Guidance on sampling techniques.
(55) ISO/DIS 10381-3 Soil Quality — Sampling — Part 3: Guidance on safety of sampling.
(56) ISO/DIS 10381-4 Soil Quality — Sampling — Part 4: Guidance on the investigation of natural and cultivated soils.
(57) ISO/DIS 10381-5 Soil Quality — Sampling — Part 5: Guidance on the investigation of soil contamination of urban and industrial sites.
(58) ISO 10381-6, 1993: Soil Quality — Sampling — Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
(59) Green R. E., Yamane V. K., (1970), „Precision in pesticide adsorption measurements“. Soil Sci. Am. Proc., 34, str. 353 – 354.
(60) Grover R., Hance R. J. (1970), „Effect of ratio of soil to water on adsorption of linuron and atrazine“. Soil Sci., str. 109 – 138.
(61) Boesten, J. J. T. I, „Influence of soil/liquid ratio on the experimental error of sorption coefficients in pesticide/soil system“. Pest. Sci. 1990, 30, str. 31 – 41.
(62) Boesten, J. J. T. I. „Influence of soil/liquid ratio on the experimental error of sorption coefficients in relation to OECD guideline 106„. Proceedings of 5th international workshop on environmental behaviour of pesticides and regulatory aspects, Brussels, 26 – 29 April 1994.
(63) Bastide J., Cantier J. M., et Coste C., (1980), „Comportement de substances herbicides dans le sol en fonction de leur structure chimique“. Weed Res. 21, str. 227 – 231.
(64) Brown D. S., Flagg E. W., (1981), „Empirical prediction of organic pollutants sorption in natural sediments“. J. Environ.Qual., 10(3), str. 382 – 386.
(65) Chiou C. T., Porter P. E., Schmedding D. W., (1983), „Partition equilibria of non-ionic organic compounds between soil organic matter and water“. Environ. Sci. Technol., 17(4), str. 227 – 231.
(66) Gerstl Z., Mingelgrin U., (1984), „Sorption of organic substances by soils and sediments“. J. Environ. Sci. Health, B19 (3), str. 297 – 312.
(67) Vowles P. D., Mantoura R. F. C., (1987), „Sediment-water partition coefficient and HPLC retention factors of aromatic hydrocarbons“. Chemosphere, 16(1), str. 109 – 116.
(68) Lyman W. J., Reehl W. F.and Rosenblatt D. H. (1990). Handbook of Chemical Property Estimation Methods. Environmental Behaviour of Organic Compounds. American Chemical Society, Washington DC.
(69) Keniga E. E., Goring, C. A. I. (1980). „Relationship between water solubility, soil sorption, octanol-water partitioning and concentration of chemicals in the biota“ in Aquatic Toxicology (eds J.G. Eaton, et al.), str.78 – 115, ASTM STP 707, Philadelphia.
(70) Chiou C. T., Peters L. J., Freed V. H., (1979), „A physical concept of soil-water equilibria for non-ionic organic compounds“. Science, Vol. 206, str. 831 – 832.
(71) Hassett J. J., Banwart W. I., Wood S. G., Means J. C., (1981), „Sorption of /-Naphtol: implications concerning the limits of hydrophobic sorption“. Soil Sci. Soc. Am. J. 45, str. 38 – 42.
(72) Karickhoff S. W., (1981), „Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils“. Chemosphere, Vol. 10(8), str. 833 – 846.
(73) Moreale A., van Bladel R., (1981), „Adsorption de 13 herbicides et insecticides par le sol. Relation solubilitE-reactivitE“. Revue de l'Agric., 34 (4), str. 319 – 322.
(74) Müller M., Kördel W. (1996), „Comparison of screening methods for the determination/estimation of adsorption coefficients on soil“. Chemosphere, 32(12), str. 2493 – 2504.
(75) Kördel W., Kotthoff G., Müller M. (1995), „HPLC — screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil — results of a ring test“. Chemosphere 30 (7), str. 1373 – 1384.
(76) Kördel W., Stutte J., Kotthoff G. (1993), „HPLC — screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil — comparison of different stationary phases“. Chemosphere 27 (12), str. 2341 – 2352.
(77) Hance, R. J., (1967), „The Speed of Attainment of Sorption Equilibria in Some Systems Involving Herbicides“. Weed Res., Vol. 7, str. 29 – 36.
(78) Koskinen W. C., Harper S. S., (1990), „The retention processes: mechanisms“ in Pesticides in the Soil Environment: Processes, Impacts and Modelling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am. Book Series, No. 2, Madison, Wisconsin.
(79) Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R. F., Enfield C. G. (1984), „Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural use“, in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, str.297 – 325, ACS Symp. Ser. 259, American Chemical Society, Washington, DC. (80) Giles C. H., (1970), „Interpretation and use of sorption isotherm“ in Sorption and Transport Processes in Soils. S.C.I. Monograph No. 37, str. 14 – 32.
(81) Giles, C. H.; McEwan J. H.; Nakhwa, S.N., Smith, D, (1960), „Studies in adsorption: XI. A system of classification of solution adsorption isotherms and its use in the diagnosis of adsorption mechanisms and in measurements of pesticides surface areas of soil“. J. Chem. Soc., str. 3973 – 93.
(82) Calvet R., TercE M., Arvien J. C., (1980), „Adsorption des pesticides par les sols et leurs constituants: 3. CaractEristiques gEnErales de l'adsorptio“. Ann. Agron. 31: str. 239 – 251.
(83) Bedbur E., (1996), „Anomalies in the Freundlich equatio“, Proc. COST 66 Workshop, Pesticides in soil and the environment, 13 – 15 May 1996, Stratford-upon-Avon, UK.
(84) Guth, J. A., (1985), „Adsorption/desorptio“, in Joint International Symposium, Physicochemical Properties and their Role in Environmental Hazard Assessment, July 1 – 3, Canterbury, UK. (85) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).
DODATEK 1
SCHÉMA ZKOUŠKY



DODATEK 2
VLIV SPRÁVNOSTI ANALYTICKÉ METODY A ZMĚNY KONCENTRACE NA SPRÁVNOST VÝSLEDKŮ ADSORPČNÍ STUDIE
Z následující tabulky (84) je zřejmé, že je­li rozdíl mezi počáteční hmotností zkoušené látky (m0 = 110 µg) a její rovnovážnou hmotností v roztoku (mads aq (eq) = 100 µg), je důsledkem 5% chyby měření rovnovážné koncentrace 50% chyba ve výpočtu hmotnosti zkoušené látky adsorbované na půdě (madss(eq)) a 52,4% chyba ve výpočtu Kd.



DODATEK 3
METODY ODHADU Kd
1. Metody odhadu umožňují předpovědět Kd na základě korelací například s hodnotami Pov (12, 39, 63 – 68), s daty o rozpustnosti (12, 19, 21, 39, 68 – 73) nebo s daty o polaritě získanými při použití HPLC s obrácenou fází (74 – 76). Jak je patrné z tabulky 1 a 2, vypočtou se z takových rovnic hodnoty K
ou
nebo Kom a poté nepřímo hodnoty Kd z rovnic:

                                    
             100                               K
d
100 K
ou
= K
d
.---- (cm
3
. g
-1
) Kom = ----- . --- (cm
3
. g
-1
) %ou 1,724 %ou
2. Tyto korelace jsou založeny na dvou předpokladech: 1) adsorpci látky nejvíce ovlivňuje organický materiál v půdě a 2) mechanismus interakce je převážně nepolární. V důsledku toho tyto korelace 1) nejsou použitelné na polární látky (nebo jsou použitelné jen do určité míry) a 2) nejsou použitelné v případech, kdy je obsah organického materiálu v půdě velmi malý (12). Kromě toho, ačkoli byla zjištěna uspokojivá korelace mezi Pov a adsorpcí (19), nelze totéž říci o korelaci mezi rozpustností ve vodě a mírou adsorpce (19, 21); v tomto ohledu jsou tyto studie protichůdné.
3. Některé příklady korelace mezi adsorpčním koeficientem a rozdělovacím poměrem oktanol/voda nebo rozpustností ve vodě jsou uvedeny v tabulkách 1 a 2.
     Tabulka 1.   Příklady   korelací   mezi   adsorpčním
               distribučním  koeficientem a  rozdělovacím
               koeficientem oktanol/voda; další  příklady
               jsou uvedeny v literatuře (12, 68)

------------------------------------------------------- ---------------------------------
         Látky                      Korelace                   Autoři
------------------------------------------------------- ---------------------------------
Substituovaná močovina  log Kom = 0,69 + 0,52 log Pov     Briggs (1981) (39)
Chlorované aromatické   log K
ou
= -0,779 + 0,904 log Pov Chiou et al. (1983) (65) sloučeniny Různé pesticidy log Kom = 4,4 + 0,72 log Pov Gerstl a Mingelgrin (1984) (66) Aromatické uhlovodíky log K
ou
= -2,53 + 1,15 log Pov Vowles a Mantoura (1987) (67) ------------------------------------------------------- --------------------------------- Tabulka 2. Příklady korelací mezi adsorpčním distribučním koeficientem a rozpustností ve vodě; další příklady jsou uvedeny v literatuře (68, 69) ------------------------------------------------------- --------------------------------- Sloučeniny Korelace Autoři ------------------------------------------------------- --------------------------------- Různé pesticidy log Kom = 3,8 – 0,561 log Sv Gerstl a Mingelgrin (1984) (66) Chlorované alifatické a log Kom = (4,040 +/- 0,038) – Chiou et al. (1979) (70) aromatické látky (0,557 +/- 0,012) log Sv alfa-Naftol log K
ou
= 4,273 – 0,686 log Sv Hasset et al. (1981) (71) Cyklické, alifatické a log K
ou
= -1,405 – 0,921 log Sv Karickhoff (1981) (72) aromatické látky - 0,00953 (mp-25) Různé látky log Kom = 2,75 – 0,45 log Sv Moreale van Blade (1982) (73) ------------------------------------------------------- ---------------------------------
DODATEK 4
VÝPOČTY PRO STANOVENÍ PARAMETRŮ CENTRIFUGACE
1. Centrifugační doba se za předpokladu, že jsou částice kulové, vypočte podle následující rovnice:



(1)
Pro zjednodušení nejsou parametry uvedeny v základních jednotkách SI (ale v jednotkách soustavy CGS).
kde:
omega           =   úhlová rychlost (= 2 pí*(rpm)/60), rad*s
-1
rpm = počet otáček za minutu ný = viskozita roztoku, g*s
-1
*cm
-1
r
p
= poloměr částic, cm ró
p
= hustota půdy, g*cm
-3
vod
= hustota roztoku, g*cm
-3
R
t
= vzdálenost od středu rotoru centrifugy k hladině roztoku v centrifugační kyvetě, cm R
b
= vzdálenost od středu rotoru centrifugy ke dnu centrifugační kyvety, cm R
b
– R
t
= výška sloupce směsi půda/roztok v centrifugační kyvetě, cm.
V praxi se k zajištění úplného oddělení volí dvojnásobek vypočteného času.
2. Rovnici (1) lze dále zjednodušit, jestliže se položí viskozita (ný) a hustota (ný
vod
) roztoku rovny viskozitě a hustotě vody při 25 st.C; tedy ný = 8,95 × 10-3 g*s
-1
*cm
-1
a ńvod = 1,0 g*cm
-3
. Centrifugační doba je poté dána rovnicí (2):
                             
            3,7                          R
b
t = --------------------------- 1n ---- (rpm)
2
. r
p
2
(ró
p
- 1) R
t
(2)
3. Z rovnice 2 vyplývá, že pro účely oddělení částic o určité velikosti (v našem případě o poloměru 0,1 µm) jsou pro stanovení parametrů centrifugace, tj. doby (t) a počtu otáček za minutu (rpm), důležité dvě charakteristiky: 1) hustota půdy a 2) výška sloupce směsi v centrifugační kyvetě (Rb – Rt), tj. vzdálenost, kterou půdní částice urazí mezi hladinou v kyvetě a jejím dnem; výška sloupce směsi v kyvetě bude při pevně stanoveném objemu samozřejmě záviset na druhé mocnině poloměru kyvety.
4. Na obrázku 1 jsou znázorněny změny centrifugační doby (t) v závislosti na centrifugační rychlosti (rpm) pro různé hustoty půdy (ńp) (obrázek 1a) a pro různé výšky sloupce směsi v centrifugačních kyvetách (obrázek 1b). Z obrázku 1a je zřejmý vliv hustoty půdy; např. při obvyklých 3 000 ot./min je centrifugační doba přibližně 240 min pro hustotu půdy 1,2 g*cm
-3
, ale pouze 50 min pro 2,0 g*cm
-3
. Podobně je podle obrázku 1b při obvyklých 3 000 ot./min centrifugační doba přibližně 50 min pro výšku sloupce směsi 10 cm a pouze 7 min pro výšku sloupce 1 cm. Je však důležité nalézt optimální poměr mezi centrifugací, která vyžaduje co nejmenší výšku sloupce, a snadností, s jakou může experimentátor oddělovat fáze po centrifugaci.
5. Kromě toho je při stanovování experimentálních podmínek při oddělování fází půda/roztok důležité počítat s možnou přítomností třetí „pseudofáze“, koloidu. Koloidní částice s velikostí menší než 0,2 µm mohou mít značný vliv na celý mechanismus adsorpce látky v půdní suspenzi. Při centrifugaci, jak je popsána výše, zůstanou koloidní částice ve vodné fázi a analyzují se společně s vodnou fází. Informace o jejich vlivu se tedy ztratí. Má­li laboratoř, která studii provádí, zařízení pro ultracentrifugaci nebo ultrafiltraci, mohla by být adsorpce/desorpce studována hlouběji včetně informací o adsorpci látky na koloidních částicích. V takovém případě se k oddělení tří fází – půdy, koloidních částic a roztoku, použije ultracentrifugace při 60 000 ot./min nebo ultrafiltrace na filtru zachycujícím částice o velikosti 100 000 daltonů. Protokol o zkoušce by měl být také odpovídajícím způsobem pozměněn, mají- li být analyzovány všechny tři fáze.



Obrázek 1a Změny centrifugační doby (t) v závislosti na centrifugační rychlosti (ot./min) pro různé hustoty půdy (ró
p
). Rt = 10 cm, Rb – Rt = 10 cm, ný = 8,95 × 10-3 g*s
-1
cm
-1
a ró
vod
= 1,0 g*cm
-3
při 25 st.C.


Obrázek 1b Změna centrifugační doby (t) v závislosti na centrifugační rychlosti (ot./min) pro různé výšky sloupce směsi v centrifugační kyvetě (R
b
– R
t
) = L; Rt = 10 cm, ný = 8,95 × 10
-3
g*s
-1
*cm
-1
, ró
vod
= 1,0 g*cm
-3
při 25 st.C a ró
p
= 2,0 g*cm
-3
.
DODATEK 5
VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%)
Časové schéma průběhu experimentu je následující:
 


U všech výpočtů se předpokládá, že zkoušená látka je stálá a že se významně neadsorbuje na stěnách nádoby.
ADSORPCE (A%)
a) Paralelní metoda
Procento adsorpce se vypočte pro každou zkušební nádobu (i) pro každý čas (ti) podle následující rovnice:
            
         m
p
ads
(t
i
) . 100 A
ti
= --------------------- (%) m
0
(1)3
     Veličiny v této rovnici lze vyčíslit takto:


m
0
= C
0
. V
0
(mg) (2) m
p
ads
(t
i
) = m
0
- C
vod
ads
(ti ) . V
0
(mg) (3) kde: A
t
= procento adsorpce (%) v čase ti = množství zkoušené látky na půdě v čase ti, kdy je prováděna analýza (µg) m
0
= množství zkoušené látky v nádobě na začátku zkoušky (µg) C
0
= počáteční hmotnostní koncentrace zkušebního roztoku v kontaktu s půdou (µg*cm
-3
) = hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi v čase ti, kdy je prováděna analýza, (µg*cm
-3
); Tato koncentrace se stanoví analyticky a koriguje se na hodnoty ze slepých pokusů V
0
= počáteční objem zkušebního roztoku v kontaktu s půdou (cm
3
). Hodnoty adsorpčního procenta nebo se vynesou proti času a zjistí se doba, po níž se ustavila sorpční rovnováha. Příklady takových křivek jsou uvedeny na obrázcích 1 a 2. Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (C
vod
) na čase



b) Sériová metoda
V následujících rovnicích je zohledněno, že se při studii adsorpce provádějí měření zkoušené látky v malých podílech vodné fáze v určitých časových intervalech.
— Pro každý časový interval se množství látky adsorbované na půdě vypočte takto:



Hodnoty procenta adsorpce nebo (podle potřeb studie) se vynesou proti času a stanoví se doba, po níž se ustavila sorpční rovnováha.
— V čase ustavení rovnováhy teq:



DESORPCE (%)
Časem t
0
, v němž se zahájí experiment pro studium desorpční kinetiky, je okamžik, kdy je co největší objem roztoku zkoušené látky (po dosažení adsorpční rovnováhy) nahrazen stejným objemem 0,01M roztoku CaCl
2
.
a) Paralelní metoda
V čase t
i
se změří množství zkoušené látky ve vodné fázi odebrané ze zkušební nádoby i (V
t
i
) a desorbované množství se vypočte z rovnice:



b) Sériová metoda
V následujících rovnicích je zohledněno, že byla při předcházející studii adsorpce prováděna měření zkoušené látky v malých podílech vodné fáze (sériová metoda v bodě 1.9 Provedení zkoušky) Předpokládá se, že a) objem supernatantu odebraného ze zkušební nádoby po experimentu pro studium adsorpční kinetiky byl nahrazen stejným objemem 0,01M roztoku CaCl
2
(VR) a b) celkový objem vodné fáze v kontaktu s půdou (VT) během experimentu pro studium desorpční kinetiky zůstává konstantní a je dán rovnicí:






DODATEK 6
ADSORPCE – DESORPCE V PŮDÁCH: FORMULÁŘE PRO PŘEDLOŽENÍ DAT
=================================================================
Zkoušená látka:
Zkušební půda:
Podíl sušiny v půdě (105 st.C, 12 h):……………………………………………%
Teplota:…………………………………………………………………………st.C
Použitelnost analytické metody
Navážka půdy                     g          
Půda: suchá hmotnost             g          
Objem roztoku CaCl
2
cm
3
Nominální koncentrace µg*cm
-3
připraveného roztoku Analytická koncentrace µg*cm
-3
připraveného roztoku Podstata použité analytické metody: Kalibrace analytické metody: ================================================================= ============================================================================ Zkoušená látka: Zkušební půda: Podíl sušiny v půdě (105 st.C, 12 h):……………………………………………% Teplota:…………………………………………………………………………st.C Použitá metodika Nepřímá - Paralelní - Sériová - analýzy: Přímá - Adsorpční zkouška: zkušební vzorky ---------------------------------------------------------------------------- Symbol Jednotky Čas Čas Čas Čas (v průběhu (v průběhu (v průběhu (v průběhu ustavování ustavování ustavování ustavování rovnováhy) rovnováhy) rovnováhy) rovnováhy) ---------------------------------------------------------------------------- Zkušební nádoba č. Navážka — g půdy Půda: suchá mpůda g hmotnost Objem vody Vvp cm
3
v navážce půdy (vypočtený) Objem 0,01M cm
3
roztoku CaCl
2
použitého k uvedení do rovnováhy s půdou Objem cm
3
zásobního roztoku Celkový V0 cm
3
objem vodné fáze v kontaktu s půdou Počáteční C0 µg*cm
-3
koncentrace zkoušeného roztoku Množství m0 µg zkoušené látky na začátku zkoušky ---------------------------------------------------------------------------- Po protřepávání a centrifugaci ---------------------------------------------------------------------------- Nepřímá metoda ---------------------------------------------------------------------------- Paralelní metoda ---------------------------------------------------------------------------- Koncentrace µg*cm
-3
zkoušené látky ve vodné fázi, po korekci na slepý pokus ---------------------------------------------------------------------------- Sériová metoda ---------------------------------------------------------------------------- Naměřené µg množství zkoušené látky v podílu ---------------------------------------------------------------------------- Přímá metoda ---------------------------------------------------------------------------- Množství µg zkoušené látky adsorbované na půdě ---------------------------------------------------------------------------- Výpočet adsorpce ---------------------------------------------------------------------------- Adsorpce % % Střední hodnota Adsorpční Kd cm
3
*g
-1
koeficient Střední hodnota Adsorpční K
ou
cm
3
*g
-1
koeficient Střední hodnota ============================================================================ ============================================================================ Zkoušená látka: Zkušební půda: Podíl sušiny v půdě (105 st.C, 12 h):……………………………………………% Teplota:…………………………………………………………………………st.C Adsorpční zkouška: slepý pokus a kontrolní vzorky ----------------------------------------------------------------- Symbol Jednotky Slepý Slepý Kontrolní pokus pokus vzorek ----------------------------------------------------------------- Zkušební nádoba č. Navážka půdy g 0 0 Množství vody cm
3
— — v navážce půdy (vypočtené) Přidaný objem cm
3
0,01M roztoku CaCl
2
Přidaný objem cm
3
0 0 zásobního roztoku zkušební látky Celkový objem cm
3
— — vodné fáze (vypočtený) Počáteční µg*cm
-3
hodnota zkušební látky ve vodné fázi ----------------------------------------------------------------- Po protřepávání a centrifugaci ----------------------------------------------------------------- Koncentrace ve µg*cm
-3
vodné fázi Poznámka: Podle potřeby lze přidat sloupce. ================================================================ ========================================================== Zkoušená látka: Zkušební půda: Podíl sušiny v půdě (105 st.C, 12 h):……………………………………………% Teplota:……………………………………………………………………………st.C Množstevní bilance ---------------------------------------------------------- Symbol Jednotky Zkušební nádoba č. Navážka půdy — g Půda: suchá hmotnost mpůda g) Objem vody v navážce půdy (vypočtený) Vvp ml Objem 0,01M roztoku CaCl
2
použitého ml k uvedení do rovnováhy s půdou Objem zásobního roztoku cm
3
Celkový objem vodné fáze v kontaktu V0 cm
3
s půdou Počáteční koncentrace zkoušeného C0 µg*cm
-3
roztoku Čas (v průběhu ustavování rovnováhy) — h ---------------------------------------------------------- Po protřepávání a centrifugaci ---------------------------------------------------------- Koncentrace zkoušené látky ve vodné µg*cm
-3
fázi v adsorpční rovnováze, po korekci na slepý pokus Rovnovážný čas teq h ---------------------------------------------------------- První přidání rozpouštědla ---------------------------------------------------------- Odebraný objem vodné fáze Vrec cm
3
Přidaný objem rozpouštědla V cm
3
---------------------------------------------------------- První extrakce rozpouštědlem ---------------------------------------------------------- Velikost signálu měřidla při analýze SE1 různé rozpouštědla Koncentrace zkoušené látky CE1 µg*cm
-3
v rozpouštědle Množství látky extrahované z půdy a mE1 µg stěn nádoby ---------------------------------------------------------- Druhá extrakce rozpouštědlem ---------------------------------------------------------- Odebraný objem rozpouštědla Vrozp cm
3
Přidaný objem rozpouštědla V' cm
3
---------------------------------------------------------- Druhá extrakce rozpouštědlem ---------------------------------------------------------- Velikost signálu měřidla při analýze SE2 různé rozpouštědlové fáze Koncentrace zkoušené látky CE2 µg*cm
-3
v rozpouštědle Množství látky extrahované z půdy a mE2 µg stěn nádoby Celkové množství zkoušené látky mE µg extrahované ve dvou krocích Hmotnostní bilance MB % ========================================================== ========================================================== Zkoušená látka: Zkušební půda: Podíl sušiny v půdě (105 st.C, 12 h):……………………………………………% Teplota:…………………………………………………………………………st.C ---------------------------------------------------------- Adsorpční isothermy Symbol Jednotky ---------------------------------------------------------- Zkušební nádoba č. Navážka půdy — g Půda: suchá hmotnost E g Objem vody v navážce Vvp cm
3
půdy (vypočtený) Objem 0,01M roztoku cm
3
CaCl
2
použitého k uvedení do rovnováhy s půdou Přidaný objem cm
3
zásobního roztoku Celkový objem vodné V0 cm
3
fáze v kontaktu s půdou (vypočtený) Koncentrace roztoku C0 µg*cm
-3
Čas (v průběhu — h ustavování rovnováhy) ---------------------------------------------------------- Po protřepávání a centrifugaci ---------------------------------------------------------- Koncentrace látky ve µg*c vodné fázi, po m
-3
korekci na slepý pokus Teplota st.C Adsorbované množství µg*g
-1
na jednotku množství půdy Regresní analýza: hodnota : hodnota l/n: regresní koeficient r2: ========================================================= ========================================================== Zkoušená látka: Zkušební půda: Podíl sušiny v půdě (105 st.C, 12 h):……………………………………………% Teplota:…………………………………………………………………………st.C Použitá metodika analýzy: Nepřímá - Paralelní - Sériová - -------------------------------------------------------------------- Desorpční zkouška Symbol Jednotky Časový Časový Časový Časový interval interval interval interval -------------------------------------------------------------------- Číslo zkušební nádoby z adsorpčního experimentu Množství látky µg adsorbované na půdě v adsorpční rovnováze Odebraný objem VR cm
3
vodné fáze nahrazený 0,01M CaCl
2
Celkový PM V0 cm
3
objem vodné SM VT cm
3
fáze v kontaktu s půdou Množství látky, µg které zbylo (aniž se adsorbovalo) po ustavení adsorpční rovnováhy, a to v důsledku nekvantitativní výměny objemu vodné fáze ---------------------------------------------------------- Desorpční kinetika ---------------------------------------------------------- Naměřené množství µg látky desorbované z půdy v čase ti Objem roztoku PM cm
3
odebraný ze zkušební nádoby (i) pro měření zkoušené látky SM cm
3
Množství látky µg desorbované z půdy v čase ti (vypočtené) Množství látky µg desorbované z půdy během časového intervalu (vypočtené) ---------------------------------------------------------- Procento desorpce ---------------------------------------------------------- Desorpce v čase ti % Desorpce za časový % interval Zdánlivý desorpční K
des
koeficient PM: paralelní metoda SM: sériová metoda ===========================================================
XIX. METODA PRO STANOVENÍ ODHADU ADSORPČNÍHO KOEFICIENTU (KOU) PRO PŮDY A ČISTÍRENSKÉ KALY VYSOKOÚČINNOU KAPALINOVOU CHROMATOGRAFIÍ (HPLC) – metoda C.19 podle přílohy směrnice 2001/59/ES
XIX.1 METODA
Tato metoda je replikou metody OECD TG121 (2000).
XIX.1.1 ÚVOD
Sorpční chování látek v půdách a v čistírenských kalech může být popsáno parametry experimentálně stanovenými zkušební metodou C.18. Důležitým parametrem je adsorpční koeficient, který je definován jako poměr koncentrace látky v půdě nebo kalu a koncentrace látky ve vodné fázi v rovnováze. Adsorpční koeficient normalizovaný na obsah organického uhlíku v půdě K
ou
je užitečným ukazatelem schopnosti chemické látky vázat se na organické látky v půdě a v čistírenském kalu a umožňuje porovnat různé chemické látky. Tento parametr lze odhadnout z korelace s rozpustností ve vodě a s rozdělovacím koeficientem oktanol/voda (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7).
Experimentální metoda popsaná v této zkoušce používá k odhadu adsorpčního koeficientu Kou v půdě a v čistírenských kalech vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (8). Tyto odhady jsou spolehlivější než odhady z výpočtů pomocí metodiky QSAR (Quantitative Structure Activity Relationship) (9). Jako metoda založená na odhadu nemůže plně nahradit násadové experimenty stanovení adsorpční/desorpční rovnováhy podle metody C.18. Odhady K
ou
však mohou být užitečné pro volbu vhodných parametrů pro adsorpční/desorpční studie podle zkušební metody C.18, a to vypočtením Kd (distribučního koeficientu) nebo KF (Freundlichova adsorpčního koeficientu) z rovnice 3 (viz bod 1.2).
XIX.1.2 DEFINICE
Kd: Distribuční koeficient je definován jako poměr rovnovážných koncentrací C rozpuštěné látky ve dvoufázovém systému skládajícím se ze sorbentu (půda nebo čistírenský kal) a vodné fáze; je bezrozměrný, jsou­li koncentrace v obou fázích vyjádřeny jako hmotnostní podíly. Je­li koncentrace ve vodné fázi vyjádřena v jednotce hmotnosti na jednotku objemu, je jednotkou ml*g
-1
. Kd se může měnit s vlastnostmi sorbentu a může záviset na koncentraci.
       

       C
půda
C
kal
K
D
= ------- nebo ------- (1) C
voda
C
vod
kde: C
půda
= koncentrace zkoušené látky v půdě v rovnováze (µg*g
-1
) C
kal
= koncentrace zkoušené látky v kalu v rovnováze (µg*g
-1
) C
vod
= koncentrace zkoušené látky ve vodné fázi v rovnováze (µg*g
-1
, µg*ml
-1
). K
F
: Freundlichův adsorpční koeficient je definován jako koncentrace zkoušené látky v půdě nebo v čistírenském kalu (x/m), je­li rovnovážná koncentrace Cvod ve vodné fázi rovna jedné; vyjadřuje se v µg na gram sorbentu. Hodnota se může měnit s vlastnostmi sorbentu. x 1 log --- = log K
F
+ --- . log C
vod
m n (2) kde: x/m = množství zkoušené látky x (µg) adsorbované v rovnováze na určitém množství sorbentu m (g) 1/n = směrnice Freundlichovy adsorpční isothermy C
vod
= koncentrace zkoušené látky ve vodné fázi v rovnováze (µg*ml
-1
) Při C
vod
= 1: K
ou
: Distribuční koeficient (K
d
) nebo Freundlichův adsorpční koeficient (K
F
) normalizovaný na obsah organického uhlíku (f
ou
) v sorbentu; zejména u nedisociujících chemických látek je přibližným ukazatelem míry adsorpce látky na sorbentu a umožňuje provést porovnání různých chemických látek. V závislosti na rozměru K
d
a K
F
může být K
ou
bezrozměrný nebo může být jeho jednotkou ml . g
-1
nebo µg . g
-1
organického materiálu. K
d
K
F
Kou = --- (bezrozměrný nebo v ml*g
-1
) nebo ----- (µg*g
-
1) (3) f
ou
f
ou
Vztah mezi K
ou
a Kd není vždy lineární, hodnoty K
ou
se mohou pro jednotlivé půdy měnit, avšak jejich kolísání je ve srovnání s hodnotami Kd nebo KF silně omezeno. Adsorpční koeficient (Kou) lze odečíst pomocí kapacitního faktoru (k') z kalibrační křivky log k' versus log K
ou
pro vybrané referenční sloučeniny. t
R
- t
0
k' = --------- t
0
(4) kde: t
R
: retenční časy zkoušené a referenční látky pro HPLC (min) t
0
: mrtvá doba HPLC (min) (viz bod 1.8.2). Pov: Rozdělovací koeficient oktanol/voda je definován jako poměr koncentrací rozpuštěné látky v n-oktanolu a ve vodě; je bezrozměrný. C
oktanol
P
ov
= --------- (= K
ov
) (5) C
voda
XIX.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Pře použitím metody by měly být známy strukturní vzorec, čistota a disociační konstanta (podle potřeby). Užitečné jsou informace o rozpustnosti ve vodě a v organických rozpouštědlech, o rozdělovacím koeficientu oktanol­voda a o chování při hydrolýze.
Mají­li být uvedena do korelace naměřená retenční data z HPLC pro zkoušenou látku a její adsorpční koeficient, musí být vytvořen kalibrační graf log K
ou
versus log k'. Použije se minimálně šest referenční bodů, alespoň po jednom nad a pod očekávanou hodnotou pro zkoušenou látku. Správnost metody se významně zlepší, budou­li použity referenční látky strukturně příbuzné se zkoušenou látkou. Nejsou­li taková data známa, ponechává se na experimentátorovi, aby vybral vhodné kalibrační látky. V takovém případě by měla být vybrána obecnější sada strukturně heterogenních látek. Látky a hodnoty Kou, které mohou být použity, jsou uvedeny v dodatku, a to v tabulce 1 pro čistírenský kal a v tabulce 3 pro půdu. Volba jiných kalibračních látek by měla být zdůvodněna.
XIX.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
HPLC se provádí na analytických kolonách plněných komerčně dostupným kyanopropylem jako pevnou fází, obsahujícím lipofilní a polární složky. Použije se mírně polární stacionární fáze na silikagelové matrici:
      – O – Si       – CH
2
– CH
2
– CH
2
– CN silikagel nepolární spacer polární složka
Podstata zkušební metody je obdobná jako ve zkušební metodě A.8 (rozdělovací koeficient, metoda HPLC). Při průchodu kolonou v mobilní fázi zkoušená látka interaguje se stacionární fází. V důsledku rozdělování mezi mobilní a stacionární fází se postup zkoušené látky zpomaluje. Dvojí složení stacionární fáze s polárními a nepolárními skupinami umožňuje, aby polární a nepolární skupiny molekuly interagovaly podobným způsobem, jako je tomu u organického materiálu v půdě nebo čistírenském kalu. To umožňuje stanovit vztah mezi retenčním časem na koloně a adsorpčním koeficientem na organickém materiálu.
Na sorpční chování zejména u polárních látek má významný vliv pH. V případě zemědělských půd nebo nádrží s čistírenskými kaly se pH normálně pohybuje od pH 5,5 do 7,5. U disociujících látek se ve vhodném pufračním roztoku provedenou dvě zkoušky, a to jak s disociovanou formou, tak s nedisociovanou formou, avšak pouze v případě, že v rozmezí pH 5,5 až 7,5 disociuje alespoň 10 % zkoušené sloučeniny.
Vzhledem k tomu, že se k hodnocení použije pouze vztah mezi retencí na koloně HPLC a adsorpčním koeficientem, není nutná žádná kvantitativní metoda, nýbrž pouze stanovení retenčního času. Je­li k dispozici vhodná sada referenčních látek a lze­li realizovat standardní experimentální podmínky, je metoda rychlým a účinným způsobem odhadu adsorpčního koeficientu Kou.
XIX.1.5 POUŽITELNOST ZKOUŠKY
Metoda HPLC je použitelná pro chemické látky (radioizotopově značené i neznačené), pro něž je k dispozici vhodný detekční systém (např. spektrofotometr, detektor radioaktivního záření) a jež jsou po dobu experimentu dostatečně stabilní. Může být zvláště užitečná pro chemické látky, jejichž studium je v jiných experimentálních systémech obtížné (tj. pro těkavé látky, které nejsou rozpustné ve vodě v koncentraci, kterou lze analyticky měřit, pro látky s vysokou afinitou k povrchu inkubačních systémů). Metoda může být použita pro směsi, které dávají nerozlišitelný eluční pás. V takovém případě se stanoví horní a dolní meze hodnot log K
ou
pro sloučeniny přítomné ve směsi. Při interpretaci výsledků HPLC mohou někdy působit problémy nečistoty. Jejich vliv je však malý, neboť zkoušené látky lze jasně analyticky identifikovat a od nečistot oddělit.
Metoda je validována pro látky uvedené v tabulce 1 v dodatku a byla rovněž použita u řady jiných chemických látek z následujících chemických tříd:
— aromatické aminy (např. trifluralin (1­(dipropylamino)­2,6­dinitro­4­(trifluormet hyl)benzen), 4­chloranilin, 3,5­dinitroanilin, 4­methylanilin, N­methylanilin, 1­nafylamin),
— estery aromatických karoxylových kyselin (např. methyl­benzoát, ethyl­3,5­dinitrobenzoát),
— aromatické uhlovodíky (např. toluen, xylen, ethylbenzen, nitrobenzen),
— estery aryloxyfenoxypropanové kyseliny (např. diklofop­methyl, fenoxaprop­ethyl, fenoxaprop­P­ethyl),
— benzimidazolové a imidazolové fungicidy (např. karbendazim, fuberidazol, triazoxid),
— amidy karboxylových kyselin (např. 2­chlorbenzamid, N,N­dimethylbenzamid, 3,5­dinitrobenzamid, N­methylbenzamid, 2­nitrobenzamid, 3­nitrobenzamid),
— chlorované uhlovodíky (např. endosulfan, DDT, hexachlorbenzen, kvintozen, 1,2,3­trichlorbenzen),
— organofosforové insekticidy (např. azinfos­methyl, disulfoton, fenamifos, isofenfos, pyrazofos, sulprofos, triazofos),
— fenoly (např. fenol, 2­nitrofenol, 4­nitrofenol, pentachlorfenol, 2,4,6­trichlorfenol, 1­naftol),
— deriváty fenylmočoviny (např. isoproturon, monolinuron, pencykuron),
— pigmentová barviva (např. Acid Yellow 219, Basic Blue 41, Direct Red 81),
— polyaromatické uhlovodíky (např. acenaften, naftalen),
— 1,3,5­triazinové herbicidy (např. prometryn, propazin, simazin, terbutryn),
— triazolové deriváty (např. tebukonazol, triadimefon, tradimenol, triapenthenol).
Metoda není použitelná u látek, které reagují s eluentem nebo stacionární fází. Není rovněž použitelná u látek, které interagují specifickým způsobem s anorganickými složkami (např. tvoří klastrové komplexy s minerály jílu). Metoda nemusí být použitelná u povrchově aktivních látek, anorganických látek a mírných nebo silných organických kyselina a zásad. Lze stanovit Kou s hodnotami log K
ou
od 1,5 do 5,0. Disociující látky musí být měřeny s pufrovanou mobilní fázi, avšak je třeba dbát na to aby nedošlo ke srážení složek pufru nebo zkoušené látky.
XIX.1.6 KRITÉRIA JAKOSTI
XIX.1.6.1 Správnost
Obvykle lze adsorpční koeficient zkoušené látky stanovit v rozmezí +/-0,5 řádu hodnoty stanovené násadovou rovnovážnou metodou (viz tabulka 1 v dodatku). Vyšší míry správnosti lze dosáhnout, jsou­li použité referenční látky strukturně příbuzné se zkoušenou látkou.
XIX.1.6.2 Opakovatelnost
Stanovení se provedou alespoň dvojmo. Hodnoty log K
ou
získané z jednotlivých měření by měly ležet v rozmezí +/-0,1.
XIX.1.6.3 Reprodukovatelnost
Dosud získané zkušenosti s použitím metody svědčí o její validitě. Ověřování metody HPLC za použití 48 látek (převážně pesticidů), u nichž byla k dispozici spolehlivá data o K
ou
v půdě, vedlo ke korelačnímu koeficientu R = 0,95 (10, 11).
Pro zlepšení a validaci metody bylo proveden mezilaboratorní test za účasti 11 laboratoří (12). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2 v dodatku.
XIX.1.7 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
XIX.1.7.1 Předběžný odhad adsorpčního koeficientu
Rozdělovací poměr oktanol­voda Pov (= Kow) a do určité míry i rozpustnost ve vodě mohou být použity jako indikátory rozsahu adsorpce zejména u nedisociujících látek a mohou tedy být použity pro jeho předběžné nalezení. Pro různé skupiny chemických látek byla publikována řada užitečných korelací (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7).
XIX.1.7.2 Přístroje a pomůcky
Nezbytným vybavením je kapalinový chromatograf vybavený bezpulsním čerpadlem a vhodným detekčním zařízením. Doporučuje se používat nástřikový ventil se vstřikovací smyčkou. Použije se komerční kyanopropylové chemicky vázané pryskyřice na silikagelu (např. Hypersil a Zorbax CN). Mezi nástřikem a analytickou kolonou může být umístěna ochranná předkolona ze stejného materiálu. Kolony od různých dodavatelů se mohou podstatně lišit, pokud jde o účinnost. Pro orientaci by měly být dosaženy následující kapacitní faktory: log k' > 0,0 pro log K
ou
= 3,0 a log k' > 0,4 pro log K
ou
= 2,0 při použití směsi methanol/voda 55/45 % jako mobilní fáze.
XIX.1.7.3 Mobilní fáze
Bylo testováno několik mobilních fází a doporučují se následující dvě mobilní fáze:
— methanol/voda (55/45 % obj.),
— methanol/0,01M citrátový pufr pH 6,0 (55/45 % obj.).
K přípravě elučního rozpouštědla se použije methanol a voda nebo citrátový pufr čistoty pro HPLC. Směs se před použitím odplyní. Měla by být provedena isokratická eluce. Nevyhovuje-li směs methanol/voda, lze vyzkoušet směsi jiných organických rozpouštědel s vodou, např. ethanol/voda nebo acetonitril/voda. U disociujících sloučenin se doporučuje použití pufračního roztoku ke stabilizaci pH. Je nezbytné dbát na to, aby nedošlo ke srážení solí a narušení kolony, ke kterému dochází u některých směsí organické fáze s pufračním roztokem. Nesmí být použity žádné přísady, jako jsou iontově párová činidla, neboť mohou ovlivnit sorpční vlastnosti stacionární fáze. Takové změny stacionární fáze mohou být nevratné. Z tohoto důvodu musí být experimenty s použitím přísad prováděny na zvláštních kolonách.
XIX.1.7.4 Rozpouštěné látky
Zkušební a referenční látky se rozpustí v mobilní fázi.
XIX.1.8 PROVEDENÍ ZKOUŠKY
XIX.1.8.1 Zkušební podmínky
Během měření se zaznamenává teplota. Pro zajištění konstantních podmínek během kalibrace a předběžných měření a během měření zkoušené látky se velmi doporučuje použití kolony s regulací teploty.
XIX.1.8.2 Stanovení mrtvé doby t0
Pro stanovení mrtvé doby lze použít dvě různé metody (viz také bod 1.2).
XIX.1.8.2.1 Stanovení mrtvé doby t0 pomocí homologické řady
Je ověřeno, že tato metoda poskytuje spolehlivé a standardisované hodnoty t0. Podrobnosti viz zkušební metoda A.8: Rozdělovací koeficient (n­oktanol/voda ) metodou za použití HPLC.
XIX.1.8.2.2 Stanovení mrtvé doby t0 pomocí inertních látek, které nejsou kolonou zadržovány
Tato technika je založena na nástřiku roztoků formamidu, močoviny nebo dusičnanu sodného. Měření se provedou alespoň dvojmo.
XIX.1.8.3 Stanovení retenčních časů tR
Referenční látky se vyberou tak, jak je uvedeno v bodě 1.3. Pro stanovení jejich retenčních časů mohou být nastříknuty jako směsný standard za předpokladu, že je ověřeno, že retenční čas žádného referenčního standardu není ovlivňován přítomností jiných referenčních standardů. Kalibrace by měla být prováděna pravidelně, alespoň dvakrát denně, aby se zachytily nečekané změny účinnosti kolony. Nástřiky pro kalibraci by měly být prováděny nejlépe před nástřikem zkoušené látky a po něm, aby se ověřilo, že nedošlo ke změně retenčních časů. Zkoušené látky se nastříknou odděleně v co nejmenších množstvích (aby se kolona nezahltila) a stanoví se jejich retenční časy.
S cílem zvýšit důvěryhodnost měření musí být provedena alespoň opakovaná stanovení. Hodnoty log K
ou
získané z jednotlivých měření by měly ležet v rozmezí +/-0,25.
XIX.1.8.4 Hodnocení
Kapacitní faktory k' se vypočtou z mrtvé doby t0 a retenčních časů tR vybraných referenčních látek podle rovnice 4 (viz bod 1.2). Hodnoty log k' referenčních látek se poté vynesou proti jejich hodnotám log K
ou
z násadových rovnovážných experimentů uvedených v tabulkách 1 a 3 v dodatku. Z této křivky se poté pomocí hodnoty log k' zkoušené látky odečte její hodnota log Kou. Je­li z aktuálních výsledků zřejmé, že hodnota log K
ou
leží mimo obor kalibrační křivky, zkouška se opakuje s vhodnějšími referenčními látkami.
XIX.2 DATA A ZPRÁVY
Zpráva musí obsahovat následující informace:
— identita zkoušené látky a referenčních látek, jejich čistota a podle potřeby hodnoty pKa,
— popis zařízení a pracovních podmínek, např. typ a velikost analytické (a ochranné) kolony, detekční zařízení, mobilní fáze (poměr složek a pH), rozpětí teploty během měření,
— mrtvá doba a použité metody jejího stanovení,
— množství zkoušené látky a referenčních látek zavedených do kolony,
— retenční časy referenčních sloučenin použitých ke kalibraci,
— charakteristiky proložené regresní křivky (log k' versus log Kou) a graf regresní křivky,
— průměrná retenční data a odhad hodnoty log Kou zkoušené sloučeniny.
— chromatogramy.
XIX.3 LITERATURA
(1) W. J. Lyman, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt (ed.). (1990). Handbook of chemical property estimation methods, kap. 4, McGraw-Hill, New York.
(2) J. Hodson, N. A. Williams (1988). The estimation of the adsorption coefficient (Kou) for soils by HPLC. Chemosphere, 17, 1 67.
(3) G. G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. J. Agric. Food Chem., 29, str. 1050 – 1059.
(4) C. T. Chiou, P. E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition equilibria of nonionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol., 17, str. 227 – 231.
(5) Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic substances by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, B19, str. 297 – 312.
(6) C. T. Chiou, L. J. Peters, V. H. Freed (1979). A physical concept of soil water equilibria for nonionic organic compounds, Science, 106, str. 831 – 832.
(7) S. W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, str. 833 – 846.
(8) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), str. 121 – 128.
(9) M. Mueller, W. Kördel (1996). Comparison of screening methods for the estimation of adsorption coefficients on soil. Chemosphere, 32(12), str. 2493 – 2504.
(10) W. Kördel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient in soil- comparison of different stationary phases, Chemosphere, 27(12), str. 2341 – 2352.
(11) B. von Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Sorption of nonpolar and polar compounds to soils: Processes, measurements and experience with the applicability of the modified OECD Guideline 106, Chemosphere, 22, str. 285 – 304.
(12) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), str. 1373 – 1384.
DODATEK
                        TABULKA 1
Porovnání hodnot K
ou
pro půdy a čistírenské kaly a hodnot vypočtených skreeningovou metodou s HPLC 1, 2 ------------------------------------------------------------ ----------------------------------------- Látka Číslo CAS Log K
ou
pro Log K
ou
Log K
ou
pro Log K
ou
čistírenské pomocí půdy pomocí delta kaly HPLC HPLC ------------------------------------------------------------ ----------------------------------------- Atrazin 1912-24-9 1,66 2,14 0,48 1,81 2,20 0,39 Linuron 330-55-2 2,43 2,96 0,53 2,59 2,89 0,30 Fenthion 55-38-9 3,75 3,58 0,17 3,31 3,40 0,09 Monuron 150-68-5 1,46 2,21 0,75 1,99 2,26 0,27 Fenanthren 85-01-8 4,35 3,72 0,63 4,09 3,52 0,57 Fenyl­benzoát 93-99-2 3,26 3,03 0,23 2,87 2,94 0,07 Benzamid 55-21-0 1,60 1,00 0,60 1,26 1,25 0,01 4-Nitrobenzamid 619-80-7 1,52 1,49 0,03 1,93 1,66 0,27 Acetanilid 103-84-4 1,52 1,53 0,01 1,26 1,69 0,08 Anilin 62-53-3 1,74 1,47 0,27 2,07 1,64 0,43 2,5-Dichloranilin 95-82-9 2,45 2,59 0,14 2,55 2,58 0,03 ------------------------------------------------------------ ----------------------------------------- 1 W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), str. 121-128. 2 W. Kördel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludges. Chemosphere, 35 (1/2), str. 107- 119. TABULKA 2 Výsledky mezilaboratorního porovnávacího testu provedeného za účelem zlepšení a validace metody s HPLC (11 zúčastněných laboratoří)1 ---------------------------------------------------------- Látka Číslo CAS Log K
ou
K
ou
Log K
ou
(OECD 106) ------------------------ Metoda založená na HPLC ---------------------------------------------------------- Atrazin 1912-24-9 1,81 78 +/- 16 1,89 Monuron 150-68-5 1,99 100 +/- 8 2,00 Triapenthenol 77608-88-3 2,37 292 +/- 58 2,47 Linuron 330-55-2 2,59 465 +/- 62 2,67 Fenthion 55-38-9 3,31 2062 +/- 648 3,31 ---------------------------------------------------------- 1 W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC- screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), str. 1373-1384. TABULKA 3 Referenční látky doporučené pro skreeningovou metodu s HPLC na základě adsorpčních dat pro půdu ----------------------------------------------------------------- ---------------------------------------------- Referenční látka Číslo CAS Logaritmy Počet hodnot Logaritmus Zdroj středních K
ou
směrodatné hodnot odchylky z násadové rovnovážné metody ----------------------------------------------------------------- ---------------------------------------------- Acetanilid 103-84-4 1,25 4 0,48 a) Fenol 108-95-2 1,32 4 0,70 a) 2-Nitrobenzamid 610-15-1 1,45 3 0,90 b) N,N-Dimethylbenzamid 611-74-5 1,52 2 0,45 a) 4-Methylbenzamid 619-55-6 1,78 3 1,76 a) Methylbenzoát 93-58-3 1,80 4 1,08 a) Atrazin 1912-24-9 1,81 3 1,08 c) Isoproturon 34123-59-6 1,86 5 1,53 c) 3-Nitrobenzamid 645-09-0 1,95 3 1,31 b) Anilin 62-53-3 2,07 4 1,73 a) 3,5-Dinitrobenzamid 121-81-3 2,31 3 1,27 b) Karbendazim 10605-21-7 2,35 3 1,37 c) Triadimenol 55219-65-3 2,40 3 1,85 c) Triazoxide 72459-58-6 2,44 3 1,66 c) Triazofos 24017-47-8 2,55 3 1,78 c) Linuron 330-55-2 2,59 3 1,97 c) Naftalen 91-20-3 2,75 4 2,20 a) Endosulfan-diol 2157-19-9 3,02 5 2,29 c) Methiokarb 2032-65-7 3,10 4 2,39 c) Acid Yellow 219 63405-85-6 3,16 4 2,83 a) 1,2,3-Trichlorbenzen 87-61-6 3,16 4 1,40 a) ă-HCH (lindan) 58-89-9 3,23 5 2,94 a) Fenthion 55-38-9 3,31 3 2,49 c) Direct Red 81 2610-11-9 3,43 4 2,68 a) Pyrazofos 13457-18-6 3,65 3 2,70 c) a-Endosulfan 959-98-8 4,09 5 3,74 c) Diklofop-methyl 51338-27-3 4,20 3 3,77 c) Fenanthren 85-01-8 4,09 4 3,83 a) Basic Blue 41 (směs) 26850-47-5 4,89 4 4,46 a) 12270-13-2 DDT 50-29-3 5,63 1 — b) ----------------------------------------------------------------- ---------------------------------------------- a) W. Kördel, J. Müller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoeffizienten organischer Chemikalien mit der HPLC. UBA R & D Report No 106 01 044 (1994). b) B.V. Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Chemosphere, 22, str. 285-304. c) Data poskytnutá průmyslem.
XX. METODA PRO STANOVENÍ TOXICITY PRO REPRODUKCI U DAPHNIA MAGNA – metoda C.20 podle přílohy směrnice 2001/59/ES
XX.1 METODA
Tato zkouška toxicity pro reprodukci je replikou metody OECD TG 211 (1998).
XX.1.1 ÚVOD
Hlavním cílem zkoušky je posoudit účinky chemických látek na reprodukční schopnost druhu Daphnia magna.
XX.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
Matečné organismy: dafnie samičího pohlaví, které jsou přítomné na začátku zkoušky a jejich reprodukční schopnost je předmětem studie. Potomstvo: mladé dafnie pocházející z matečných organismů v průběhu zkoušky.
Nejnižší koncentrace s pozorovanými účinky (lowest observed effect concentration, LOEC): je nejnižší zkoušená koncentrace, při níž je pro danou expoziční dobu pozorován statisticky významný účinek látky na reprodukci a na mortalitu matečných organismů (na úrovni pravděpodobnosti falešně pozitivního hodnocení p < 0,05) ve srovnání s kontrolní skupinou, v průběhu stanovené expoziční doby. Všechny zkoušené koncentrace vyšší než LOEC musí mít stejné nebo vážnější škodlivé účinky, než účinky pozorované při koncentraci LOEC. Nelze­li tyto dvě podmínky splnit, musí podrobně vysvětleno jak byla LOEC (a tedy i NOEC) zvolena.
Koncentrace bez pozorovaných účinků (no observed effect concentration, NOEC): je zkušební koncentrace bezprostředně nižší než LOEC, která při srovnání s kontrolní skupinou nemá pro danou expoziční dobu statisticky významný účinek (p < 0,05).
ECx: je koncentrace zkoušené látky rozpuštěné ve vodě, která pro danou expoziční dobu vede k x% snížení reprodukce dafnií Daphnia magna.
Imanentní růst populace: je míra růstu populace, v níž je zahrnuta reprodukční schopnost a mortalita specifická z hlediska stáří (20, 21, 22). V ustáleném stavu bude nulový. Pro rostoucí populaci bude kladný a pro snižující se populaci bude záporný. Je zřejmé, že při záporném růstu nelze druh zachovat a nakonec dojde k jeho vyhynutí.
Mez detekovatelnosti: je nejnižší koncentrace, v níž lze látku detekovat, nikoli však stanovit. Mez stanovitelnosti: je nejnižší koncentrace, v níž lze látku kvantitativně naměřit.
Mortalita: organismus se zaznamená jako mrtvý, je­li nepohyblivý, tj. není­li schopen plavat nebo není­li u končetin (přívěsků) nebo u postabdomen pozorován pohyb do 15 s po lehkém zatřepání zkušební nádobou. (Použije­li se jiná definice, musí být uvedena společně s literární odkazem.)
XX.1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Mladé samičí dafnie (matečné organismy) na začátku zkoušky mladší než 24 h se exponují zkoušené látce přidané do vody v určitém rozsahu koncentrací. Zkouška trvá 21 dní. Na konci zkoušky se odhadne celkový počet vylíhnutých živých potomků pocházejících z jednoho matečného organismu, který přežil do konce zkoušky. To znamená, že nedospělé dafnie pocházející z dospělých dafnií, které v průběhu zkoušky uhynuly, se z odhadů vyloučí. Reprodukční schopnost matečných organismů lze vyjádřit jiným způsobem (např. jako počet živých potomků pocházejících z jednoho matečného organismu za den, a to od prvního dne, kdy bylo potomstvo pozorováno), který se však uvede doplňkově vedle celkového počtu nedospělých dafnií pocházejících z jedné matečné dafnie živé na konci zkoušky. Reprodukční schopnost organismů exponovaných zkoušené látce se porovná s reprodukční schopností kontrolní skupiny (kontrolních skupin) s cílem stanovit nejnižší koncentraci s pozorovanými účinky (LOEC) a tím i koncentraci bez pozorovaných účinků (NOEC). Kromě toho se data pokud možno analyzují pomocí regresního modelu s cílem odhadnout koncentraci, která vyvolává x% snížení reprodukční schopnosti, (tj. EC
50
, EC20 nebo EC10). Musí být rovněž uvedeno přežití matečných organismů a okamžik narození vylíhnutí prvních potomků. Zkoumány mohou být také jiné účinky vyvolané látkou, které mají vliv na charakteristiky, jako jsou růst (např. vliv na délku) a případně imanentní růst populace.
XX.1.4 INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE
Měly by být k dispozici výsledky zkoušky akutní toxicity (viz metoda C.2, část I) provedené u Daphnia magna. Výsledky mohou být užitečné pro volbu vhodného rozsahu zkušebních koncentrací ve zkouškách toxicity pro reprodukci. Měly by být známy rozpustnost zkoušené látky ve vodě a tlak jejích par a měla by být k dispozici spolehlivá analytická metoda kvantitativního stanovení látky ve zkušebních roztocích, a to s doloženým výtěžkem a mezí stanovitelnosti.
Užitečnými informacemi o zkoušené látce pro účely stanovení zkušebních podmínek mohou být strukturní vzorec, čistota látky, stálost na světle, pKa, Pov a výsledky zkoušky snadné biologické rozložitelnosti (viz metoda C.4).
XX.1.5 VALIDITA ZKOUŠKY
Má-li být zkouška platná, musí být u kontrolní skupiny (kontrolních skupin) splněna následující kriteria reprodukční schopnosti:
— mortalita matečných organismů (dafnií samičího pohlaví) nesmí na konci zkoušky překročit 20 %,
— střední hodnota počtu živých potomků pocházejících z jednoho matečného organismu živého na konci zkoušky je ? 60.
XX.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
XX.1.6.1 Přístroje a pomůcky
Zkušební nádoby nebo jiné přístroje a pomůcky, které přijdou do styku se zkušebními roztoky, by měly být skleněné nebo z jiného chemicky inertního materiálu. Zkušebními nádobami jsou obvykle skleněné kádinky.
Kromě toho bude nezbytné některé nebo veškeré následující zařízení:
— přístroj pro měření koncentrace kyslíku (s mikroelektrodou, nebo jiný vhodný přístroj na měření koncentrace rozpuštěného kyslíku ve vzorcích malého objemu),
— vhodný přístroj pro regulaci teploty,
— pH­metr,
— vybavení pro stanovení tvrdosti vody,
— zařízení pro stanovení celkového organického uhlíku (TOC) ve vodě nebo zařízení pro stanovení chemické spotřeby kyslíku (CHSK),
— vhodné zařízení pro ovládání režimu osvětlení a pro měření intenzity světla.
XX.1.6.2 Testovací organismy
Ke zkoušce se použije druh Daphnia magna Straus. Jiné druhy dafnií mohou být použity, pokud splňují případná kritéria validity (kriterium validity týkající se reprodukční schopnosti kontrolních skupin by mělo být relevantní pro daný druh dafnií). Použijí­li se jiné druhy dafnií, musí být jasně identifikovány a jejich použití musí být zdůvodněno.
Klon by měl být identifikován nejlépe uvedením genotypu. Výzkum ukázal (1), že reprodukční schopnost klonu A (který pochází z institutu IRCHA ve Francii) (3) stabilně splňuje kriterium validity, jímž je - 60 potomků na přeživší matečný organismus při kultivaci za podmínek popsaných v této metodě. Splňuje­li kultura dafnií prokazatelně kriteria validity pro tuto zkoušku jsou přijatelné i jiné klony.
Na začátku zkoušky musí být dafnie 24 h staré a nesmí být první generací. Musí pocházet ze zdravé kultury (tj. nesmí vykazovat známky stresu projevující se vysokou mortalitou, přítomnost jedinců samčího pohlaví a epifií, zpoždění produkce prvních potomků, přítomnost jinak zbarvených jedinců atd.). Organismy ze zásobní kultury musí být chovány v podmínkách podobných těm, které mají být použity při zkoušce (osvětlení, teplota, médium, krmení a počet dafnií na jednotku objemu). Liší­li se kultivační médium pro dafnie, které má být použito při zkoušce, od média používaného k rutinní kultivaci dafnií, doporučuje se zařadit před zkouškou obvykle třítýdenní aklimatizační období (tj. v délce odpovídající jedné generaci), aby nedošlo u matečných organismů ke stresu.
XX.1.6.3 Zkušební médium
Doporučuje se, aby bylo v této zkoušce použito přesně definované médium. Tím se lze vyhnout použití přísad, které je obtížné charakterizovat (např. mořských řas, půdy, extraktu atd.) a zvýšit vyhlídky mezilaboratorní standardizace. Jako vyhovující pro tento účel byla shledána Elendtova média M4 (4) a M7. Přijatelná jsou však i jiná média (např. (5, 6)), splňuje­li při jejich použití reprodukční schopnost kultury dafnií prokazatelně kriteria validity pro tuto zkoušku.
Použije­li se médium, které obsahuje nedostatečně charakterizovatelné přísady, měly by být tyto přísady jasně specifikovány a v protokolu o zkoušce se uvedou informace o jejich složení, to zejména o obsahu organického uhlíku, neboť může přispívat k dodávané stravě. Doporučuje se, aby byl stanoven celkový organický uhlík (TOC) a/nebo chemická spotřeba kyslíku (CHSK) výchozí formy organické přísady a aby byl odhadnut výsledný příspěvek k TOC nebo CHSK ve zkušebním médiu. Doporučuje se, aby byly úrovně TOC v médiu (tj. před přidáním řas) nižší než 2 mg*l
-1
(7). Při zkoušení látek obsahujících kovy je důležité si uvědomit, že vlastnosti zkušebního média (např. tvrdost, chelatační schopnosti) mohou mít vliv na toxicitu látky. Z tohoto důvodu je žádoucí, aby bylo médium přesně definováno. V současnosti jsou však jedinými přesně definovanými médii, o nichž je známo, že jsou vhodná pro dlouhodobou kultivaci kultury druhu Daphnia magna, Elendtova média M4 a M7. Obě média obsahují chelatační činidlo EDTA. Práce (2) ukázala, že provádí­li se zkouška v médiích M4 a M7, je „zdánlivá toxicita“ kadmia zpravidla nižší než v médiu, které neobsahuje EDTA. Média M4 a M7 se tedy nedoporučují pro zkoušení látek obsahujících kovy a neměla by se používat ani jiná média obsahující činidla známá svojí chelatační schopností. V případě látek obsahujících kovy se doporučuje používat jiné médium, například rekonstituovanou tvrdou sladkou vodu podle ASTM (7), která neobsahuje EDTA a do níž je přidán extrakt z řas (8). Tato kombinace rekonstituované tvrdé sladké vody podle ASTM a extraktu z řas je také vhodná pro dlouhodobou kultivaci druhu Daphnia magna (2) a pro zkoušení na tomto druhu, přestože vykazuje slabé chelatační účinky způsobené organickými složkami přidaného extraktu z řas.
Na začátku zkoušky a v jejím průběhu by měla být koncentrace rozpuštěného kyslíku vyšší než 3 mg*l- 1. pH by mělo být v rozmezí 6 až 9 a zpravidla by se nemělo v žádné zkoušce měnit o více než 1,5. Doporučuje se tvrdost nad 140 mg*l
-1
(jako CaCO3). Ve zkouškách při této a vyšší tvrdosti reprodukční schopnost prokazatelně vyhovovala kritériím validity (9, 10).
XX.1.6.4 Zkušební roztoky
Zkušební roztoky o zvolených koncentracích se obvykle připraví ředěním zásobního roztoku. Zásobní roztoky se připraví nejlépe rozpuštěním látky ve zkušebním médiu.
Pro přípravu vhodně koncentrovaného zásobního roztoku může být někdy nezbytné použití organických rozpouštědel nebo dispergátorů, měla by však být vynaložena maximální snaha takové látky nepoužívat. Ke vhodným rozpouštědlům patří aceton, ethanol, methanol, dimethylformamid a triethylenglykol. Ke vhodným dispergátorům patří Cremophor RH40, 0,01% methylcellulosa a HCO-40. V žádném případě by však neměl být obsah zkušební látky ve zkušebních roztocích vyšší než je její rozpustnost ve zkušebním médiu.
K přípravě zásobního roztoku, který lze přesně dávkovat do vody, se použijí rozpouštědla. Při doporučené koncentraci rozpouštědla v konečném zkušebním médiu (tj. =< 0,1 ml*l
-1
) nejsou výše uvedená rozpouštědla toxická a nezvyšují rozpustnost látky ve vodě.
Dispersanty mohou usnadnit přesné dávkování a dispergaci. Při doporučené koncentraci v konečném zkušebním médiu (tj. =< 0,1 ml*l
-1
) nejsou výše uvedené dispergátory toxické a nezvyšují rozpustnost látky ve vodě.
XX.1.7 USPOŘÁDÁNÍ ZKOUŠKY
Expozice se rozvrhne pro jednotlivé zkušební nádoby a veškeré další obsluhování zkušebních nádob se provádí náhodně. Nedodržení této zásady může vést k jednostrannému vychýlení, které může být považováno za účinek koncentrace. Jsou­li například experimentální jednotky obsluhovány v pořadí zahájení expozice nebo v pořadí koncentrací, mohl by nějaký časově podmíněný efekt, např. únava obsluhy nebo jiné pochybení, vést k vyšším účinkům při vyšších koncentracích. Mohou­li být dále výsledky ovlivněny počátečními podmínkami zkoušky nebo okolními podmínkami, jako je např. umístění v laboratoři, mělo by být zváženo blokové uspořádání zkoušky.
XX.1.8 POSTUP
XX.1.8.1 Podmínky expozice
XX.1.8.1.1 Délka expozice
Zkouška trvá 21 dní.
XX.1.8.1.2 Nasazování
Matečné organismy se umístí po jednom do zkušebních nádob s 50 až 100 ml média.
Aby bylo možné splnit požadavky analytické metody použité pro stanovení koncentrace zkoušené látky, může být v některých případech nezbytné použít větší objemy, přípustné je rovněž sdružování paralelních vzorků k chemické analýze. Jsou­li použity objemy větší než 100 ml, může být nezbytné zvýšit krmné dávky podávané dafniím, aby se zajistila odpovídající dostupnost stravy a splnila kritéria validity. U průtokových zkoušek mohou být z technických důvodů zvážena jiná uspořádání (např. čtyři skupiny po 10 organismech ve větším zkušebním objemu), avšak jakékoli změny uspořádání zkoušky musí být ale uvedeny v závěrečné zprávě.
XX.1.8.1.3 Počet organismů
U semistatických zkoušek se nasadí jednotlivě alespoň 10 organismů pro každou zkušební koncentraci a alespoň 10 organismů jednotlivě do zkušebních skupin.
U průtokových zkoušek se ukázalo vhodným rozdělit pro každou koncentraci 40 organismů do čtyř skupin po 10 organismech (1). Může být použit menší počet zkušebních organismů, přičemž se doporučuje na jednu koncentraci rozdělit minimálně 20 organismů do dvou nebo více paralelních skupin o stejném počtu organismů (např. čtyři paralelní skupiny po pěti dafniích). Je třeba poznamenat, že u zkoušek, při níž se organismy nasazují jako skupiny, nebude možné vyjádřit reprodukční schopnost jako počet živých potomků pocházejících z jednoho matečného organismu, který přežil do konce zkoušky v případě, že matečný organismus uhyne. V takovém případě se reprodukční schopnost vyjádří jako „celkový počet živých potomků pocházejících z jednoho matečného organismu přítomného na začátku zkoušky“.
XX.1.8.1.4 Krmení
U semistatických zkoušek se dafnie krmí nejlépe denně, alespoň však třikrát týdně (tj. s výměnou média). Odchylky od této praxe (např. u průtokových zkoušek) se uvedou ve zprávě.
Strava matečných organismů během zkoušky by měla sestávat nejlépe z živých buněk řas jednoho nebo více následujících druhů: Chlorella sp., Selenastrum capricornutum (nyní Pseudokirchneriella subcapitata (11)) a Scenedesmus subspicatus. Množství dodávané stravy by mělo vycházet z množství organického uhlíku (C) dodávaného na jeden matečný organismus. Výzkum (12) ukázal, že u druhu Daphnia magna je postačující pro dosažení dostatečného potomstva nezbytného pro splnění kritérií validity množství stravy od 0,1 do 0,2 mg C na dafnii za den. Strava může být dodávána buď ve stejných dávkách po celou dobu zkoušky, nebo podle požadavku v nižších dávkách na začátku zkoušky a poté ve zvyšujících se dávkách s ohledem na růst matečných organismů. V takovém případě by mělo množství stravy po celou dobu zůstat v doporučeném rozmezí 0,1 až 0,2 mg C na dafnii za den.
Použije­li se k určení potřebného množství stravy zástupný ukazatel, jako je počet buněk řas nebo absorbance ve viditelném světle, musí každá laboratoř vytvořit vlastní nomogram vztahu zástupného ukazatele a obsahu uhlíku v kultuře řas (viz dodatek 2 s návodem na vytvoření nomogramu). Nomogramy by měly být ověřovány jednou ročně a častěji v případě, že se změní podmínky kultivace řas. Absorbance ve viditelném světle byla shledána lepším zástupným ukazatelem celkového obsahu uhlíku, než počet buněk (13).
Dafniím by měla být dodávána koncentrovaná suspenze řas, aby se minimalizoval objem kultivačního média řas uváděný do zkušební nádoby. Zkoncentrování řas lze dosáhnout centrifugací a následnou resuspenzí v destilované vodě, v deionisované vodě nebo v kultivačním médiu dafnií.
XX.1.8.1.5 Osvětlení
16 hodin světla při intenzitě nepřekračující 15 až 20 µE m-2*s
-1
.
XX.1.8.1.6 Teplota
Teplota zkušebního média by se měla pohybovat v rozmezí 18 až 22 st.C. V žádné zkoušce by však teplota neměla v těchto mezích kolísat o více než 2 st.C (např. 18 až 20, 19 až 21 nebo 20 až 22 st.C). Pro účely sledování teploty může být vhodné použít další zkušební nádobu.
XX.1.8.1.7 Provzdušňování
Zkušební nádoby nesmí být v průběhu zkoušky provzdušňovány.
XX.1.8.2 Zkušební koncentrace
Zpravidla se použije alespoň pět zkušebních koncentrací tvořících geometrickou řadu s faktorem nepřekračujícím 3,2 a přiměřený počet paralelních zkušebních skupin v rámci každé zkušební koncentrace (viz bod 1.8.1.3). Použití méně než pěti koncentrací by mělo být zdůvodněno. Látky by neměly být zkoušeny pro koncentrace vyšší, než je jejich rozpustnost ve zkušebním médiu.
Při volbě rozsahu koncentrací by měly být zohledněny následující zásady:
i) je­li cílem získat LOEC/NOEC, musí být nejnižší zkušební koncentrace dostatečně nízká, aby nebyla plodnost při této koncentraci významně nižší, než plodnost v kontrolní skupině. V opačném případě bude muset být zkouška opakována se sníženou nejnižší koncentrací;
ii) je­li cílem získat LOEC/NOEC, musí být nejvyšší zkušební koncentrace dostatečně vysoká, aby byla plodnost při této koncentraci významně nižší, než plodnost v kontrolní skupině. V opačném případě bude muset být zkouška opakována se zvýšenou nejvyšší koncentrací;
iii) má­li být pro účinky na reprodukci odhadnuta ECx, doporučuje se, aby byl použit dostatečný počet koncentrací s cílem zjistit ECx s přijatelným intervalem spolehlivosti. Je­li znám odhad EC
50
pro účinky na reprodukci, doporučuje se, aby byla nejvyšší zkušební koncentrace vyšší než tato EC
50
. Jinak sice bude stále možné odhadnout EC
50
, interval spolehlivosti však bude velmi široký a nemusí být možné uspokojivé posouzení přiměřenosti navrženého modelu;
iv) do rozsahu zkušebních koncentrací by nejlépe neměly spadat koncentrace, které mají statisticky významný účinek na přežití dospělců, neboť by mohl být změněn charakter zkoušky z pouhé zkoušky toxicity pro reprodukci na kombinovanou zkoušku toxicity pro reprodukci a mortality, která vyžaduje daleko složitější statistickou analýzu.
Předcházející znalost toxicity zkoušené látky (např. ze zkoušek akutní toxicity nebo z orientačních studií) by měla pomoci při volbě vhodných zkušebních koncentrací.
Použije­li se k usnadnění přípravy zásobního roztoku rozpouštědlo nebo dispergátor (viz bod 1.6.4), neměla by být jeho konečná koncentrace ve zkušební nádobě vyšší než 0,1 ml*l- 1 a měla by být ve všech zkušebních nádobách stejná.
XX.1.8.3 Kontrolní skupiny
Kromě zkušební série se nasadí jedna série kontrolních skupin pro kontrolu zkušebního média a podle potřeby jedna série kontrolních skupin obsahujících rozpouštědlo nebo dispergátor. Použije­li se rozpouštědlo nebo dispergátor, měla by být jejich koncentrace stejná jako koncentrace v nádobách se zkoušenou látkou. Použije se vhodný počet paralelních skupin (viz oddíl 1.8.1.3).
V dobře vedených zkouškách by měl být variační koeficient středního počtu živých potomků narozených každému matečnému organismu v kontrolní skupině (kontrolních skupinách) zpravidla =< 25 %, a to by mělo být uvedeno v plánu zkoušek s oddělenými jedinci.
XX.1.8.4 Obnovování zkušebního média
Častost obnovování média bude záviset na stálosti zkoušené látky, médium se však obnovuje alespoň třikrát týdně. Není­li podle předběžných zkoušek stálosti (viz bod 1.4) koncentrace zkoušené látky po maximální dobu mezi obnoveními média (tj. po tři dny) stálá (tj. nepohybuje se v intervalu 80 – 120 % nominální koncentrace nebo klesá pod 80 % naměřené počáteční koncentrace), měl by být zváženo častější obnovování média nebo průtoková zkouška.
Při obnovování média v semistatických zkouškách se připraví druhá série zkušebních nádob a matečné organismy se do nich přenesou např. skleněnou pipetou o vhodném průměru. Objem média přeneseného s dafniemi by měl být co nejmenší.
XX.1.8.5 Pozorování
Výsledky pozorování prováděných během zkoušky se zaznamenávají do přehledu dat (viz příklady v dodatcích 3 a 4). Jsou­li požadována další měření (viz body 1.3 a 1.8.8), může být nezbytné provádět další pozorování.
XX.1.8.6 Potomstvo
Potomstvo pocházející z každého matečného organismu se od jeho prvního výskytu nejlépe denně vybírá a počítá, aby nespotřebovávalo potravu určenou pro dospělého jedince. Pro účely této metody je třeba započítat pouze živé potomstvo, avšak zaznamenává se i přítomnost potracených vajíček nebo mrtvého potomstva.
XX.1.8.7 Mortalita
Mortalita matečných organismů se zaznamenává nejlépe denně, alespoň současně s počítáním potomstva.
XX.1.8.8 Další parametry
Třebaže je tato metoda navržena hlavně k posouzení účinků na reprodukci, je možné, aby byly v míře dostatečné pro statistickou analýzu kvantifikovány i jiné účinky. Užitečné je zvláště měření růstu, neboť poskytuje informaci o možných subletálních účincích. Tato pozorování mohou být užitečnější než samotné měření reprodukce. Doporučuje se změřit na konci zkoušky délku matečných organismů (tj. délku těla bez zadečkového hrotu). K parametrům, které lze měřit nebo vypočítávat patří dále doba do narození prvních plůdků (a následně dalších potomků), počet a velikost potomků na jeden organismus, počet potracených plůdků, přítomnost jedinců samčího pohlaví nebo efipií a imanentní růst populace.
XX.1.8.9 Častost analytických stanovení a měření
Alespoň jednou týdně se měří koncentrace kyslíku, teplota, tvrdost a pH v čerstvém a ve starém médiu, v kontrolních nádobách a u nejvyšší zkušební koncentrace.
Během zkoušky se v pravidelných intervalech stanoví koncentrace zkoušené látky stanovují U semistatických zkoušek (s obnovením média), u nichž se má zkušební koncentrace pohybovat v rozmezí +/-20 % nominálních hodnot (tj. od 80 do 120 % – viz body 1.4 a 1.4.8), se doporučuje analyzovat alespoň nejvyšší a nejnižší zkušební koncentrace na začátku studie ihned po jejich přípravě a při obnovování, a to jednou během prvního týdne zkoušky (tj. analýzy se provedou na vzorku z téhož roztoku – při jeho přípravě a při obnovování). Tato stanovení se poté opakují alespoň v týdenních intervalech.
U zkoušek, u nichž se nepředpokládá, že se bude koncentrace zkoušené látky pohybovat v rozmezí +/- 20 % nominální hodnoty, je nezbytné analyzovat všechny zkušební koncentrace, a to ihned po jejich přípravě a při obnovování. U zkoušek, u nichž není naměřená počáteční koncentrace zkoušené látky v rozsahu +/-20 % nominální koncentrace, avšak u nichž lze dostatečně prokázat, že počáteční koncentrace jsou reprodukovatelné a stálé, (tj. od 80 do 120 % počátečních koncentrací), by mohla být stanovení ve 2. a 3. týdnu zkoušky omezena na nejvyšší a nejnižší zkušební koncentrace. Ve všech případech je stanovení koncentrací zkoušené látky před obnovením třeba provést pro každou koncentraci pouze u jedné paralelní nádoby.
U průtokových zkoušek je vhodný podobný vzorkovací režim, jako je popsán u semistatických zkoušek (v tomto případě se však neprovádí měření „starých“ roztoků). Doporučuje se však zvýšit počet odběrů v prvním týdnu (např. tři sady měření) pro ujištění, že jsou zkušební koncentrace stálé. V těchto typech zkoušky se průtok ředicí vody a zkoušené látky kontroluje denně.
Lze-li však prokázat, že po celou dobu zkoušky byla koncentrace zkoušené látky uspokojivě udržována v rozmezí +/-20 % nominální hodnoty, mohou být výsledky založeny na nominálních nebo naměřených počátečních hodnotách. Je­li odchylka od nominální nebo naměřené počáteční koncentrace větší než +/-20 %, vyjádří se výsledky jako časově vážené průměry (viz dodatek 5).
XX.2 DATA A ZPRÁVY
XX.2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ
Účelem této zkoušky je stanovit účinek zkoušené látky na celkový počet živých potomků pocházejících z jednoho matečného organismu, který přežil do konce zkoušky. Celkový počet potomků na matečný organismus se vypočte pro každou zkušební nádobu (tj. pro každou paralelní nádobu). Jestliže v kterékoli paralelní nádobě matečný organismus během zkoušky uhyne nebo se zjistí, že jde o samečka, vyloučí se nádoba z experimentu. Analýza se poté provede se zmenšeným počtem paralelních nádob.
Pro odhad LOEC a tedy i NOEC vztahujících se k účinkům chemické látky na reprodukční schopnosti je nezbytné vypočíst střední hodnotu reprodukční schopnosti přes všechny paralelní nádoby pro každou koncentraci a spojený residuální rozptyl, a to lze provést analýzou rozptylu (ANOVA). Střední hodnota pro každou koncentraci musí být poté porovnána se střední hodnotou pro kontrolní skupinu, a to vhodnou metodou mnohonásobného porovnání. Užitečnými mohou být Dunnettův nebo Williamsův test (14, 15, 16, 17). Je nezbytné ověřit, že je splněn předpoklad homogenity rozptylu nezbytný pro ANOVA. Doporučuje se provést ověření raději graficky než formálním testem významnosti (18); vhodnou alternativou je Bartlettův test. Není­li tento předpoklad splněn, měla by být před provedením ANOVA zvážena transformace dat za účelem homogenizace rozptylu, nebo by měla být provedena vážená ANOVA. Vypočte a uvede se velikost účinku zjistitelná pomocí ANOVA (tj. nejmenší významný rozdíl).
Pro odhad koncentrace, která způsobuje 50% snížení reprodukční schopnosti (tj. EC
50
), se daty proloží vhodná křivka (vhodné křivky), jako např. logaritmická křivka, a to statistickou metodou, např. metodou nejmenších čtverců nebo nelineární metodou nejmenších čtverců. Křivka by měla být tak parametrizována, aby bylo možné přímo odhadnout EC
50
a její směrodatnou odchylku. To značně usnadní výpočet intervalů spolehlivosti pro hodnotu EC
50
. Pokud nejsou dobré důvody pro upřednostnění jiných intervalů spolehlivosti, uvede se oboustranný 95% interval spolehlivosti. Metoda proložení by měla pokud možno umožnit posouzení závažnosti nedostatků proložení. To lze provést graficky nebo rozdělením residuálního součtu čtverců na složku „chyby v proložení“ a „náhodné chyby“ a provedením testu významnosti chyby v proložení. Vzhledem k tomu, že u expozic, jejichž důsledkem je vyšší reprodukční schopnost, je větší rozptyl počtu vylíhnutých potomků než u expozic vedoucích k nejnižší reprodukční schopnosti, je třeba promyslet vážení pozorovaných hodnot s cílem zohlednit různé rozptyly u různě exponovaných skupin (viz výchozí informace (18)).
Při analýze dat z rozhodujícího okružního testu (2) byl použit následující model prokládající logaritmickou křivku; lze však použít i jiné modely:
             c
      Y = --------
               x
b
1 + --- x
0
kde: Y: celkový počet živých potomků na matečný organismus, který přežil do konce zkoušky (vypočteno pro každou nádobu) x: koncentrace látky c: očekávaný počet potomků při x = 0 x
0
: EC
50
v populaci b: směrnice.
Tento model bude pravděpodobně vhodný pro velký počet situací, budou však existovat zkoušky, pro něž bude nevhodný. Jak je uvedeno výše, je třeba ověřit validitu modelu. V některých případech může být vhodnější model předpokládající rozmezí, u něhož vedou nižší koncentrace k pozitivním účinkům (19).
Lze rovněž odhadnout další koncentrace s určitým účinkem, např. EC
10
nebo EC
20
, může být však dobré použít jinou parametrizaci modelu, než je použita pro odhad EC
50
.
XX.2.2 PROTOKOL O ZKOUŠCE
Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:
XX.2.2.1 Zkoušená látka:
— fyzikální povaha a relevantní fyzikálně­chemické vlastnosti,
— údaje o chemické identitě včetně údaje o čistotě.
XX.2.2.2 Testovací druhy:
— klon (byl­li geneticky popsán), dodavatel nebo zdroj (je­li znám) a použité kultivační podmínky. Byl­li použit jiný druh než Daphnia magna, musí to být uvedeno a zdůvodněno.
XX.2.2.3 Zkušební podmínky:
— použitý zkušební postup (např. semistatická nebo průtoková metoda, objem, velikost obsádky v počtu dafnií na litr),
— fotoperioda a intenzita světla,
— uspořádání zkoušky (např. počet paralelních nádob, počet matečných organismů na jednu paralelní nádobu),
— podrobnosti o použitém kultivačním médiu,
— byly­li použity, přídavky organických látek včetně jejich složení, zdroje, metody přípravy, TOC/CHSK výchozích preparátů, odhad výsledného TOC/CHSK ve zkušebním médiu,
— podrobné informace o krmení, včetně množství (v mg C na dafnii za den) a plánu (např. typ krmiva, včetně specifického názvu (druhu) u řas a kmene, je­li znám, kultivační podmínky),
— metoda přípravy zásobních roztoků a častost obnovení (jsou­li použity, uvedou se rozpouštědlo nebo dispergátor a jejich koncentrace),
XX.2.2.4 Výsledky:
— výsledky případných předběžných studií stálosti zkoušené látky,
— nominální zkušební koncentrace a výsledky všech analýz pro stanovení koncentrace zkoušené látky ve zkušebních nádobách (viz příklad formuláře pro přehled dat v dodatku 4); uvede se také výtěžek metody a mez stanovitelnosti,
— kvalita vody ve zkušebních nádobách (tj. pH, teplota, koncentrace rozpuštěného kyslíku a TOC a/nebo CHSK a dále podle potřeby tvrdost) (viz příklad formuláře pro přehled dat v dodatku 3),
— celkový počet živých potomků na každý matečný organismus (viz příklad formuláře pro přehled dat v dodatku 3),
— počet uhynulých matečných organismů a den, kdy k úhynu došlo (viz příklad formuláře pro přehled dat v dodatku 3),
— variační koeficient kontrolní reprodukční schopnosti (založený na celkovém počtu živých potomků na matečný organismus, který přežil do konce zkoušky),
— křivka závislosti celkovém počtu živých potomků na matečný organismus, který přežil do konce zkoušky (pro každou paralelní nádobu), na koncentraci zkoušené látky
— nejnižší koncentrace s pozorovanými účinky (LOEC) na reprodukci včetně popisu použitých statistických metod a údaje o velikosti účinku, který by mohl být detekován, a koncentrace bez pozorovaných účinků (NOEC) na reprodukci; je­li k dispozici, uvede se LOEC/NOEC pro mortalitu matečných organismů,
— je­li k dispozici, ECx pro reprodukci a interval spolehlivosti, dále graf křivky modelu použitého pro její výpočet, směrnice křivky závislosti dávka-reakce a její směrodatná odchylka,
— jiné pozorované biologické účinky a jiná měření: uvedou se jakékoli jiné biologické účinky, které byly pozorovány nebo změřeny (např. růst matečných organismů) včetně přiměřeného zdůvodnění,
— vysvětlení jakékoli odchylky od této zkušební metody.
XX.3 LITERATURA
(1) OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on the Daphnia magna Pilot Ring Test, Sheffield University, UK, 20. – 21. březen 1993.
(2) OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 6. Report of the Final Ring Test of the Daphnia magna Reproduction Test Paříž 1997.
(3) Baird D. J., Barber J., Bradley M. C., Soares A. M. V. M., Calow P. (1991). A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of Daphnia magna Strauss. Ecotoxicol. Environ. Safety, 21, str. 257 – 265.
(4) Elendt B. P., (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, str. 25 – 33.
(5) EPA (1993). Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. (Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C. I. Weber (ed), USEPA, Cincinnati, Ohio.
(6) Vigano L., (1991) Suitability of commercially available spring waters as standard medium for culturing Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 47, str. 775 – 782.
(7) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians. E729-88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia P.A. 20 str.
(8) Baird D. J., Soares A. M. V. M., Girling A., Barber J., Bradley M. C., Calow P. (1989). The long term maintenance of Daphnia magna Straus for use in ecotoxicological tests; problems and prospects. In: Proceedings of the 1st European Conference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H.Lokke, H. Tyle & F. Bro- Rasmussen. Eds.), str. 144 – 148.
(9) Parkhurst B. R., Forte J. L., Wright G. P. (1981). Reproducibility of a life-cycle toxicity test with Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 26, str. 1 – 8.
(10) Cowgill U. M., Milazzo D. P. (1990) The sensitivity of two cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2), str. 185 – 196.
(11) Korshikov (1990). Pseudokirchneriella subcapitata Hindak, F-1990. Biologice Prace, 36, 209.
(12) Sims I. R., Watson S., Holmes D. (1993). Toward a standard Daphnia juvenile production test. Environ. Toxicol. Chem., 12, str. 2053 – 2058.
(13) Sims I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the relationship between total organic carbon with three commonly used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, str. 459 – 466.
(14) Dunnett C. W., (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, str. 1096 – 1121.
(15) Dunnett C. W., (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, str. 482 – 491.
(16) Williams D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, str. 103 – 117.
(17) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28, str. 510 – 531.
(18) Draper N. R., Smith H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition, Wiley, N.Y.
(19) Brain P., Cousens R. (1989). An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, str. 93 – 96.
(20) Wilson E. O., Bossert, W. H. (1971). A Primer of Population Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.
(21) Poole R. W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. McGraw-Hill Series in Population Biology, New York, str. 532.
(22) Meyer J. S., Ingersoll C. G., McDonald L. L., Boyce M. S. (1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, str. 1156 – 1166.
DODATEK 1
PŘÍPRAVA PŘESNĚ DEFINOVANÝCH ELENDTOVÝCH MÉDIÍ M7 A M4
Aklimatizace na Elendtova média M7 M4
Některé laboratoře narazily na obtíže při přímém přenosu dafnií do médií M4 (1) a M7. Určitého úspěchu však bylo dosaženo postupnou aklimatizací, tj. přenesením z vlastního média do 30% Elendtova média, poté do 60% Elendtova média a nakonec do 100% Elendtova média. Délky doby aklimatizace mohou být až jeden měsíc.
PŘÍPRAVA
Stopové prvky
Ve vodě vhodné čistoty, např. v deionisované nebo destilované vodě nebo ve vodě přečištěné reverzní osmosou, se nejprve připraví samostatné zásobní roztoky (I) jednotlivých stopových prvků (I). Z těchto oddělených zásobních roztoků (I) se připraví jeden zásobní roztok (II) obsahující všechny stopové prvky (směsný roztok), tj.:
-----------------------------------------------------------
    Zásobní     Množství  Koncentrace Kombinovaný zásobní
   roztoky I     přidané                roztok II se
  (jednotlivá    do vody  (vzhledem   připraví přidáním
    látka)      (mg*l
-1
) k médiu následujícího M4) množství zásobního (násobek) roztoku I do vody (ml*l
-1
) M 4 M 7 ----------------------------------------------------------- H
3
BO
3
57 190 20 000 1,0 0,25 MnCl
2
*4H
2
O 7 210 20 000 1,0 0,25 LiCl 6 120 20 000 1,0 0,25 RbCl 1 420 20 000 1,0 0,25 SrCl
2
*6H
2
O 3 040 20 000 1,0 0,25 NaBr 320 20 000 1,0 0,25 Na
2
MoO4*2H
2
O 1 260 20 000 1,0 0,25 CuCl
2
*2H
2
O 335 20 000 1,0 0,25 ZnCl
2
260 20 000 1,0 1,0 CoCl
2
*6H
2
O 200 20 000 1,0 1,0 KI 65 20 000 1,0 1,0 Na
2
SeO
3
43,8 20 000 1,0 1,0 NH
4
VO
3
11,5 20 000 1,0 1,0 Na
2
EDTA*2H
2
O 5 000 2 000 — — FeSO
4
*7H
2
O 1 991 2 000 n — — ----------------------------------------------------------- Jak roztok Na
2
EDTA, tak roztok FeSO
4
se připraví samostatně, spojí se a ihned se autoklávují. Získají se: 2 litry roztoku 1 000 20,0 5,0 Fe-EDTA -----------------------------------------------------------
Média M4 a M7
Média  M4  a  M7  se  připraví ze zásobního  roztoku  II,
makroživin a vitaminů následujícím způsobem:
-----------------------------------------------------------
                Množství  Koncentrace Množství zásobního
                 přidané              roztoku přidané za
                 do vody  (vzhledem    účelem přípravy
                (mg*l
-1
) k médiu média M4) (ml*l
-1
) (násobek) M 4 M 7 ----------------------------------------------------------- Zásobní 20 50 50 roztok II obsahující kombinaci stopových prvků ----------------------------------------------------------- Zásobní roztok makroživin (jednotlivá látka) ----------------------------------------------------------- CaCl
2
*2H
2
O 293 800 1 000 1,0 1,0 MgSO
4
*7H
2
O 246 600 2 000 0,5 0,5 KCl 58 000 10 000 0,1 0,1 NaHCO
3
64 800 1 000 1,0 1,0 Na
2
SiO
3
*9H
2
O 50 000 5 000 0,2 0,2 NaNO
3
2 740 10 000 0,1 0,1 KH
2
PO
4
1 430 10 000 0,1 0,1 K
2
HPO
4
1 840 10 000 0,1 0,1 ----------------------------------------------------------- Kombinovaný — 10 000 0,1 0,1 vitaminový zásobní roztok ----------------------------------------------------------- Kombinovaný vitaminový zásobní roztok se připraví přidáním 3 vitaminů do 1 litru vody takto: Thiamin­hydro 750 10 000 — — chlorid Kyanokobalamin 10 10 000 — — (B
12
) Biotin 7,5 10 000 — — -----------------------------------------------------------
Kombinovaný vitaminový zásobní roztok se uchovává v malých hluboce zmrazených podílech. Vitaminy se přidají do média krátce před použitím.
Poznámky: Aby nedošlo při přípravě kompletního média
       k vysrážení solí, přidají se podíly zásobních
       roztoků do asi 500 – 800 ml deionisované vody a
       objem se poté doplní na 1 litr.
       Poprvé byly informace o médiu M4 uvedeny v práci
       Elendt, B. P. (1990). Selenium deficiency in
       crustacea; an ultrastructural approach to
       antennal damage in Daphnia magna Straus.
       Protoplasma, 154, str. 25-33.
DODATEK 2
ANALÝZA CELKOVÉHO ORGANICKÉHO UHLÍKU (TOC) A VYTVOŘENÍ NOMOGRAMU PRO OBSAH TOC V KRMIVU NA BÁZI ŘAS
Je pochopitelné, že obsah uhlíku v krmivu na bázi řas se nebude normálně měřit přímo, ale stanoví se z korelací (tj. z nomogramů) se zástupnými ukazateli, jako jsou počet buněk řas nebo absorbance ve viditelném světle. TOC by měl být stanoven spíše vysokoteplotní oxidací než pomocí UV nebo persíranovou metodou. (Viz: The Instrumental Determination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related Determinands 1979, HMSO 1980; 49 High Holborn, London WC1V 6HB).
Pro účely vytvoření nomogramu se řasy oddělí od růstového média centrifugací a poté se resuspendují v destilované vodě. Zástupný ukazatel a koncentrace TOC se měří v každém vzorku trojmo.
Provede se analýza slepého pokusu s destilovanou vodou a jeho koncentrace TOC se odečte od koncentrace TOC ve vzorku s řasami.
Nomogram by měl být lineární v požadovaném rozsahu koncentrací uhlíku. Příklady jsou uvedeny níže.
Upozornění: Tyto příklady nelze pro účely přepočtu použít; je důležité, aby si laboratoře připravily vlastní nomogramy.






DODATEK 3
PŘÍKLAD FORMULÁŘE PŘEHLEDU DAT PRO ZAZNAMENÁNÍ OBNOVY MÉDIA, SLEDOVANÝCH FYZIKÁLNĚ­CHEMICKÝCH DAT, KRMENÍ, REPRODUKČNÍ SCHOPNOSTI DAFNIÍ A MORTALITY DOSPĚLCŮ
Experiment č.:          Datum zahájení: Klon:          Médium:      Typ krmiva:
Zkoušená látka:       Nominální koncentrace:


------------------------------------------------------------------------------- -------------------
Den             0  1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18  19  20  21          
                                                                   
Obnovení  média                                                                           
(zaškrtněte)
pH1                                                                                         nové    
                                                                                            staré   

O
2
mg*l
-1
(1) nové staré Teplota (st.C)1 nové staré Podání krmiva (zaškrtněte) Počet živých Celkem potomků2 Nádoba 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ------------------------------------------------------------------------------- ------------------- Celkem Kumulativní mortalita dospělců
3
------------------------------------------------------------------------------- ------------------- 1 Uvede se, ve které nádobě bylo měření provedeno. 2 Do příslušné buňky se zaznamenají potracené plůdky jako „AB“ (aborted broods). 3 Do příslušné buňky se zaznamená mortalita dospělců jako „M“.
DODATEK 4
PŘÍKLAD FORMULÁŘE PŘEHLEDU DAT PRO ZAZNAMENÁNÍ VÝSLEDKŮ CHEMICKÉ ANALÝZY
a) Naměřené koncentrace

------------------------------------------------------------
Nominální     Vzorek         Vzorek         Vzorek
koncentrace   z týdne 1      z týdne 2      z týdne 3
------------------------------------------------------------
              Čerstvé Staré  Čerstvé  Staré  Čerstvé Staré
              médium  médium médium   médium médium  médium
------------------------------------------------------------



------------------------------------------------------------                                                   

b)   Naměřené  koncentrace  vyjádřené  v  procentech  nominální
     koncentrace
------------------------------------------------------------
Nominální     Vzorek           Vzorek         Vzorek
koncentrace   z týdne 1        z týdne 2      z týdne 3
------------------------------------------------------------
              Čerstvé  Staré  Čerstvé  Staré  Čerstvé Staré
              médium   médium médium   médium médium  médium
------------------------------------------------------------


------------------------------------------------------------   
DODATEK 5
VÝPOČET ČASOVĚ VÁŽENÉ STŘEDNÍ HODNOTY
Časově vážená střední hodnota
Vzhledem k tomu, že mezi výměnami média může koncentrace zkoušené látky klesat, je nezbytné zvážit, jaká koncentrace bude považována za reprezentativní pro rozsah koncentrací, jimž byly dospělé dafnie vystaveny. Výběr by měl být založen na biologických i statistických úvahách. Vychází­li se například z toho, že reprodukce je ovlivňována hlavně maximální koncentrací, jíž byl organismus vystaven, měla by být tedy použita maximální koncentrace. Považuje­li se však za významnější akumulované nebo dlouhodobé působení toxické látky, má větší opodstatnění průměrná koncentrace. V takovém případě je vhodným průměrem časově vážená střední koncentrace, neboť zohledňuje časové změny okamžité koncentrace.



Obrázek 1: Příklad časově vážené střední hodnoty
Na obrázku 1 je znázorněn příklad (zjednodušené) zkoušky trvající sedm dní s obnovou média v den 0, 2 a 4.
— Tenká klikatá čára znázorňuje koncentraci v kterémkoli okamžiku. Má se za to, že pokles koncentrace sleduje proces exponenciálního rozkladu buněk.
— Šest vyznačených bodů představuje koncentrace naměřené na začátku a na konci období mezi obnoveními média.
— Silná plná čára vyznačuje hodnotu časově vážené střední hodnoty.
Časově vážená střední hodnota je vypočtena tak, aby se plocha pod čarou pro časově váženou střední hodnotu rovnala ploše pod čarou průběhu koncentrace. Výpočet pro výše uvedený příklad je ilustrován v tabulce 1.
Tabulka 1: Výpočet časově vážené střední hodnoty
---------------------------------------------------------------
Obnovení Dny     Konc
0
Konc
1
ln(Konc
0
) ln(Konc
1
) Plocha média č. --------------------------------------------------------------- 1 2 10 000 4,493 2,303 1,503 13,767 2 2 11 000 6,037 2,398 1,798 16,544 3 3 10 000 4,066 2,303 1,403 19,781 --------------------------------------------------------------- Celkový počet dnů: 7 Celková 50,091 plocha ČV 7,156 střední hodnota --------------------------------------------------------------- „Dny“ se rozumí počet dnů mezi obnoveními média. „Konc
0
“ je naměřená koncentrace na začátku období mezi obnoveními média. „Konc
1
“ je naměřená koncentrace na konci období mezi obnoveními média. „ln (Konc
0
)“ je přirozený logaritmus Konc
0
. „ln (Konc
1
)“ je přirozený logaritmus Konc
1
. „Plocha“ je plocha pod exponenciální křivkou pro každé období mezi obnoveními média. Vypočte se z rovnice: Konc
0
- Konc
1
Plocha = ---------------------- x Dny ln(Konc
0
) - ln (Konc
1
)
Časově vážená střední hodnota („ČV střední hodnota“) se vypočte jako podíl „celkové plochy“ a „celkového počtu dnů“.
Pro zkoušku toxicity pro reprodukci na dafniích se tabulka pochopitelně rozšíří tak, aby pokrývala 21 dnů.
Je zřejmé, že provádí­li se měření pouze na začátku a na konci období mezi obnoveními média, není možné potvrdit, že proces rozkladu je skutečně exponenciální. Jiná křivka by vedla k jinému způsobu výpočtu „Plochy“. Exponenciální rozklad však není nepřijatelný a jemu odpovídající křivka je pravděpodobně nejideálnější, chybí­li jiné informace.
Je však nezbytné postupovat opatrně, není­li v médiu na konci období mezi jeho obnoveními zjištěno žádné množství zkušební látky. Není­li možné odhadnout, jak rychle látka z roztoku zmizela, není možné získat realistickou plochu pod křivkou a není tedy možné získat rozumnou časově váženou střední hodnotu.
XXI. METODA PRO STANOVENÍ AKTIVITY PŮDNÍCH MIKROORGANISMŮ PŘI TRANSFORMACI DUSÍKU (metoda C.21 podle přílohy směrnice 2004/73/ES ze dne 29. dubna 2004, kterou se po dvacáté deváté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek)
XXI.1. METODA
Tato zkušební metoda odpovídá metodě OECD TG 216 (2000).
XXI.1.1 ÚVOD
Tato zkušební metoda popisuje laboratorní postup pro vyšetřování dlouhodobých účinků chemických látek po jednorázové expozici na aktivitu půdních mikroorganismů při transformaci dusíku. Je založena na pokladech a doporučeních národních i mezinárodních organizací (viz literatura 1 až 7). Při posuzování a hodnocení toxických vlastností zkoušených látek může být nezbytné stanovit účinky na aktivitu půdních mikroorganismů, např. jsou-li požadovány údaje o vedlejších účincích přípravků na ochranu rostlin na půdní mikroflóru nebo očekává-li se expozice půdních mikroorganismů chemickým látkám jiným než přípravkům na ochranu rostlin. Cílem zkoušky na transformaci dusíku je zjistit účinky takových chemických látek na půdní mikroflóru. Pokud se zkoušejí agrochemikálie (např. přípravky na ochranu rostlin, hnojiva, chemické přípravky pro lesnictví), provádí se jak zkouška na transformaci dusíku, tak zkouška na transformaci uhlíku. Pokud se zkoušejí jiné chemické látky než agrochemikálie, postačuje zkouška na transformaci dusíku. Nacházejí-li se však u těchto chemických látek hodnoty EC
50
pro transformaci dusíku v rozpětí hodnot nacházených pro komerčně dostupné inhibitory nitrifikace (např. nitrapyrin), lze pro získání dalších informací provést zkoušku na transformaci uhlíku. Půdy se skládají z živých a neživých složek, které se vyskytují ve formě složitých a heterogenních směsí. Mikroorganismy hrají důležitou roli v rozkladu a transformaci organických látek v úrodných půdách, přičemž různé druhy přispívají k různým aspektům úrodnosti půdy. Jakékoli dlouhodobé porušení těchto biochemických procesů by mohlo porušit koloběh živin a to by mohlo mít vliv na úrodnost půdy. K transformaci uhlíku a dusíku dochází u všech úrodných půd. Ačkoliv se populace mikroorganismů odpovědných za tyto procesy u jednotlivých půd liší, jedná se v podstatě o totéž schéma transformace.
Popsaná zkušební metoda slouží ke zjištění dlouhodobých nepříznivých účinků látky na proces transformace dusíku v aerobních povrchových půdách. Tato metoda rovněž umožňuje odhadnout účinky látek na transformaci uhlíku půdní mikroflórou. K tvorbě dusičnanů dochází po rozpadu vazeb uhlík-dusík. Pokud je tedy u zkušebních a kontrolních půd zjištěna stejná rychlost tvorby dusičnanů, je vysoce pravděpodobné, že hlavní schéma odbourávání uhlíku je neporušené a funkční. Substrát zvolený pro zkoušku (prášková vojtěšková moučka) má příznivý poměr uhlíku a dusíku (obvykle od 12/1 do 16/1). Je tedy snížen nedostatek uhlíku v průběhu zkoušky, a dojde-li k poškození populace mikroorganismů chemickou látkou, může k jejich obnově dojít opět do 100 dnů.
Zkouška, na níž je založena tato zkušební metoda, byla zprvu vyvinuta pro látky, u nichž lze předvídat množství, které pronikne do půdy. Příkladem jsou přípravky na ochranu rostlin, u nichž je polní aplikační dávka známá. U agrochemikálií postačuje provést zkoušku se dvěma úrovněmi dávky, které odpovídají předpokládané nebo odhadované aplikační dávce. U agrochemikálií lze zkoušet účinné složky nebo přípravky v komerční úpravě. Použití zkoušky však není omezeno pouze na agrochemikálie. Změnou množství zkoušené látky aplikované na půdu a způsobu vyhodnocení dat lze zkoušku využít také pro chemické látky, u nichž není známo, v jakém množství proniknou do půdy. U jiných chemických látek než agrochemikálií se tedy stanovuje účinek řady koncentrací na transformaci dusíku. Data z těchto zkoušek se použijí k sestrojení křivky závislosti odezvy na dávce a k výpočtu hodnot EC
x
, kde x je procentuální účinek.
XXI.1.2 DEFINICE
Transformace dusíku: je konečný rozklad dusíkaté organické látky mikroorganismy cestou amonifikace a nitrifikace na příslušný konečný anorganický produkt – dusičnan.
EC
x
(Účinná koncentrace): je koncentrace zkoušené látky v půdě, která vede k x-procentní inhibici transformace dusíku na dusičnan.
EC
50
(Medián účinné koncentrace): je koncentrace zkoušené látky v půdě, která vede k 50% inhibici transformace dusíku na dusičnan.
XXI.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Žádné.
XXI.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Do proseté půdy se vpraví prášková rostlinná moučka a na půdu se poté aplikuje zkoušená látka, nebo se půda ponechá nedotčená (jako kontrola). Při zkoušení agrochemikálií se doporučuje provést zkoušku s nejméně dvěma koncentracemi zvolenými tak, aby byly v určitém vztahu k nejvyšší předpokládané koncentrací na poli. Po 0, 7, 14 a 28 dnech inkubace se vzorky exponované a kontrolní půdy vyluhují vhodným rozpouštědlem a stanoví se obsah dusičnanů. Rychlost tvorby dusičnanů v exponovaných vzorcích se porovnává s rychlostí v kontrolních vzorcích a vypočte se procentuální odchylka hodnot experimentálních vzorků od kontrolních vzorků. Všechny zkoušky musí probíhat alespoň 28 dnů. Jsou-li 28. den rozdíly mezi experimentální a kontrolní půdou 25 % nebo větší, v měření se pokračuje až do 100 dnů. Při zkoušení jiných látek než agrochemikálií se do vzorků půdy přidá řada koncentrací zkoušené látky a množství vzniklých dusičnanů v experimentálních a kontrolních vzorcích se měří po 28denní inkubaci. Výsledky zkoušek s více koncentracemi se analyzují za použití regresního modelu a vypočtou se hodnoty EC
x
(tj. EC
50
, EC25 a/nebo EC10). Viz definice.
XXI.1.5 VALIDITA ZKOUŠKY
Vyhodnocení výsledků zkoušek u agrochemikálií se provádí s relativně malými rozdíly (tj. průměrná hodnota +-25 %) mezi koncentracemi dusičnanů v kontrolní a exponovaných vzorcích, takže velké kolísání u kontrolních vzorků může vést k nesprávným výsledkům. Rozdíly mezi jednotlivými kontrolními vzorky by proto měly být menší než +/-15 %.
XXI.1.6 POPIS METODY
XXI.1.6.1 Zkušební zařízení
Nádoby použité ve zkoušce musí být z chemicky inertního materiálu. Měly by mít vhodný objem, která by měl odpovídat postupu použitému pro inkubaci půdy, tzn. buď inkubace celého množství půdy, nebo inkubace jednotlivých vzorků půdy (viz oddíl 1.7.1.2). Je třeba, aby během zkoušky došlo k co nejmenším ztrátám vody a aby byla umožněna výměna plynů (např. tím, že se nádoby zakryjí perforovanou polyethylenovou fólií). Při zkoušení těkavých látek se použijí uzavřené plynotěsné nádoby. Měly by být tak velké, aby přibližně jedna čtvrtina jejich objemu byla zaplněna vzorkem půdy.
Použije se standardní laboratorní vybavení, které zahrnuje
— třepačku: mechanickou třepačku nebo rovnocenné vybavení;
— odstředivku (3 000 g) nebo filtrační zařízení (za použití filtračního papíru bez dusičnanů);
— měřicí zařízení pro stanovení dusičnanů s vhodnou citlivostí a reprodukovatelností.
XXI.1.6.2 Výběr a počet půd
Použije se jedna půda. Půda by měla mít tyto charakteristiky:
— obsah písku: nejméně 50 % a nejvýše 75 %;
— pH: 5,5 – 7,5;
— obsah organického uhlíku: 0,5 – 1,5 %;
— stanoví se mikrobiální biomasa (viz literatura 8, 9) a její uhlík by měl tvořit nejméně 1 % celkového organického uhlíku v půdě.
Ve většině případů představuje půda s těmito charakteristikami nejkonzervativnější případ, neboť adsorpce zkoušené chemické látky je minimální a její dostupnost pro mikroorganismy je maximální. V důsledku toho je zpravidla zkoušení s dalšími půdami zbytečné. Za určitých okolností však může být použití další půdy nezbytné, např. při zamýšleném hlavním použití zkoušené látky na určité druhy půd, jako jsou kyselé lesní půdy nebo v případě elektrostaticky nabitých chemikálií.
XXI.1.6.3 Odběr a skladování vzorků půd
XXI.1.6.3.1 Odběr
K dispozici by měly být podrobné informace o historii místa, ze kterého je půda odebírána. Mezi těmito informacemi musí být přesná poloha, vegetace, údaje o ošetřování přípravky na ochranu rostlin, použití organických a minerálních hnojiv, přídavky biologického materiálu nebo náhodná kontaminace. Pro odběr půdy by mělo být zvoleno místo, které umožňuje dlouhodobé používání. Vhodnými místy jsou trvalé pastviny, pole s jednoletými kulturními plodinami (kromě kukuřice) nebo hustě oseté plochy zeleného hnojení. Místa vybraná pro odběr vzorků by neměla být minimálně jeden rok před odběrem ošetřována přípravky na ochranu rostlin. Rovněž by neměla být alespoň šest měsíců použita organická hnojiva. Použití minerálních hnojiv je přípustné pouze tehdy, je-li to nezbytné pro plodiny, a vzorky půdy by neměly být odebírány dříve než po třech měsících po aplikaci. Neměly by být používány půdy s hnojivy, o nichž je známo, že mají biocidní účinky (např. kyanamid vápenatý).
Vzorky by neměly být odebírány při dlouhých obdobích sucha nebo zavodnění (delších než 30 dnů) nebo po nich. Vzorky orných půd se odebírají z hloubky 0 až 20 cm. U luk (pastvin) nebo jiných půd, u nichž po delší dobu (alespoň po jedno vegetační období) nebyla prováděna orba, může maximální hloubka odběru nepatrně překračovat 20 cm (např. až 25 cm).
Vzorky půd by měly být přepravovány v takových nádobách a za takové teploty, aby bylo zaručeno, že se původní vlastnosti půdy významně nezmění.
XXI.1.6.3.2 Skladování
Upřednostňuje se použití čerstvě odebrané půdy. Pokud je skladování půdy v laboratoři nevyhnutelné, může být skladována v temnu při (4 +- 2) st.C maximálně po dobu tří měsíců. Během skladování půd musí být zajištěny aerobní podmínky. Pokud jsou půdy odebírány z oblastí, v nichž jsou po dobu alespoň tří měsíců v roce zmrzlé, lze zvážit šestiměsíční skladování při ­18 st.C až ­22 st.C. Před každým experimentem se stanoví mikrobiální biomasa skladovaných půd a uhlík pocházející z biomasy by měl tvořit nejméně 1 % celkového organického uhlíku v půdě (viz oddíl 1.6.2).
XXI.1.6.4 Zacházení s půdou a její příprava pro zkoušku
XXI.1.6.4.1 Předběžná inkubace
Pokud byla půda skladována (viz oddíl 1.6.3.2), doporučuje se provést předběžnou inkubaci v délce 2 až 28 dnů. Teplota a vlhkost půdy během předběžné inkubace by měly být podobné podmínkám při zkoušce (viz oddíly 1.6.4.2 a 1.7.1.3).
XXI.1.6.4.2 Fyzikálně-chemické charakteristiky
Z půdy se ručně odstraní velké kusy (např. kameny, části rostlin atd.) a poté se za vlhka, aniž je půda nadměrně vysoušena, prosejí částice o velikosti 2 mm a menší. Vlhkost vzorku půdy se upraví destilovanou nebo deionizovanou vodou na hodnotu 40 % až 60 % maximální vodní kapacity.
XXI.1.6.4.3 Obohacení organickým substrátem
Půda by měla být obohacena vhodným organickým substrátem, např. zelenou travní moučkou s vojtěškou (hlavní složka: Medicago sativa) s poměrem C/N od 12/1 do 16/1. Doporučená dávka vojtěškové moučky je 5 g vojtěšky na kilogram půdy (vztaženo na sušinu).
XXI.1.6.5 Příprava zkoušené látky pro aplikaci na půdu
Zkoušená látka se obvykle aplikuje pomocí nosiče. Nosičem může být voda (u látek rozpustných ve vodě) nebo inertní tuhá látka, např. jemný křemičitý písek (velikost zrna: 0,1 – 0,5 mm). Jiné kapalné nosiče než voda (např. organická rozpouštědla jako aceton, chloroform) by neměly být používány, neboť mohou zničit mikroflóru. Použije-li se jako nosič písek, může být obalen zkoušenou látkou rozpuštěnou nebo rozptýlenou ve vhodném rozpouštědle. V takovém případě se rozpouštědlo před smísením s půdou odstraní odpařením. Pro optimální distribuci zkoušené látky v půdě se doporučuje použít 10 g písku na kilogram půdy (vztaženo na sušinu). Do kontrolních vzorků se aplikuje pouze odpovídající množství vody a/nebo písku.
Při zkoušení těkavých chemických látek je třeba pokud možno zabránit ztrátám při aplikaci a pokusit se o homogenní rozptýlení látky v půdě (látka se např. nastříkne do půdy na více místech).
XXI.1.6.6 Zkušební koncentrace
Při zkoušení agrochemikálií se použijí alespoň dvě koncentrace. Nižší koncentrace by měla odpovídat přinejmenším maximálnímu očekávanému množství látky, které se v reálných podmínkách dostane do půdy, zatímco vyšší koncentrace by měla být násobkem nižší koncentrace. Výpočet koncentrace zkoušené látky přidávané do půdy se provede za předpokladu rovnoměrného zapravení do hloubky 5 cm a pro sypnou hustotu půdy 1,5. U agrochemikálií, které se aplikují přímo do půdy, nebo u chemikálií, u nichž lze množství, které se dostane do půdy, předpovědět, jsou doporučenými zkušebními koncentracemi maximální předpokládané koncentrace v životním prostředí (Predicted Environmental Concentration, PEC) a jejich pětinásobky. U látek, které se zpravidla aplikují do půdy několikrát za sezónu, se zkušební koncentrace odvodí ze součinu PEC a očekávaného maximálního počtu aplikací. Horní koncentrace by však neměla překročit desetinásobek maximální jednorázově aplikované dávky. U jiných látek než agrochemikálií se použije geometrická řada nejméně pěti koncentrací. V rozpětí těchto zkušebních koncentrací by se měly nacházet stanovované hodnoty EC
x
.
XXI.1.7 PROVEDENÍ ZKOUŠKY
XXI.1.7.1 Podmínky expozice
XXI.1.7.1.1 Expozice a kontrola
Při zkoušení agrochemikálií se půda rozdělí na tři díly o stejné hmotnosti. Dva díly se smísí s nosičem obsahujícím látku a třetí díl se smísí pouze s nosičem (kontrola). Doporučuje se, aby byla zkouška provedena s minimálně třemi duplikátními vzorky exponovaných i neexponovaných půd. Při zkoušení jiných látek než agrochemikálií se půda rozdělí na šest dílů o stejné hmotnosti. Pět vzorků se smísí s nosičem obsahujícím zkoušenou látku a šestý vzorek se smísí pouze s nosičem bez chemické látky. Doporučuje se použít tři duplikátní vzorky exponované i neexponované půdy. Je třeba věnovat pozornost homogennímu rozptýlení zkoušené látky v exponovaných vzorcích půdy. Při míšení by nemělo docházet k hutnění nebo shlukování půdy.
XXI.1.7.1.2 Inkubace vzorků půd
Inkubaci vzorků půd lze provést dvěma způsoby: se souhrnným vzorkem exponované půdy a souhrnným vzorkem neexponované půdy, nebo se sériemi jednotlivých stejně velkých dílčích vzorků jak exponované, tak neexponované půdy. U těkavých látek se však zkouška provádí pouze se sériemi jednotlivých dílčích vzorků. Pokud se inkubují souhrnné vzorky, připraví se velká množství exponované a neexponované půdy a během zkoušky se podle potřeby odebírají dílčí vzorky k analýze. Výchozí množství připravené pro exponované vzorky a kontrolní vzorky závisí na velikosti dílčích vzorků, počtu duplikátních vzorků použitých pro analýzu a na předpokládaném počtu intervalů, v nichž se odeberou vzorky. Půdy inkubované jako souhrnný vzorek se před odběrem dílčích vzorků důkladně promísí. Pokud se inkubují série jednotlivých vzorků půd, rozdělí se souhrnný vzorek exponované půdy a souhrnný vzorek neexponované půdy na požadovaný počet dílčích vzorků a ty se použijí podle potřeby. U experimentů, kdy lze předpokládat více než dva intervaly odběru, by měl být připraven dostatečný počet dílčích vzorků s ohledem na všechny duplikátní vzorky a všechny intervaly odběru. Alespoň tři duplikátní vzorky zkušební půdy měly být inkubovány za aerobních podmínek (viz oddíl 1.7.1.1). U všech zkoušek by měly být použity vhodné nádoby s dostatečným prostorem pod víkem, aby nenastaly anaerobní podmínky. U těkavých látek se zkouška provádí pouze se sériemi jednotlivých dílčích vzorků.
XXI.1.7.1.3 Podmínky zkoušky a její trvání
Zkouška se provádí v temnu při pokojové teplotě (20 +/- 2) st.C. Vlhkost vzorku půdy se udržuje po dobu zkoušky v rozmezí 40 % až 60 % (+-5 %) maximální vodní kapacity půdy (viz oddíl 1.6.4.2). Podle potřeby se přidává destilovaná nebo deionizovaná voda.
Zkoušky trvají nejméně 28 dnů. Při zkouškách agrochemikálií se porovnávají rychlosti tvorby dusičnanů v exponovaných a kontrolních vzorcích. Pokud se 28. dne tyto rychlosti liší o více než 25 %, pokračuje se ve zkoušce do doby, než rozdíl klesne na 25 % a méně, nebo do 100 dnů, podle toho, co nastane dříve. U jiných látek než agrochemikálií se zkouška ukončí po 28 dnech. 28. den se stanoví množství dusičnanů v exponovaných a kontrolních vzorcích a vypočítají se hodnoty EC
x
.
XXI.1.7.2 Odběry vzorků a analýzy půd
XXI.1.7.2.1 Intervaly odběru vzorků
Při zkoušení agrochemikálií se obsah dusičnanů ve vzorcích analyzuje v 0., 7., 14. a 28. den. Pokud se zkouška prodlužuje, provede se další měření ve 14-denních intervalech po 28. dni.
Při zkoušení jiných látek než agrochemikálií se použije alespoň pět zkušebních koncentrací a obsah dusičnanů se ve vzorcích půd analyzuje na začátku expoziční doby (den 0) a na jeho konci (po 28 dnech). Je-li to považováno za nezbytné, lze provést další mezilehlé měření, např. v 7. den. Data získaná 28. den se použijí pro stanovení EC
x
chemické látky. Podle potřeby lze data ze dne 0 u kontrolních vzorků použít ve zprávě jako výchozí koncentraci dusičnanů v půdě.
XXI.1.7.2.2 Analýza vzorků půd
Pro každý čas odběru vzorků se v exponovaných i kontrolních vzorcích stanoví obsah dusičnanů. Dusičnany se extrahují ze vzorků třepáním s vhodným extrakčním roztokem, např. s 0,1M roztokem chloridu draselného. Doporučuje se použít 5 ml roztoku KCl na gram sušiny půdy. Při optimální extrakci by měly být nádoby s půdou a extrakčním roztokem naplněny nejvýše z jedné poloviny. Směsi se extrahují třepáním při 150 ot./min. po dobu 60 minut. Směsi se odstředí nebo zfiltrují a kapalná fáze se analyzuje na dusičnany. Kapalný extrakt zbavený pevných částic lze před analýzou skladovat při (­20 +/-5) st.C po dobu šesti měsíců.
XXI.2. DATA
XXI.2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ
Při zkoušení agrochemikálií se zaznamená množství vytvořených dusičnanů v každém duplikátním vzorku a průměrné hodnoty se zaznamenají do tabulky. Rychlost přeměny dusíku se vyhodnotí vhodnými všeobecně uznávanými statistickými metodami (např. F-testem na 5 % hladině významnosti). Množství vzniklých dusičnanů se vyjádří v mg dusičnanů na kg sušiny půdy za den. Rychlost tvorby dusičnanů se pro každou expozici porovná s rychlostí získanou pro kontrolní vzorky a vypočte se odchylka od kontrolních vzorků v procentech.
Při zkoušení jiných látek než agrochemikálií se stanoví množství dusičnanů v každém duplikátním vzorku a pro účely odhadu hodnot EC
x
se sestrojí křivka závislosti odezvy na dávce. Množství dusičnanů (tj. množství dusičnanů v mg na kg sušiny půdy) zjištěná v exponovaných vzorcích po 28 dnech se porovnají s hodnotami zjištěnými u kontrolních vzorků. Z těchto údajů se pro každou zkušební koncentraci vypočte velikost inhibice v procentech. Tyto hodnoty v procentech se vynesou do grafu proti koncentraci a poté se statistickými metodami vypočítají hodnoty EC
x
. Standardními metodami (viz literatura 10 až 12) se rovněž vypočítají intervaly spolehlivosti (p = 0,95) pro vypočtené hodnoty EC
x
. Zkoušené látky s vysokým obsahem dusičnanů mohou přispívat k množství dusičnanu vytvořeného při zkoušce. Pokud se zkouší vysoké koncentrace těchto látek (např. chemikálie, u nichž se očekává opakované použití), musí být součástí zkoušky vhodné kontrolní vzorky (tj. půda a zkoušená látka bez rostlinné moučky). Data z těchto kontrol musí být zohledněna při výpočtech EC
x
.
XXI.2.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ
Pokud je při hodnocení výsledků zkoušek s agrochemikáliemi při jakémkoli odběru po 28 dnech rozdíl rychlosti tvorby dusičnanů při nižší expozici (tj. při maximální očekávané koncentraci) a rychlosti tvorby v kontrolách roven 25 % nebo nižší, lze konstatovat, že zkoušená látka nemá dlouhodobý vliv na transformaci dusíku v půdách. Pro hodnocení výsledků zkoušek jiných látek než agrochemikálií se použijí hodnoty EC
50
, EC25 a/nebo EC10.
XXI.3. ZPRÁVY
Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:
Úplnou identifikaci použité půdy zahrnující tyto údaje:
— zeměpisná poloha místa (zeměpisná šířka a délka);
— informace a historii místa (tj. vegetační kryt, ošetření přípravky na ochranu rostlin, použití hnojiv, náhodná kontaminace atd.);
— způsob využití (např. zemědělská půda, les atd.);
— hloubka odběru vzorků (cm);
— obsah písku/prachu/jílu (v % sušiny);
— pH (ve vodě);
— obsah organického uhlíku (v % sušiny);
— obsah dusíku (v % sušiny);
— výchozí koncentrace dusičnanů (mg dusičnanů na kg sušiny);
— kapacita iontové výměny (mmol/kg);
— mikrobiální biomasa v procentech celkového organického uhlíku;
— odkaz na metody použité pro stanovení každého z parametrů;
— všechny informace týkající se odběru a skladování vzorků půd;
— podrobné údaje o případné předběžné inkubaci půdy.
Zkoušená látka:
— fyzikální povaha a případně fyzikálně- chemické vlastnosti;
— případně údaje o chemické identitě, včetně strukturního vzorce, čistoty (tj. procentuální obsah účinné složky u přípravků na ochranu rostlin), obsahu dusíku.
Substrát:
— zdroj substrátu;
— složení (tj. vojtěšková moučka, zelená travní moučka s vojtěškou);
— obsah uhlíku, dusíku (v % sušiny);
— velikost síta (mm).
Zkušební podmínky:
— podrobné údaje o obohacení půdy organickým substrátem;
— počet použitých koncentrací zkoušené látky, popřípadě zdůvodnění volby koncentrací;
— podrobné údaje o aplikaci zkoušené látky na půdu;
— inkubační teplota;
— vlhkost půdy na začátku zkoušky a v jejím průběhu;
— použitá metoda inkubace půdy (tj. inkubace souhrnného vzorku, nebo inkubace jednotlivých dílčích vzorků půdy);
— počet duplikátních vzorků;
— doby odběru vzorků;
— metoda použitá pro extrakci dusičnanů z půdy.
Výsledky:
— postup analýzy a zařízení použité pro stanovení dusičnanů;
— jednotlivé naměřené hodnoty obsahu dusičnanů a jejich průměrné hodnoty v tabulkové formě;
— rozdíly mezi duplikátními vzorky u exponovaných a kontrolních vzorků půd;
— podle potřeby vysvětlení oprav provedených při výpočtech;
— procentuální odchylka v rychlosti tvorby dusičnanů pro každou dobu odběru vzorků, popřípadě hodnota EC
50
s 95% intervalem spolehlivosti, jiné hodnoty EC
x
(tj. EC
25
nebo EC
10
) s intervaly spolehlivost a graf křivky závislosti odpovědi na dávce;
— statistické zpracování výsledků;
— všechny informace a pozorování užitečné pro interpretaci výsledků.
XXI.4. LITERATURA
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1 – 16, 1994.
(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1 – 1 (2. vyd., 1990).
(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. 28. září, 1987.
(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, (vyd. M. R. Lynch), Pub. SETAC- Europe, Brussels.
(5) ISO 14238 (1997). Soil Quality – Determination of Nitrogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the Influence of Chemicals on these Processes. Technical Committee ISO/TC 190/SC 4.
(6) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18.-20. ledna 1995.
(7) ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
(8) ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrate-induced respiration method.
(9) ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.
(10) Litchfield, J. T., Wilcoxon F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. Exper. Ther., 96, 99 – 113.
(11) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis, 3. vyd., Cambridge, London, New York.
(12) Finney, D. J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK.
XXII. METODA PRO STANOVENÍ AKTIVITY PŮDNÍCH MIKROORGANISMŮ PŘI TRANSFORMACI UHLÍKU (metoda C.22 podle přílohy směrnice 2004/73/ES ze dne 29. dubna 2004, kterou se po dvacáté deváté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek)
XXII.1.METODA
Tato metoda odpovídá metodě OECD TG 217 (2000).
XXII.1.1 ÚVOD
Tato zkušební metoda popisuje laboratorní postup pro vyšetřování možných dlouhodobých účinků jednorázové expozice přípravkům na ochranu rostlin a popřípadě jiným chemický látkám na aktivitu půdních mikroorganismů při transformaci uhlíku. Je založena na podkladech a doporučeních národních i mezinárodních organizací (viz literatura 1 až 6). Při posuzování a hodnocení toxických vlastností zkoušených látek může být nezbytné stanovit účinky na aktivitu půdních mikroorganismů, např. jsou-li požadovány údaje o vedlejších účincích přípravků na ochranu rostlin na půdní mikroflóru nebo očekává-li se expozice půdních mikroorganismů chemickým látkám jiným než přípravkům na ochranu rostlin. Cílem zkoušky na transformaci uhlíku je zjistit účinky takových chemických látek na půdní mikroflóru. Pokud se zkoušejí agrochemikálie (např. přípravky na ochranu rostlin, hnojiva, chemické přípravky pro lesnictví), provádí se jak zkouška na transformaci uhlíku, tak zkouška na transformaci dusíku. Pokud se zkoušejí jiné chemické látky než agrochemikálie, postačuje zkouška na transformaci dusíku. Nacházejí-li se však u těchto chemických látek hodnoty EC
50
pro transformaci dusíku v rozpětí hodnot nacházených pro komerčně dostupné inhibitory nitrifikace (např. nitrapyrin), lze pro získání dalších informací provést zkoušku na transformaci uhlíku. Půdy se skládají z živých a neživých složek, které se vyskytují ve formě složitých a heterogenních směsí. Mikroorganismy hrají důležitou roli v rozkladu a transformaci organických látek v úrodných půdách, přičemž různé druhy přispívají k různým aspektům úrodnosti půdy. Jakékoli dlouhodobé porušení těchto biochemických procesů by mohlo porušit koloběh živin a to by mohlo mít vliv na úrodnost půdy. K transformaci uhlíku a dusíku dochází u všech úrodných půd. Ačkoliv se populace mikroorganismů odpovědných za tyto procesy u jednotlivých půd liší, jedná se v podstatě o totéž schéma transformace.
Popsaná zkušební metoda slouží ke zjištění dlouhodobých nepříznivých účinků látky na proces transformace uhlíku v aerobních povrchových půdách. Zkouška je citlivá na změny ve velikosti a aktivitě mikrobiální populace, která je odpovědná za transformaci uhlíku, neboť tyto populace budou vystaveny jak chemickému stresu, tak nedostatku uhlíku. Použijí se písčité půdy s nízkým obsahem organického materiálu. Tyto půdy se exponují zkoušené látce a inkubují se za podmínek, které umožňují rychlý mikrobiální metabolismus. Za těchto podmínek se zdroje snadno dostupného uhlíku rychle vyčerpají. To způsobí nedostatek uhlíku, který vede k nejen k odumření mikrobiálních buněk, ale také indukuje klidové stadium a/nebo tvorbu sporů. Pokud se zkouška provádí déle než 28 dnů, lze souhrn těchto reakcí měřit v kontrolních vzorcích (neexponovaná půda) jako postupnou ztrátu metabolicky aktivní mikrobiální biomasy (viz literatura 7). Pokud je biomasa v půdě s nedostatkem uhlíku za podmínek zkoušky ovlivněna přítomností chemické látky, pravděpodobně se nevrátí do téhož stavu jako kontrolní vzorek. Porušení stavu způsobené zkoušenou látkou kdykoliv během zkoušky tedy často přetrvává až do konce zkoušky.
Zkouška, na níž je založena tato zkušební metoda, byla zprvu vyvinuta pro látky, u nichž lze předvídat množství, které pronikne do půdy. Příkladem jsou přípravky na ochranu rostlin, u nichž je polní aplikační dávka známá. U agrochemikálií postačuje provést zkoušku se dvěma úrovněmi dávky, které odpovídají předpokládané nebo odhadované aplikační dávce. U agrochemikálií lze zkoušet účinné složky nebo přípravky v komerční úpravě. Zkouška však není omezena na chemické látky, jejichž koncentraci v životním prostředí lze předpovědět. Změnou množství zkoušené látky aplikované na půdu a způsobu vyhodnocení dat lze zkoušku využít také pro chemické látky, u nichž není známo, v jakém množství proniknou do půdy. U jiných chemických látek než agrochemikálií se proto stanovuje účinek řady koncentrací na transformaci uhlíku. Data z těchto zkoušek se použijí k sestrojení křivky závislosti odezvy na dávce a k výpočtu hodnot EC
x
, kde x je procentuální účinek.
XXII.1.2 DEFINICE
Transformace uhlíku: je rozklad organického materiálu působením mikroorganismů, jehož výsledkem je anorganický konečný produkt oxid uhličitý.
EC
x
(Účinná koncentrace): je koncentrace zkoušené látky v půdě, která vede k x-procentní inhibici transformace uhlíku na oxid uhličitý.
EC
50
(Medián účinné koncentrace): je koncentrace zkoušené látky v půdě, která vede k 50% inhibici transformace uhlíku na oxid uhličitý.
XXII.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Žádné.
XXII.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Prosetá půda se buď exponuje zkušební látce, nebo se ponechá neexponovaná (kontrola). Při zkoušení agrochemikálií se doporučuje provést zkoušku s nejméně dvěma koncentracemi zvolenými tak, aby byly v určitém vztahu k nejvyšší předpokládané koncentraci na poli. Po 0, 7, 14 a 28 dnech inkubace se vzorky exponované a kontrolní půdy smísí s glukosou a po následujících 12 h se měří respirační rychlost vyvolaná glukosou. Respirační rychlost se vyjádří jako uvolněný oxid uhličitý (v mg oxidu uhličitého na kg sušiny za hodinu) nebo jako spotřebovaný kyslík (v mg kyslíku na kg půdy za hodinu). Průměrná respirační rychlost u exponovaných vzorků půd se porovná s rychlostí u kontrolních vzorků a vypočte se procentuální odchylka exponovaných vzorků od kontrolních vzorků. Všechny zkoušky musí probíhat alespoň 28 dnů. Jsou-li 28. den rozdíly mezi experimentální a kontrolní půdou rovné 25 % nebo větší, v měření se pokračuje ve 14-denních intervalech nejdéle do 100 dnů. Při zkoušení jiných chemických látek než agrochemikálií se do vzorků půdy přidá řada koncentrací zkoušené látky a respirační rychlost vyvolaná glukosou (tj. průměrné množství uvolněného oxidu uhličitého nebo spotřebovaného kyslíku) se změří po 28 dnech. Výsledky zkoušek s řadou koncentrací se analyzují za použití regresního modelu a vypočtou se hodnoty EC
x
(tj. EC
50
, EC25 a/nebo EC10). Viz definice.
XXII.1.5 VALIDITA ZKOUŠKY
Vyhodnocení výsledků zkoušek u agrochemikálií se provádí s relativně malými rozdíly (tj. průměrná hodnota +-25 %) mezi uvolněným oxidem uhličitým nebo spotřebovaným kyslíkem u kontrolních a exponovaných vzorků, takže velké kolísání u kontrolních vzorků může vést k nesprávným výsledkům. Rozdíly mezi jednotlivými kontrolními vzorky by proto měly být menší než +/-15 %.
XXII.1.6 POPIS METODY
XXII.1.6.1 Zkušební zařízení
Nádoby použité ve zkoušce musí být z chemicky inertního materiálu. Měly by mít vhodný objem, který by měl odpovídat postupu použitému pro inkubaci půdy, tzn. buď inkubace souhrnného vzorku půdy, nebo inkubace jednotlivých vzorků půdy (viz oddíl 1.7.1.2). Je třeba, aby během zkoušky došlo k co nejmenším ztrátám vody a aby byla umožněna výměna plynů (např. tím, že se nádoby zakryjí perforovanou polyethylenovou fólií). Při zkoušení těkavých látek se použijí uzavřené plynotěsné nádoby. Měly by být tak velké, aby přibližně jedna čtvrtina jejich objemu byla zaplněna vzorkem půdy.
Pro stanovení respirace vyvolané glukosou jsou nezbytné inkubační systémy a přístroje pro měření uvolňovaného oxidu uhličitého nebo spotřeby kyslíku. Příklady takových systémů lze nalézt v literatuře 8 až 11.
XXII.1.6.2 Výběr a počet půd
Použije se jedna půda. Půda by měla mít tyto charakteristiky:
— obsah písku: nejméně 50 % a nejvýše 75 %;
— pH: 5,5 – 7,5;
— obsah organického uhlíku: 0,5 – 1,5 %;
— stanoví se mikrobiální biomasa (viz literatura 12 a 13) a její obsah uhlíku by měl tvořit nejméně 1 % celkového organického uhlíku v půdě.
Ve většině případů představuje půda s těmito charakteristikami nejkonzervativnější případ, neboť adsorpce zkoušené chemické látky je minimální a její dostupnost pro mikroorganismy je maximální. V důsledku toho je zpravidla zkoušení s dalšími půdami zbytečné. Za určitých okolností může být nezbytné nasazení další půdy, např. při zamýšleném hlavním použití zkoušené látky na určité druhy půd, jako jsou kyselé lesní půdy nebo v případě elektrostaticky nabitých chemikálií.
XXII.1.6.3 Odběr a skladování vzorků půd
XXII.1.6.3.1 Odběr
K dispozici by měly být podrobné informace o historii místa, ze kterého je půda odebírána. Mezi těmito informacemi musí být přesná poloha, vegetace, údaje o ošetřování přípravky na ochranu rostlin, použití organických a minerálních hnojiv, přídavky biologického materiálu nebo náhodná kontaminace. Pro odběr půdy by mělo být zvoleno místo, které umožňuje dlouhodobé používání. Vhodnými místy jsou trvalé pastviny, pole s jednoletými kulturními plodinami (kromě kukuřice) nebo hustě oseté plochy zeleného hnojení. Místa vybraná pro odběr vzorků by neměla být minimálně jeden rok před odběrem ošetřována přípravky na ochranu rostlin. Rovněž by neměla být alespoň šest měsíců použita organická hnojiva. Použití minerálních hnojiv je přípustné pouze tehdy, je-li to nezbytné pro plodiny, a vzorky půdy by neměly být odebírány dříve než po třech měsících po aplikaci. Neměly by být používány půdy s hnojivy, o nichž je známo, že mají biocidní účinky (např. kyanamid vápenatý).
Vzorky by neměly být odebírány při dlouhých obdobích sucha nebo zavodnění (delších než 30 dnů) nebo po nich. Vzorky orných půd se odebírají z hloubky 0 až 20 cm. U luk (pastvin) nebo jiných půd, u nichž po delší dobu (alespoň po jedno vegetační období) nebyla prováděna orba, může maximální hloubka odběru mírně překračovat 20 cm (např. až 25 cm). Vzorky půd by měly být přepravovány v takových nádobách a za takové teploty, aby bylo zaručeno, že se původní vlastnosti půdy významně nezmění.
XXII.1.6.3.2 Skladování
Upřednostňuje se použití čerstvě odebrané půdy. Pokud je skladování půdy v laboratoři nevyhnutelné, může být skladována v temnu při (4 +- 2) st.C po dobu maximálně tří měsíců. Během skladování půd musí být zajištěny aerobní podmínky. Pokud jsou půdy odebírány z oblastí, v nichž jsou po dobu alespoň tří měsíců v roce zmrzlé, lze zvážit šestiměsíční skladování při ­18 st.C. Před každým experimentem se stanoví mikrobiální biomasa skladovaných půd a uhlík pocházející z biomasy by měl tvořit nejméně 1 % celkového organického uhlíku v půdě (viz oddíl 1.6.2).
XXII.1.6.4 Zacházení s půdou a její příprava pro zkoušku
XXII.1.6.4.1 Předběžná inkubace
Pokud byla půda skladována (viz oddíl 1.6.3.2 a 1.7.1.3), doporučuje se provést předběžnou inkubaci v délce 2 až 28 dnů. Teplota a vlhkost půdy během předběžné inkubace by měly být podobné podmínkám při zkoušce (viz oddíly 1.6.4.2 a 1.7.1.3).
XXII.1.6.4.2 Fyzikálně-chemické charakteristiky
Z půdy se ručně odstraní velké kusy (např. kameny, části rostlin atd.) a poté se za vlhka, aniž je půda nadměrně vysoušena, prosejí částice o velikosti 2 mm a menší. Vlhkost vzorku půdy se upraví destilovanou nebo deionizovanou vodou na hodnotu 40 % až 60 % maximální vodní kapacity.
XXII.1.6.5 Příprava zkoušené látky pro aplikaci na půdu
Zkoušená látka se obvykle aplikuje pomocí nosiče. Nosičem může být voda (u látek rozpustných ve vodě) nebo inertní tuhá látka, např. jemný křemičitý písek (velikost zrna: 0,1 – 0,5 mm). Jiné kapalné nosiče než voda (např. organická rozpouštědla jako aceton, chloroform) by neměly být používány, neboť mohou zničit mikroflóru. Použije-li se jako nosič písek, může být obalen zkoušenou látkou rozpuštěnou nebo rozptýlenou ve vhodném rozpouštědle. V takovém případě se rozpouštědlo před smísením s půdou odstraní odpařením. Pro optimální distribuci zkoušené látky v půdě se doporučuje použít 10 g písku na kilogram půdy (vztaženo na sušinu). Do kontrolních vzorků se aplikuje pouze odpovídající množství vody a/nebo písku.
Při zkoušení těkavých chemických látek je třeba zabránit ztrátám při aplikaci a pokusit se o homogenní rozptýlení látky v půdě (látka se např. nastříkne do půdy na více místech).
XXII.1.6.6 Zkušební koncentrace
Při zkoušení přípravků na ochranu rostlin nebo jiných chemických látek, u nichž lze předpovědět koncentraci v životním prostředí, se použijí alespoň dvě koncentrace. Nižší koncentrace by měla odpovídat přinejmenším maximálnímu očekávanému množství látky, které v reálných podmínkách pronikne do půdy, zatímco vyšší koncentrace by měla být násobkem nižší koncentrace. Výpočet koncentrace zkoušené látky přidávané do půdy se provede za předpokladu rovnoměrného zapravení do hloubky 5 cm a pro sypnou hustotu půdy 1,5. U agrochemikálií, které se aplikují přímo do půdy, nebo u chemikálií, u nichž lze množství, které se dostane do půdy, předpovědět, jsou doporučenými zkušebními koncentracemi předpokládané koncentrace v životním prostředí (Predicted Environmental Concentration, PEC) a jejich pětinásobky. U látek, které se zpravidla aplikují do půdy několikrát za sezónu, se zkušební koncentrace odvodí ze součinu PEC a očekávaného maximálního počtu aplikací. Horní koncentrace by však neměla překročit desetinásobek maximální jednorázově aplikované dávky.
U jiných látek než agrochemikálií se použije geometrická řada nejméně pěti koncentrací. V rozpětí těchto zkušebních koncentrací by se měly nacházet stanovované hodnoty EC
x
.
XXII.1.7 PROVEDENÍ ZKOUŠKY
XXII.1.7.1 Podmínky expozice
XXII.1.7.1.1 Expozice a kontrola
Při zkoušení agrochemikálií se půda rozdělí na tři díly o stejné hmotnosti. Dva díly se smísí s nosičem obsahujícím látku a třetí díl se smísí pouze s nosičem (kontrola). Doporučuje se, aby byla zkouška provedena s minimálně třemi duplikátními vzorky exponovaných i neexponovaných půd. Při zkoušení jiných látek než agrochemikálií se půda rozdělí na šest dílů o stejné hmotnosti. Pět vzorků se smísí s nosičem obsahujícím zkoušenou látku a šestý vzorek se smísí pouze s nosičem bez chemické látky. Doporučuje se použít tři duplikátní vzorky exponované i neexponované půdy. Je třeba věnovat pozornost homogennímu rozptýlení zkoušené látky v exponovaných vzorcích půdy. Při míšení by nemělo docházet k hutnění nebo shlukování půdy.
XXII.1.7.1.2 Inkubace vzorků půd
Inkubaci vzorků půd lze provést dvěma způsoby: se souhrnným vzorkem exponované půdy a souhrnným vzorkem neexponované půdy, nebo se sériemi jednotlivých stejně velkých dílčích vzorků jak exponované, tak neexponované půdy. U těkavých látek se však zkouška provádí pouze se sériemi jednotlivých dílčích vzorků. Pokud se inkubují souhrnné vzorky, připraví se velká množství exponované a neexponované půdy a během zkoušky se podle potřeby odebírají dílčí vzorky k analýze. Výchozí množství připravené pro exponované vzorky a kontrolní vzorky závisí na velikosti dílčích vzorků, počtu duplikátních vzorků použitých pro analýzu a na předpokládaném počtu intervalů, v nichž se odeberou vzorky. Půdy inkubované jako souhrnný vzorek se před odběrem dílčích vzorků důkladně promísí. Pokud se inkubují série jednotlivých vzorků půd, rozdělí se souhrnný vzorek exponované půdy a souhrnný vzorek neexponované půdy na požadovaný počet dílčích vzorků a ty se použijí podle potřeby. U experimentů, kdy lze předpokládat více než dva intervaly odběru, by měl být připraven dostatečný počet dílčích vzorků s ohledem na všechny duplikátní vzorky a všechny intervaly odběru. Alespoň tři duplikátní vzorky zkušební půdy měly být inkubovány za aerobních podmínek (viz oddíl 1.7.1.1). U všech zkoušek by měly být použity vhodné nádoby s dostatečným prostorem pod víkem, aby nenastaly anaerobní podmínky. U těkavých látek se zkouška provádí pouze se sériemi jednotlivých dílčích vzorků.
XXII.1.7.1.3 Podmínky zkoušky a její trvání
Zkouška se provádí v temnu při pokojové teplotě (20 +/- 2) st.C. Vlhkost vzorku půdy se udržuje po dobu zkoušky v rozmezí 40 % až 60 % (+-5 %) maximální vodní kapacity půdy (viz oddíl 1.6.4.2). Podle potřeby se přidává destilovaná nebo deionizovaná voda.
Zkoušky trvají nejméně 28 dnů. Při zkouškách agrochemikálií se porovnávají množství uvolněného oxidu uhličitého nebo množství spotřebovaného kyslíku u exponovaných a kontrolních vzorků. Pokud se 28. dne tyto rychlosti liší o více než 25 %, pokračuje se ve zkoušce do doby, než rozdíl klesne na 25 % a méně, nebo do 100 dnů, podle toho, co nastane dříve. U jiných chemických látek než agrochemikálií se zkouška ukončí po 28 dnech. 28. den se stanoví množství uvolněného oxidu uhličitého nebo množství spotřebovaného kyslíku u exponovaných a kontrolních vzorků a vypočítají se hodnoty EC
x
.
XXII.1.7.2 Odběry vzorků a analýzy půd
XXII.1.7.2.1 Intervaly odběru vzorků
Při zkoušení agrochemikálií se rychlost respirace vyvolané glukosou ve vzorcích analyzuje 0., 7., 14. a 28. den. Pokud se zkouška prodlužuje, provede se další měření ve 14denních intervalech po 28. dni.
Při zkoušení jiných látek než agrochemikálií se použije alespoň pět zkušebních koncentrací a obsah respirace vyvolané glukosou se ve vzorcích půd analyzuje na začátku expoziční doby (den 0) a na jeho konci (po 28 dnech). Je-li to považováno za nezbytné, lze provést další mezilehlé měření, např. 7. den. Data získaná 28. den se použijí pro stanovení EC
x
chemické látky. V případě potřeby lze data ze dne 0 u kontrolních vzorků použít k odhadu výchozího množství metabolicky aktivní mikrobiální biomasy v půdě.
XXII.1.7.2.2 Měření rychlostí respirace vyvolané glukosou
Pro každý čas odběru vzorků se v exponovaných i kontrolních vzorcích stanoví rychlost respirace vyvolané glukosou. Vzorky půd se smísí s dostatečným množstvím glukosy, aby se ihned vyvolala maximální respirační odezva. Množství glukosy potřebné pro vyvolání maximální respirační odezvy u dané půdy lze stanovit v orientační zkoušce se sérií koncentrací glukosy (viz literatura 14). U písčitých půd s obsahem organického uhlíku od 0,5 do 1,5 % obvykle stačí 2 000 mg až 4 000 mg glukosy na kg sušiny. Glukosu lze rozmělnit na prášek s čistým křemenným pískem (10 g písku na kg sušiny) a homogenně smísit s půdou.
Vzorky půdy obohacené glukosou se inkubují ve vhodné aparatuře, která umožňuje měřit respirační rychlosti při (20 +/- 2)st.C buď kontinuálně, nebo každou hodinu, nebo každé dvě hodiny (viz oddíl 1.6.1). Měření uvolněného oxidu uhličitého nebo spotřebovaného kyslíku se provádí nepřetržitě po dobu 12 h a měření se zahájí co nejdříve, tj. do 1 až 2 h po přidání glukosy. Změří se celkové množství uvolněného oxidu uhličitého nebo celkové množství spotřebovaného kyslíku za 12 h a stanoví se průměrná respirační rychlost.
XXII.2.DATA
XXII.2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ
Při zkoušení agrochemikálií se zaznamená množství uvolněného oxidu uhličitého nebo množství spotřebovaného kyslíku u každého duplikátního vzorku a průměrné hodnoty se zaznamenají do tabulky. Výsledky se vyhodnotí vhodnými všeobecně uznávanými statistickými metodami (např. F-testem při 5% hladině významnosti). Rychlosti respirace vyvolané glukosou se vyjádří v mg oxidu uhličitého na kg sušiny za hodinu nebo v mg kyslíku na kg sušiny za hodinu. Průměrná rychlost uvolňování oxidu uhličitého nebo průměrná rychlost spotřeby kyslíku u každé expozice se porovná s odpovídajícími hodnotami u kontrolních vzorků a vypočte se procentuální odchylka exponovaných vzorků od kontrolních vzorků.
Při zkoušení jiných látek než agrochemikálií se stanoví množství uvolněného oxidu uhličitého nebo množství spotřebovaného kyslíku v každém duplikátním vzorku a pro účely odhadu hodnot EC
x
se sestrojí křivka závislosti odezvy na dávce. Rychlosti respirace vyvolané glukosou (tj. mg oxidu uhličitého na kg sušiny za hodinu nebo mg kyslíku na kg sušiny za hodinu) zjištěné v exponovaných vzorcích po 28 dnech se porovnají s hodnotami zjištěnými u kontrolních vzorků. Z těchto údajů se pro každou zkušební koncentraci vypočte velikost inhibice v procentech. Tyto hodnoty v procentech se vynesou proti koncentraci a poté se statistickými metodami vypočítají hodnoty EC
x
. Standardními metodami (viz literatura 15 až 17) se rovněž vypočítají intervaly spolehlivosti (p = 0,95) pro vypočtené hodnoty EC
x
.
XXII.2.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ
Pokud je při hodnocení výsledků zkoušek s agrochemikáliemi při kterémkoli odběru po 28 dnech rozdíl respiračních rychlostí při nižší expozici (tj. při maximální očekávané koncentraci) a rychlosti u kontroly roven 25 % nebo nižší, lze konstatovat, že zkoušená látka nemá dlouhodobý vliv na transformaci uhlíku v půdách. Pro hodnocení výsledků zkoušek jiných látek než agrochemikálií se použijí hodnoty EC
50
, EC25 a/nebo EC10.
XXII.3. ZPRÁVY
PROTOKOL O ZKOUŠCE
Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:
Úplnou identifikaci použité půdy zahrnující tyto údaje:
— zeměpisná poloha místa (zeměpisná šířka a délka);
— informace o historii místa (tj. vegetační kryt, ošetření přípravky na ochranu rostlin, použití hnojiv, náhodná kontaminace atd.);
— způsob využití (např. zemědělská půda, les atd.);
— hloubka odběru vzorků (cm);
— obsah písku/prachu/jílu (v % sušiny);
— pH (ve vodě);
— obsah organického uhlíku (v % sušiny hmotnosti);
— obsah dusíku (v % sušiny);
— kapacita iontové výměny (mmol/kg);
— výchozí mikrobiální biomasa v procentech celkového organického uhlíku;
— odkaz na metody použité pro stanovení každého z parametrů;
— všechny informace týkající se odběru a skladování vzorků půd;
— podrobné údaje o případné předběžné inkubaci půdy.
Zkoušená látka:
— fyzikální povaha a případně její fyzikálně-chemické vlastnosti;
— případně údaje o chemické identitě, včetně strukturního vzorce, čistoty (tj. procentuální obsah účinné složky u přípravků na ochranu rostlin), obsahu dusíku.
Zkušební podmínky:
— podrobné údaje o obohacení půdy organickým substrátem;
— počet použitých koncentrací zkoušené látky, popřípadě zdůvodnění volby koncentrací;
— podrobné údaje o aplikaci zkoušené látky na půdu;
— inkubační teplota;
— vlhkost půdy na začátku zkoušky a v jejím průběhu;
— použitá metoda inkubace (tj. buď inkubace souhrnného vzorku půdy, nebo inkubace jednotlivých dílčích vzorků půdy);
— počet duplikátních vzorků;
— doby odběru vzorků
.
Výsledky:
— metoda a zařízení použité pro měření respiračních rychlostí;
— data včetně jednotlivých hodnot a průměrných hodnot množství oxidu uhličitého nebo kyslíku zpracovaná v tabulkové formě;
— rozdíly mezi duplikátními vzorky u exponovaných a kontrolních vzorků půd;
— v případě potřeby vysvětlení oprav provedených při výpočtech;
— procentuální odchylka v rychlostech respirace vyvolané glukosou pro každou dobu odběru vzorků, popřípadě hodnota EC
50
s 95% intervalem spolehlivosti, jiné hodnoty EC
x
(tj. EC
25
nebo EC
10
) s intervaly spolehlivosti a graf křivky závislosti odpovědi na dávce;
— případné statistické vyhodnocení výsledků;
— všechny informace a pozorování užitečné pro interpretaci výsledků.
XXII.4 LITERATURA
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1 – 16, 1994.
(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1 – 1 (2. vyd., 1990).
(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. September 28, 1987.
(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, vyd. M. R. Lynch, Pub. SETAC- Europe, Brussels.
(5) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18.-20. ledna, 1995.
(6) ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
(7) Anderson, J. P. E. (1987). Handling and Storage of Soils for Pesticide Experiments. In: Pesticide Effects on Soil Microflora. Vyd. L. Somerville, M. P. Greaves, Chap. 3: 45 – 60.
(8) Anderson, J. P. E. (1982). Soil Respiration. In: Methods of Soil Analysis – Part 2: Chemical and Microbiological Properties. Agronomy Monograph N° 9. Vyd. A. L. Page, R. H. Miller a D. R. Keeney. 41: 831 – 871.
(9) ISO 11266-1 (1993). Soil Quality – Guidance on Laboratory Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions.
(10) ISO 14239 (1997E). Soil Quality – Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.
(11) Heinemeyer, O., Insam, H., Kaiser, E. A., Walenzik, G. (1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; an automated technique based on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116: 77 – 81.
(12) ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration method.
(13) ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.
(14) Malkomes, H.-P. (1986). Einfluß von Glukosemenge auf die Reaktion der Kurzzeit- Atmung im Boden gegenüber Pflanzenschutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., Braunschweig, 38: 113 – 120.
(15) Litchfield, J. T., Wilcoxon F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. Exper. Ther., 96, 99 – 113.
(16) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3. vyd., Cambridge, London, New York.
(17) Finney, D. J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK.
XXIII. METODA PRO STANOVENÍ AEROBNÍ A ANAEROBNÍ TRANSFORMACE CHEMICKÉ LÁTKY V PŮDĚ (metoda C.23 podle přílohy směrnice 2004/73/ES ze dne 29. dubna 2004, kterou se po dvacáté deváté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek)
XXIII.1. METODA
Tato zkušební metoda odpovídá metodě OECD TG 307 (2002).
XXIII.1.1 ÚVOD
Postup popsaný v této zkušební metodě je vyvinut pro účely hodnocení aerobní a anaerobní transformace chemické látky v půdě. Je založen na doporučeních a směrnicích národních a mezinárodních organizací (viz literatura 1 až 9). Účelem experimentů je stanovit i) rychlost transformace zkoušené látky a ii) povahu a rychlost tvorby a rozkladu transformačních produktů, kterým mohou být rostliny a půdní organismy vystaveny. Tyto studie jsou požadovány u chemických látek, které se aplikují přímo do půdy nebo pravděpodobně mohou proniknout do půdního ekosystému. Výsledky těchto laboratorních studií mohou být také použity pro vypracování postupů odběru vzorků a analýzy u podobných polních studií.
Pro vyhodnocení způsobu transformace obvykle postačují aerobní a anaerobní studie s jedním druhem půdy (viz literatura 8, 10 a 11). Rychlosti transformace se stanoví alespoň pro tři další půdy (viz literatura 8 a 10).
Druhy zkušebních půd by měly být reprezentativní pro environmentální podmínky, v nichž dojde k použití látky nebo k jejímu uvolnění. Například chemické látky, k jejichž uvolnění může dojít v subtropickém až tropickém klimatu, by měly být zkoušeny s ferrasoly nebo nitosoly (systém FAO). Tato metoda se rovněž týká půd rýžových polí.
XXIII.1.2 DEFINICE
Zkoušená látka: jakákoli látka, ať již výchozí látka, nebo příslušné transformační produkty. Transformační produkty: všechny látky vznikající při biotických a abiotických transformačních reakcích zkoušené látky, včetně CO
2
a látek, které jsou přítomny ve vázaných reziduích.
Vázaná rezidua: sloučeniny v půdě, rostlině nebo v živočichu, které po extrakci zůstávají v matrici ve formě výchozí látky nebo (jejího metabolitu (jejích metabolitů) nebo transformačních produktů. Metoda extrakce nesmí podstatně měnit samotné sloučeniny nebo strukturu matrice. Povahu vazeb lze částečně vyjasnit extrakcí spojenou se změnami v matrici a náročnými analytickými technikami. Dosud byly tímto způsobem vyjasněny např. kovalentní, iontové a adsorpční vazby a rovněž záchyty. Tvorba vázaných reziduí obecně podstatně snižuje biologickou přístupnost a dostupnost (viz literatura 12) [upraveno podle IUPAC 1984 (viz literatura 13)].
Aerobní transformace: reakce, ke kterým dochází za přítomnosti kyslíku (viz literatura 14). Anaerobní transformace: reakce probíhající s vyloučením molekulárního kyslíku (viz literatura 14).
Půda: směs minerálních a organických chemických složek oživená malými organismy (většinou mikroorganismy), přičemž organické složky obsahují sloučeniny s vysokým obsahem uhlíku a dusíku a vysokou molekulovou hmotností. Lze pracovat s dvěma formami půdy:
a) s neporušenou půdou, jak v průběhu času vznikla, s charakteristickými vrstvami různých druhů půdy;
b) s porušenou půdou, která se obvykle vyskytuje na obdělávaných polích v případě, že se vzorky odebírají vyrýváním a používají se v této zkušební metodě (viz literatura 14).
Mineralizace: úplný rozklad organické sloučeniny na CO
2
, H
2
O za aerobních podmínek a na CH4, CO
2
a H
2
O za anaerobních podmínek. V souvislosti s touto metodou, při níž se používají sloučeniny značené radioisotopy, se mineralizací rozumí rozsáhlý rozklad molekuly, při němž se radioisotopy uhlíku oxidují za tvorby odpovídajícího množství 14CO
2
(viz literatura 14).
Poločas: t
0,5
, je čas, za který dojde k 50% transformaci zkoušené látky, jestliže lze transformaci popsat kinetikou prvního řádu; nezávisí na počáteční koncentraci.
DT
50
(doba odbourání 50): doba, za kterou se počáteční koncentrace zkoušené látky sníží o 50 %; liší se od poločasu t
0,5
, pokud transformace neprobíhá podle kinetiky prvního řádu.
DT75 (doba odbourání 75): doba, za kterou se počáteční koncentrace zkoušené látky sníží o 75 %.
DT90 (doba odbourání 90): doba, za kterou se počáteční koncentrace zkoušené látky sníží o 90 %.
XXIII.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Referenční látky se použijí pro charakterizaci a/nebo identifikaci transformačních produktů spektroskopickými a chromatografickými metodami.
XXIII.1.4 POUŽITELNOST ZKOUŠKY
Tato je metoda je použitelná pro všechny chemické látky (neznačené nebo značené radioaktivními isotopy), pro něž je k dispozici analytická metoda s dostatečnou správností a citlivostí. Je použitelná pro mírně těkavé a netěkavé sloučeniny rozpustné i nerozpustné ve vodě. Zkouška by neměla být použita u látek, které z půdy silně těkají (např. fumiganty, organická rozpouštědla), a nelze je tedy v půdě udržet za experimentálních podmínek této zkoušky.
XXIII.1.5 INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE
Pro stanovení rychlosti transformace lze použít jak látky neznačené radioisotopy, tak značené látky. Značený materiál je nezbytný pro studium způsobu transformace a pro stanovení látkové bilance. Doporučuje se značení isotopem
14
C, avšak užitečné mohou být i jiné isotopy, např.
13
C,
15
N,
3
H,
32
P. Značena by měla být pokud možno nejstabilnější část (nejstabilnější části) molekuly. Pokud například zkoušená látka obsahuje jeden aromatický kruh, je třeba, aby byl tento kruh označen. Pokud zkoušená látka obsahuje dva nebo více kruhů, může být nezbytné provést samostatné studie s cílem podchytit zbytky každého z kruhů, a získat tak vhodné informace o tvorbě transformačních produktů.). Čistota látky by měla být alespoň 95 %.
Před provedením zkoušky na aerobní a anaerobní transformaci v půdě by měly být k dispozici alespoň tyto informace o látce:
a) rozpustnost ve vodě (metoda A.6)
b) rozpustnost v organických rozpouštědlech;
c) tlak par (metoda A.4) a Henryho konstanta;
d) rozdělovací koeficient n-oktanol/voda (metoda A.8);
e) chemická stabilita v temnu (hydrolýza) (metoda C.7);
f) pKa, pokud u molekuly nastává protonace nebo deprotonace [směrnice OECD 112 ] (viz literatura 16).
Mezi další užitečné informace patří údaje o toxicitě zkoušené látky pro půdní mikroorganismy [zkušební metody C.21 a C.22] (viz literatura 16).
K dispozici by měly být analytické metody (včetně extrakčních a izolačních metod) pro kvantitativní stanovení a identifikaci zkoušené látky a jejích transformačních produktů.
XXIII.1.6 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Vzorky půdy se exponují zkušební látce a inkubují se v temnu v biometrických baňkách nebo v průtokových systémech za řízených laboratorních podmínek (při konstantní teplotě a vlhkosti půdy). Ve vhodných intervalech se vzorky půd extrahují a analyzuje se obsah výchozí látky a transformačních produktů. Vhodným absorpčním zařízením se k analýze shromáždí také těkavé produkty. Prostřednictvím materiálu značeného isotopem
14
C lze po zachycení uvolněného
14
CO
2
měřit různé rychlosti mineralizace zkoušené látky a dále lze stanovit látkovou bilanci včetně tvorby vázaných reziduí v půdě.
XXIII.1.7 KRITÉRIA JAKOSTI
XXIII.1.7.1 Výtěžnost
Extrakce a analýza provedená alespoň u dvou duplikátních vzorků půdy ihned po přidání zkoušené látky poskytne první informaci o opakovatelnosti analytické metody a o stejnoměrnosti aplikace zkoušené látky. Výtěžnosti pozdějších stupňů experimentu se zjistí z příslušných látkových bilancí. Výtěžnosti by se měly nacházet v rozmezí 90 % až 110 % u značených chemických látek (viz literatura 8) a v rozmezí 70 % až 110 % u neznačených chemických látek (viz literatura 3).
XXIII.1.7.2 Opakovatelnost a citlivost analytické metody
Opakovatelnost analytické metody (kromě účinnosti první extrakce) pro kvantitativní stanovení zkoušené látky a transformačních produktů lze ověřit provedením analýzy duplikátních vzorků týchž extraktů půdy, která byla dostatečně dlouho inkubována, aby došlo k vytvoření transformačních produktů.
Mez detekce (LOD) analytické metody pro zkoušenou látku a pro transformační produkty by měla být alespoň 0,01 mg na kg půdy (pro zkoušenou látku) nebo 1 % aplikované dávky, podle toho, která z hodnot je nižší. Rovněž by měla být specifikována mez kvantitativní stanovitelnosti (LOQ).
XXIII.1.7.3 Správnost dat o transformaci
Regresní analýza závislosti koncentrace zkoušené látky na čase poskytuje vhodné informace o spolehlivosti transformační křivky a umožňuje vypočítat intervaly spolehlivosti pro poločasy (v případě zdánlivé kinetiky prvního řádu) nebo pro hodnoty DT50, popřípadě hodnot DT
75
a DT
90
.
XXIII.1.8 POPIS METODY
XXIII.1.8.1 Vybavení a chemická činidla
Inkubačními systémy jsou statické uzavřené systémy nebo vhodné průtokové systémy (viz literatura 7 a 17). Příklady vhodných průtokových inkubačních aparatur a biometrických baněk jsou uvedeny na obrázcích 1 a 2. Oba typy inkubačních systémů mají své výhody a svá omezení (viz literatura 7 a 17).
Pro zkoušku je nezbytné standardní laboratorní vybavení, zejména:
— analytické přístroje, jako jsou GLC, HPLC, TLC, včetně vhodných detekčních systémů pro analýzu značených nebo neznačených látek nebo pro inverzní isotopovou zřeďovací metodu;
— přístroje pro identifikaci látek (např. MS, GC-MS, HPLC-MS, NMR atd.);
— kapalinový scintilační spektrometr;
— okysličovací zařízení pro spalování radioaktivního materiálu;
— odstředivka;
— extrakční aparatura (např. centrifugační zkumavky pro studenou extrakci a Soxhletův přístroj pro kontinuální extrakci s refluxem);
— zařízení pro zkoncentrování roztoků a extraktů (např. rotační odparka);
— vodní lázeň;
— mechanické míchací zařízení (např. hnětací zařízení, rotační mixér).
Použijí se např. tato chemická činidla:
— NaOH p.a, 2 M, nebo jiná vhodná zásada (např. KOH, ethanolamin);
— H
2
SO
4
p.a., 0,05 M;
— ethylenglykol p.a.;
— tuhý absorpční materiál, např. natronové vápno, a polyurethanové zátky;
— organická rozpouštědla čistoty p.a., např. aceton, methanol atd.;
— kapalný scintilátor.
XXIII.1.8.2 Aplikace zkoušené látky
Za účelem aplikace zkoušené látky do půdy a jejího rozptýlení lze zkoušenou látku rozpustit ve vodě (v deionizované nebo destilované vodě) nebo lze v případě potřeby použít co nejmenší množství acetonu nebo jiných organických rozpouštědel (viz literatura 6), ve kterých je zkoušená látka dostatečně rozpustná a stabilní. Zvolené množství rozpouštědla však nesmí mít významný vliv na mikrobiální aktivitu půdy (viz oddíly 1.5 a 1.9.2 až 1.9.3). Rozpouštědla, která působí jako inhibitory mikrobiální aktivity, např. chloroform, dichloromethan a jiná halogenovaná rozpouštědla, nesmějí být použita. Látku lze do půdy přidat také např. ve směsi s křemenným pískem (viz literatura 6) nebo ve formě malých dílčích vzorků zkušební půdy, které byly předem vysušeny na vzduchu a sterilizovány. Pokud se látka přidává pomocí rozpouštědla, mělo by být rozpouštědlo odpařeno ještě před tím, než jsou k původním nesterilním vzorkům půdy přidány obohacené dílčí vzorky.
U běžně používaných chemických látek, jež se dostávají do půdy prostřednictvím zemědělské aplikace kalů z čistíren odpadních vod, se zkoušená látka nejprve přidá do kalu, který se poté vpraví do vzorku půdy (viz oddíly 1.9.2 a 1.9.3).
Nedoporučuje se používat rutinně přípravky v komerční úpravě. Například u špatně rozpustných látek však může být použití přípravku v komerční úpravě vhodnou alternativou.
XXIII.1.8.3 Půdy
XXIII.1.8.3.1 Výběr půd
Pro stanovení způsobu transformace lze použít reprezentativní půdy; doporučují se písčitohlinitá, prachovitohlinitá, hlinitá nebo hlinitopísčitá půda [podle klasifikace FAO a USDA (viz literatura 18)] o hodnotě pH 5,5 až 8,0 a obsahu organického uhlíku 0,5 – 2,5 %, přičemž mikrobiální biomasa by měla tvořit nejméně 1 % celkového organického uhlíku (viz literatura 10).
Pro studie transformačních rychlostí se použijí alespoň tři další půdy reprezentující rozsah relevantních půd. Půdy by se měly lišit, pokud jde o obsah organického uhlíku, pH, obsah jílu a mikrobiální biomasy (viz literatura 10).
U všech půd by měly být charakterizovány alespoň jejich: struktura (% písku, % prachu, % jílu) [podle klasifikace FAO a USDA (viz literatura 18)], pH, kationtová výměnná kapacita, organický uhlík, sypná hustota, schopnost zadržet vodu a mikrobiální biomasa (pouze pro aerobní studie). Schopnost půdy zadržet vodu lze měřit jako polní kapacitu, jako retenční vodní kapacitu nebo jako vodní sací tlak (pF). Vysvětlení je uvedeno v dodatku 1. V protokolu o zkoušce by mělo být uvedeno, zda byly schopnost půdy zadržet vodu a sypná hustota stanoveny u neporušených polních vzorků, nebo porušených (zpracovaných) vzorků. Pro interpretaci výsledků mohou být užitečné další informace o vlastnostech půdy. Pro stanovení charakteristik půdy lze použít metody doporučené v literatuře (viz literatura 19 až 23). Mikrobiální biomasa se stanoví metodou respirace indukované substrátem (SIR) (viz literatura 25 a 26) nebo alternativními metodami (viz literatura 20)
.
XXIII.1.8.3.2 Odběr, příprava a skladování půd
K dispozici by měly být podrobné informace o historii místa, ze kterého je půda odebírána. Těmito informacemi jsou přesná poloha, vegetační kryt, údaje o ošetřování chemickými látkami, použití organických a minerálních hnojiv, přídavky biologického materiálu nebo jiná kontaminace. Pokud byla půda v předchozích čtyřech letech ošetřena zkoušenou látkou nebo látkami s analogickou strukturou, neměla by být použita pro transformační studie (viz literatura 10 a 15).
Půda by měla být čerstvě odebraná z terénu (z A horizontu nebo z horní 20cm vrstvy) a měla by být tak vlhká, aby bylo možné snadné prosévání. Kromě půd z rýžových polí by půdy neměly být odebírány v průběhu dlouhých období (více než 30 dnů) sucha, mrazů nebo zavodnění nebo krátce po těchto obdobích (viz literatura 14). Vzorky se přepravují způsobem, který minimalizuje změny obsahu vody v půdě, a uchovávají se v temnu za co největšího přístupu vzduchu. Pro tento účel je obecně vhodný volně uzavřený polyethylenový sáček.
Půda se zpracuje co nejdříve po odběru. Před proséváním na sítu o velikosti 2 mm, při němž se odstraní malé kameny, drobní živočichové a zbytky rostlin, se z půdy odstraní vegetace, větší živočichové a kameny. Před proséváním by nemělo dojít k nadměrnému vysušení a rozdrcení půdy (viz literatura 15).
Pokud je v zimě obtížné odebrat vzorky v terénu (zmrzlá půda, sněhová pokrývka), mohou být odebrány z půdy skladované ve skleníku pod vegetačním pokryvem (např. zatravněné půdy nebo půdy s travní směsí s jetelem). V každém případě se upřednostňují studie s čerstvě odebranými půdami; pokud má být odebraná a zpracovaná půda před zahájením studie skladována, musí být skladována za odpovídajících podmínek a pouze po omezenou dobu (při (4 +/- 2) st.C po dobu maximálně tří měsíců), aby byla zachována mikrobiální aktivita. Z výsledků nedávných výzkumů vyplývá, že půdy z mírného pásma lze skladovat při ­20 st.C déle než tři měsíce (viz literatura 28 a 29), aniž dojde k významné ztrátě mikrobiální aktivity.
Podrobné pokyny pro odběr, zpracování a skladování půd pro biotransformační experimenty lze nalézt v literatuře (viz literatura 8, 10, 15, 26 a 27).
Před tím, než se zpracovaná půda použije ve zkoušce, provede se její předběžná inkubace, aby se umožnilo klíčení a odstranila se semena a aby se po změnách podmínek, ke kterým došlo od odběru nebo skladování po nastolení inkubačních podmínek, znovu ustavila rovnováha mikrobiálního metabolismu. Obecně postačuje předběžné inkubační období v délce od 2 do 28 dnů při podmínkách teploty a vlhkosti blížících se podmínkám zkoušky (viz literatura 15). Skladování a předběžná inkubace by dohromady neměly trvat déle než tři měsíce.
XXIII.1.9 PROVEDENÍ ZKOUŠKY
XXIII.1.9.1 Zkušební podmínky
XXIII.1.9.1.1 Zkušební teplota
V průběhu celé zkoušky by měly být půdy inkubovány v temnu při stálé teplotě, která je reprezentativní pro klimatické podmínky, ve kterých dojde k použití látky nebo k jejímu uvolnění. Pro zkoušky všech látek, které se dostávají do půdy v mírném klimatickém pásu, se doporučuje teplota (20 +/- 2) st.C. Teplota musí být monitorována.
V případě chemických látek aplikovaných nebo uvolňovaných v chladném klimatickém pásu (např. v severských zemích, během podzimu/zimy) se inkubují další vzorky půdy, avšak při nižší teplotě (např. při (10 +/- 2) st.C).
XXIII.1.9.1.2 Vlhkost
Pro účely dostatečného provzdušňování a výživy půdní mikroflóry by půda neměla být ani příliš vlhká, ani příliš suchá. Vlhkost půdy doporučená pro optimální růst mikroflóry se nachází v rozmezí od 40 % do 60 % retenční vodní kapacity a v rozmezí od 0,1 do 0,33 bar (viz literatura 6). Naposledy uvedený rozsah odpovídá rozsahu pF od 2,0 do 2,5. Typická vlhkost různých druhů půd je uvedena v dodatku 2. Pro transformační zkoušky při aerobních podmínkách se vlhkost nastaví a udržuje na hodnotě pF od 2,0 do 2,5 (viz literatura 3). Vlhkost půdy se vyjádří jako hmotnost vody na jednotku hmotnosti sušiny půdy, pravidelně se kontroluje (např. každé 2 týdny) vážením inkubačních baněk a ztráta vody se vyrovnává přidáním vody (nejlépe sterilně filtrované vody z vodovodu). Při upravování vlhkosti je třeba zabránit ztrátám zkoušené látky a/nebo transformačních produktů v důsledku těkání nebo případné fotodegradace, nebo je třeba tyto ztráty minimalizovat.
V případě transformačních zkoušek za anaerobních podmínek a za podmínek rýžového pole se půda nasytí vodou tak, že se zaplaví.
XXIII.1.9.1.3 Podmínky aerobní inkubace
V průtokových systémech se aerobní podmínky udržují občasným propláchnutím nebo nepřetržitým provětráváním zvlhčeným vzduchem. V biometrických baňkách se výměna vzduchu udržuje difuzí.
XXIII.1.9.1.4 Sterilní aerobní podmínky
Za účelem získání informací o možné abiotické transformaci zkoušené látky lze vzorky půdy sterilizovat (metody sterilizace jsou uvedeny v literatuře 16 a 29), exponovat je sterilní zkoušené látce (např. přidáváním roztoku přes sterilní filtr) a provzdušňovat je zvlhčeným sterilním vzduchem, jak je popsáno v oddíle 1.9.1.3. U půd z rýžových polí se půda a voda sterilizuje a inkubace se provede způsobem uvedeným v oddílu 1.9.1.6.
XXIII.1.9.1.5 Podmínky anaerobní inkubace
S cílem nastolit a udržovat anaerobní podmínky se půda, která byla exponována zkoušené látce a inkubována za aerobních podmínek 30 dnů nebo jeden poločas nebo po dobu odpovídající DT50 (podle toho, co je kratší), zaplaví vodou (vrstva vody 1 – 3 cm) a inkubační systém se propláchne inertním plynem (např. dusíkem nebo argonem). Aerobní podmínky převažují v povrchových půdách a dokonce v podpovrchových půdách. Anaerobní podmínky se mohou vyskytovat jen příležitostně během zaplavení půdy po vydatných srážkách, nebo jsou-li takové podmínky ustaveny na rýžových polích. Zkušební systém musí umožňovat měření pH, koncentrace kyslíku a oxidačně­redukčního potenciálu a musí být vybaven zařízením pro zachycování těkavých produktů. Biometrický systém musí být uzavřený, aby bylo zabráněno přístupu vzduchu difuzí.
XXIII.1.9.1.6 Inkubace za podmínek rýžového pole
Pro účely studia transformace v půdách rýžových polí se půda zaplaví vrstvou vody o výšce asi 1 – 5 cm a zkoušená látka se aplikuje do vodné fáze (viz literatura 9). Doporučená tloušťka vrstvy půdy je alespoň 5 cm. Systém se provzdušňuje vzduchem jako za aerobních podmínek. Hodnota pH, koncentrace kyslíku a oxidačně-redukční potenciál vodné vrstvy se monitorují a zaznamenávají. Před zahájením transformačních studií je nezbytné alespoň dvoutýdenní předběžné inkubační období (viz oddíl 1.8.3.2).
XXIII.1.9.1.7 Délka zkoušky
Studie rychlosti a způsobu transformace by neměly za normálních podmínek trvat déle než 120 dnů (viz literatura 3, 6 a 8), neboť poté by podle očekávání mělo v umělém laboratorním systému izolovaném od přirozeného doplňování postupně docházet ke snižování mikrobiální aktivity půdy. Aerobní studie mohou být ukončeny daleko dříve než za 120 dnů, pokud je v dané době jasně dosaženo konečného transformačního schématu a konečné mineralizace. Zkoušku lze ukončit po 120 dnech, nebo pokud se transformovalo 90 % zkoušené látky, avšak pouze tehdy, vytvořilo-li se alespoň 5 % CO
2
. Pokud je to nezbytné pro popis rozkladu zkoušené látky a tvorby a rozkladu hlavních transformačních produktů, lze studie prodloužit (např. na 6 nebo 12 měsíců) (viz literatura 8). Delší inkubační období by měla být zdůvodněna ve zprávě o zkoušce a doplněna měřením biomasy během těchto období a na jejich konci.
XXIII.1.9.2 Provedení zkoušky
Do každé z inkubačních baněk se vpraví asi 50 až 200 g půdy (hmotnost sušiny) (viz obrázky 1 a 2 v dodatku 3) a půda se jednou z metod uvedených v oddílu 1.8.2 exponuje zkoušené látce. Pokud se pro účely aplikace zkoušené látky použijí organická rozpouštědla, odstraní se z půdy odpařením. Půda se poté důkladně promíchá Zpachtlí nebo se baňka protřepe. Pokud se studie provádí za podmínek rýžového pole, půda a voda se po aplikaci zkoušené látky důkladně promísí. Malé podíly (např. 1 g) exponované půdy se analyzují na zkoušenou látku za účelem kontroly rovnoměrnosti distribuce. Alternativní metody jsou uvedeny níže.
Aplikované množství by mělo odpovídat nejvyššímu aplikovanému množství přípravku na ochranu rostlin doporučenému podle pokynů k použití a rovnoměrnému zapravení do vhodné hloubky na poli (např. do horní 10cm vrstvy půdy.
Výpočet výchozí koncentrace na základě plochy se provede takto:
               A[kg/ha].10
6
[mg/kg] Cpuda = ------------------------------------ l[m].10
4
[m
2
/ha].d[kg
puda
/m
3
]
C
půda
= výchozí koncentrace v půdě [mg*kg
­1
]; A = aplikační dávka [kg*ha
­1
]; l = tloušťka půdní vrstvy na poli [m], d = sypná hustota suché půdy [kg*m
-3
]. Zhruba platí, že aplikační dávka 1 kg*ha
­1
vede ke koncentraci v půdě přibližně 1 mg*kg
­1
v 10cm vrstvě (při předpokládané sypné hustotě 1 g*cm
-3
).Například u chemických látek aplikovaných na list nebo do půdy bez zapravení se pro výpočet množství chemické látky, které je třeba přidat do každé baňky, použije hloubka vrstvy půdy 2,5 cm. U chemických látek zapravovaných do půdy je příslušná hloubka specifikována v pokynech pro použití. U chemických látek obecně by mělo být aplikované množství odhadnuto na základě hlavní cesty vstupu do půdy; jsou-li například hlavní cestou vstupu do půdy kaly z čistíren odpadních vod, měla by být chemická látka přidána do kalu v koncentraci, která odráží očekávanou koncentraci v kalu, a množství kalu zapravené do půdy by mělo odpovídat normálnímu množství kalu zapravovanému do zemědělských půd. Pokud tato koncentrace není dostatečná pro identifikaci hlavních transformačních produktů, může napomoci inkubace samostatných půdních vzorků obsahujících vyšší koncentrace, avšak neměly by být používány nadměrné koncentrace, které mají vliv na mikrobiální funkce (viz oddíly 1.5 a 1.8.2).
Jinou možností je expozice velké dávky půdy (tj. 1 až 2 kg), její důkladné promísení vhodným míchacím zařízením a přenesení malých podílů o hmotnosti 50 až 200 g do inkubačních baněk (např. pomocí děliče vzorku). Malé podíly (např. 1 g) exponované půdy se analyzují na zkoušenou látku za účelem kontroly rovnoměrné distribuce. Takový postup se upřednostňuje, neboť umožňuje stejnoměrnější rozptýlení zkoušené látky v půdě. Neexponované vzorky se inkubují za stejných podmínek (aerobních) jako vzorky exponované zkoušené látce. Tyto vzorky se použijí pro stanovení biomasy během studií a na jejich konci. Pokud se látka aplikuje do půdy rozpuštěná v organickém rozpouštědle (organických rozpouštědlech), inkubují se vzorky půdy vystavené témuž množství rozpouštědla (rozpouštědel) za týchž (aerobních) podmínek jako vzorky exponované zkoušené látce. Tyto vzorky se použijí pro stanovení biomasy na začátku studií, v jejich průběhu a na jejich konci za účelem kontroly účinků rozpouštědla (rozpouštědel) na mikrobiální biomasu.
Baňky obsahující exponovanou půdu se buď zapojí do průtokového systému popsaného na obrázku 1, nebo se uzavřou absorbční kolonou, jak je uvedeno na obrázku 2 (viz dodatek 3).
XXIII.1.9.3 Odběr vzorků a měření
V příslušných časových intervalech se vyberou duplikátní inkubační baňky, vzorky půd se extrahují vhodnými rozpouštědly různé polarity a analyzují na zkoušenou látku a/nebo na transformační produkty. V dobře založených studiích je k dispozici dostatečný počet baněk, aby bylo možné ke každému odběru vybrat dvě baňky. V různých časových intervalech (v 7denních intervalech během prvního měsíce a po prvním měsíci v 17denních intervalech) během inkubace každého vzorku půdy a dále na konci inkubace se také odeberou absorpční roztoky nebo tuhé absorpční materiály a analyzují se na těkavé produkty. Kromě vzorku půdy odebraného ihned po aplikaci (vzorek ze dne 0) se provede alespoň dalších 5 odběrů. Časové intervaly se zvolí tak, aby bylo možné stanovit schéma rozkladu zkoušené látky a způsob tvorby a rozkladu transformačních produktů (např. po 0, 1, 3, 7 dnech; po 2, 3 týdnech; po 1, 2, 3 měsících atd.).
V případě zkoušené látky značené isotopem
14
C se spálením kvantitativně stanoví neextrahovatelná radioaktivita a pro každý vzorkovací interval se vypočte látková bilance.
V případě anaerobní inkubace nebo inkubace za podmínek rýžového pole se půda a vodná fáze analyzují na zkoušenou látku a transformační produkty buď společně, nebo se před extrakcí a analýzou oddělí filtrací nebo centrifugací.
XXIII.1.9.4 Nepovinné zkoušky
Pro odhad vlivu teploty a vlhkosti půdy na rychlosti transformace zkoušené látky a/nebo jejích transformačních produktů v půdě mohou být užitečné aerobní nesterilní studie při další teplotě nebo vlhkosti půdy.
O další charakterizaci neextrahovatelné radioaktivity se lze pokusit například použitím metody extrakce tekutinou v nadkritickém stavu.
XXIII.2. DATA
XXIII.2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ
Pro každý vzorkovací interval se uvede množství zkoušené látky, transformačních produktů, těkavých látek (pouze v %) a neextrahovatelných látek v procentech výchozí koncentrace, popřípadě v mg na kg půdy (na hmotnost sušiny). Pro každý vzorkovací interval se uvede látková bilance v procentech výchozí koncentrace. Grafické znázornění závislosti koncentrace zkoušené látky na čase umožní provést odhad jejího poločasu transformace nebo hodnoty DT
50
. Měly by být identifikovány hlavní transformační produkty a měly by být také sestrojeny křivky jejich závislosti na čase, aby se ukázala rychlost jejich tvorby a rozkladu. Hlavním transformačním produktem je jakýkoli produkt, který kdykoli během studie představuje >= 10 % aplikované dávky.
Zachycené těkavé produkty jsou určitým ukazatelem těkavosti zkoušené látky a jejích transformačních produktů z půdy.
Přesnější stanovení poločasů nebo hodnot DT
50
a popřípadě hodnot DT75 a DT90 se provede výpočtem za použití vhodného modelu kinetiky. Společně s hodnotami poločasu a DT50 se uvede popis použitého modelu kinetiky, řád kinetiky a koeficient determinace (r
2
). Pokud není r
2
< 0,7, upřednostňuje se kinetika prvního řádu. Podle možnosti se výpočty použijí také na hlavní transformační produkty. Příklady vhodných modelů jsou popsány v literatuře 31 až 35.
V případě studií rychlosti prováděných při různých teplotách se závislost rychlosti transformace na teplotě popíše v rozsahu experimentálních teplot pomocí Arrheniovy rovnice:
                                       B  
       k = A.e
-B/T
nebo lnk = lnA - -- T
kde ln A a B jsou regresní konstanty získané z úseku na ose y a ze směrnice regresní přímky závislosti ln k na 1/T, kde k je rychlostní konstanta při teplotě T a T je teplota v Kelvinech. Je třeba věnovat pozornost omezení rozsahu teplot, v němž platí Arrheniova rovnice, jestliže transformaci určuje mikrobiální činnost.
XXIII.2.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ
Přestože se studie provádějí v umělém laboratorním systému, umožňují výsledky odhadnout rychlost transformace zkoušené látky a rovněž rychlost tvorby a rozkladu transformačních produktů za polních podmínek (viz literatura 36 a 37).
Studie transformačního způsobu zkoušené látky poskytuje informaci o způsobu, jakým se mění struktura aplikované látky v půdě působením chemických a mikrobiálních reakcí.
XXIII.3. ZPRÁVY
XXIII.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto údaje:
Zkoušená látka:
— obecný název, chemický název, číslo CAS, strukturní vzorec (s uvedení polohy značícího atomu (značících atomů) při použití radionuklidů) a relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti (viz oddíl 1.5);
— čistota zkoušené látky (obsah nečistot);
— popřípadě radiochemická čistota značené chemické látky a specifická aktivita;
Referenční látky:
chemický název a struktura referenčních látek použitých k charakterizaci a/nebo identifikaci transformačního produktu;
Zkušební půdy:
— podrobné údaje o místě odběru;
— datum a postup odběru vzorků půdy;
— vlastnosti půdy, např. pH, obsah organického uhlíku, struktura (% písku, % prachu, % jílu), kationtová výměnná kapacita, sypná hustota, schopnost zadržet vodu a mikrobiální biomasa;
— doba skladování půdy a podmínky skladování (pokud byla skladována);
Zkušební podmínky:
— datum provedení studií;
— množství aplikované zkoušené látky;
— použitá rozpouštědla a metoda aplikace zkoušené látky;
— hmotnost exponované půdy na začátku zkoušky a hmotnost půdy odebírané pro analýzu v každém intervalu;
— popis použitého inkubačního systému;
— rychlosti průtoku vzduchu (pouze u průtokových systémů);
— zkušební teplota;
— vlhkost půdy během inkubace;
— mikrobiální biomasa na začátku aerobních studií, během nich a na jejich konci;
— pH, koncentrace kyslíku a oxidačně-redukční potenciál na začátku anaerobních studií a studií za podmínek rýžového pole, během nich a na jejich konci;
— metoda (metody) extrakce;
— metody kvantitativního stanovení a identifikace zkoušené látky a hlavních transformačních produktů v půdě a v absorpčních materiálech;
— počet duplikátních vzorků a počet kontrol.
Výsledky:
— výsledky stanovení mikrobiální aktivity;
— opakovatelnost a citlivost použitých analytických metod;
— hodnoty výtěžnosti (hodnoty v % pro platnou studii jsou uvedeny v oddíle 1.7.1);
— tabulky s výsledky vyjádřenými v % výchozí aplikované dávky, popřípadě v mg na kg půdy (vztaženo na hmotnost sušiny půdy);
— látková bilance během studií a na jejich konci;
— charakterizace neextrahovatelné (vázané) radioaktivity nebo reziduí v půdě;
— kvantifikace uvolněného CO
2
a dalších těkavých sloučenin;
— křivky závislostí koncentrací zkoušené látky, popřípadě hlavních transformačních produktů v půdě na čase;
— poločas nebo hodnoty DT
50
, DT
75
a DT
90
pro zkoušenou látku, popřípadě i pro hlavní transformační produkty včetně příslušných intervalů spolehlivosti;
— odhad rychlosti abiotického rozkladu za sterilních podmínek;
— posouzení kinetiky transformace pro zkoušenou látku, popřípadě i pro hlavní transformační produkty;
— případný návrh způsobu transformace;
— diskuse a interpretace výsledků;
— nezpracovaná data (tj. chromatogramy jednotlivých vzorků, příklady výpočtu rychlostí transformace a metody použité pro identifikaci transformačních produktů).
XXIII.4. LITERATURA
(1) US- Environmental Protection Agency (1982). Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate.
(2) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate. Guidelines for registration of pesticides in Canada.
(3) Evropská unie (EU) (1995). Směrnice Komise 95/36/ES ze dne 14. července 1995, kterou se mění směrnice Rady 91/414/EHS o uvádění přípravků na ochranu rostlin na trh. Příloha II část A a příloha III část A: Rozpad a chování v životním prostředí.
(4) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1995). Application for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.
(5) BBA (1986). Richtlinie für die amtliche Prüfung von Pflanzenschutzmitteln, Teil IV, 4-1. Verbleib von Pflanzenschutzmitteln im Boden – Abbau, Umwandlung und Metabolismus.
(6) ISO/DIS 11266 (1994). Soil Quality – Guidance on laboratory tests for biodegradation of organic chemicals in soil, Technical Committee ISO/TC 190/SC 4.
(7) ISO 14239 (1997E). Soil Quality – Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.
(8) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Vyd. Mark R. Lynch.
(9) MAFF – Japan 2000 – Draft Guidelines for transformation studies of pesticides in soil – Aerobic metabolism study in soil under paddy field conditions (flooded).
(10) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments. Belgirate, Itálie, 18. – 20. ledna 1995.
(11) Guth, J. A. (1980). The study of transformations. In: Interactions between Herbicides and the Soil (Vyd. R. J. Hance), Academic Press, 123 – 157.
(12) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley – VCH (1998).
(13) T. R. Roberts: Non-extractable pesticide residue in soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984)
(14) OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil (přijato 12. května 1981)
(15) ISO 10381-6 (1993). Soil Quality – Sampling – Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
(16) Příloha V směrnice 67/548/EHS
(17) Guth, J. A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In: Progress in Pesticide Biochemistry. Vyd. D. H. Hutson, T. R. Roberts, J. Wiley & Sons. Vol 1, 85 – 114.
(18) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) a Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).
(19) Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Mineralogical Methods. Vyd. A. Klute, Agronomy Series No 9, 2. vydání.
(20) Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Microbiological Properties. Vyd. A. L. Page, R. H. Miller, D. R. Kelney, Agronomy Series No 9, 2. vydání.
(21) ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality – General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis, 1. vydání.
(22) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.
(23) Scheffer, F., Schachtschabel, P. (1975). Lehrbuch der Bodenkunde. F. Enke Verlag, Stuttgart.
(24) Anderson, J. P. E., Domsch, K. H. (1978). A physiological method for the quantitative measurement of microbial biomass in soils. Soil Biol. Biochem. 10, 215 – 221.
(25) ISO 14240-1 and 2 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration method. Part 2: Fumigation- extraction method.
(26) Anderson, J. P. E. (1987). Handling and storage of soils for pesticide experiments. In: Pesticide Effects on Soil Microflora. Vyd. L. Somerville, M. P. Greaves, Taylor & Francis, 45 – 60.
(27) Kato, Yasuhiro. (1998). Mechanism of pesticide transformation in the environment: Aerobic and bio- transformation of pesticides in aqueous environment. Proceedings of the 16th Symposium on Environmental Science of Pesticide, 105 – 120.
(28) Keuken O., Anderson J. P. E. (1996). Influence of storage on biochemical processes in soil. In: Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 59 – 63 (SETAC- Europe).
(29) Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjödahl-Svensson K., Stenström J., Torstensson L. (1996). Effect of freeze and cold storage of soil on microbial activities and biomass. In: Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 68-69 (SETAC-Europe).
(30) Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R. (1987). Effects of ethylene oxide on soil microbial content and some chemical characteristics. Plant and Soil 102, 197- 200.
(31) Anderson, J. P. E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146.
(32) Hamaker, J. W. (1976). The application of mathematical modelling to the soil persistence and accumulation of pesticides. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, 181-199.
(33) Goring, C. A. I., Laskowski, D. A., Hamaker, J. W., Meikle, R. W. (1975). Principles of pesticide degradation in soil. In: Environmental Dynamics of Pesticides. Vyd. R. Haque, V. H. Freed, 135 – 172.
(34) Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986). Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. II. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer 39, 188 –204.
(35) Timme, G., Frehse, H. (1980). Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer 33, 47 – 60.
(36) Gustafson D. I., Holden L. R. (1990). Non-linear pesticide dissipation in soil; a new model based on spatial variability. Environm. Sci. Technol. 24, 1032 – 1041.
(37) Hurle K., Walker A. (1980). Persistence and its prediction. In: Interactions between Herbicides and the Soil. Vyd. R. J. Hance, Academic Press, 83 – 122.
DODATEK 1
TLAK VODY, POLNÍ KAPACITA (PK) A RETENČNÍ VODNÍ KAPACITA (RVK)
----------------------------------------------------------
  Výška       pFa      barb                  Poznámky
 vodního
 sloupce
   [cm]
----------------------------------------------------------
10
7
7 104 Suchá půda 1,6*10
4
4,2 16 Bod vadnutí 10
4
4 10 10
3
3 1 6*10
2
2,8 0,6 3,3*10
2
2,5 0,33c 10
2
2 0,1 -+ 60 1,8 0,06 |- Rozpětí polní kapacityd 33 1,5 0,033 -+ 10 1 0,01 RVK (přibližná hodnota) 1 0 0,001 Půda nasycená vodou ---------------------------------------------------------- a pF = dekadický logaritmus výšky vodního sloupce v cm. b 1 bar = 105 Pa. c Odpovídá přibližnému obsahu vody při složení 10 % písku, 35 % hlíny a 45 % jílu. d Polní kapacita není konstanta, ale mění se v závislosti na druhu půdy od pF 1,5 do 2,5.
Tlak vody se vyjadřuje v cm vodního sloupce nebo v jednotkách bar. Vzhledem k velkému rozpětí se sací tlak vyjadřuje jednoduše jako hodnota pF, která je ekvivalentní logaritmu vodního sloupce v cm.
Polní kapacita je definována jako množství vody, které přírodní půda po delším deštivém období nebo po dostatečném zavlažení udrží proti gravitaci 2 dny. Stanovuje se u neporušené půdy v polním pokusu. Naměřená hodnota tedy není použitelná pro laboratorní vzorky porušené půdy. Hodnoty PK stanovené u porušených půd mohou vykazovat větší systematické odchylky.
Retenční vodní kapacita (RVK) se stanovuje v laboratoři u neporušené i porušené půdy tak, že se kapilárním vzlínáním nasytí sloupec půdy vodou. Využije se zejména u porušených půd, kdy může být RVK až o 30 % vyšší než polní kapacita (1). Také se stanovuje snadněji než spolehlivé hodnoty PK.
DODATEK 2
VLHKOST PůDY (v g vody na 100 g sušiny) U RŮZNÝCH DRUHŮ PŮD Z RŮZNÝCH ZEMÍ
-------------------------------------------------------------                            
    Druh půdy         Země             Vlhkost půdy při
                                 RVK1    pF = 1,8    pF = 2,5
-------------------------------------------------------------
Písčitá            Německo       28,7        8,8        3,9
Hlinitopísčitá     Německo       50,4       17,9       12,1
Hlinitopísčitá     Švýcarsko     44,0       35,3        9,2
Prachovitohlinitá  Švýcarsko     72,8       56,6       28,4
Jílovitohlinitá    Brazílie      69,7       38,4       27,3
Jílovitohlinitá    Japonsko      74,4       57,8       31,4
Písčitohlinitá     Japonsko      82,4       59,2       36,0
Prachovitohlinitá  USA           47,2       33,2       18,8
Písčitohlinitá     USA           40,4       25,2       13,3
-------------------------------------------------------------
1 Retenční vodní kapacita
DODATEK 3
Obrázek 1
  Příklad průtokové aparatury pro studium transformace
     chemických látek v půdě (viz literatura 1 a 2)




1: jehlový ventil 4: baňka pro 7, 8: zátka studium z hydroxidu metabolismu sodného pro v půdě (zalitá zachycení CO
2
vodou pouze a jiných v případě kyselých anaerobních těkavých podmínek a látek podmínek rýžového pole) 2: promývačka s vodou 5: baňka 9: průtokoměr s ethylenglykol em pro zachycení organických těkavých sloučenin 3: ultramembrána 6: baňka (pouze ve s kyselinou sterilních sírovou pro podmínkách), zachycení velikost pórů alkalických 0,2 m těkavých sloučenin Obrázek 2 Příklad biometrické baňky pro studium transformace chemických látek v půdě (viz literatura 3)


(1) Guth, J. A. (1980). The study of transformations. In: Interactions between Herbicides and the Soil. Vyd. R. J. Hance, Academic Press, 123 – 157. (2) Guth, J. A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In: Progress in Pesticide Biochemistry. Vyd. D.H. Hutson, T.R. Roberts, J. Wiley & Sons. Vol 1, 85 – 114. (3) Anderson, J. P. E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141 – 146.
XXIV. METODA PRO STANOVENÍ AEROBNÍ A ANAEROBNÍ TRANSFORMACE V SYSTÉMECH VODA-SEDIMENT (metoda C.24 podle přílohy směrnice 2004/73/ES ze dne 29. dubna 2004, kterou se po dvacáté deváté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek)
XXIV.1.METODA
Tato zkušební metoda je replikou metody OECD TG 308 (2002).
XXIV.1.1 ÚVOD
Chemické látky se mohou dostat do mělkých nebo hlubokých povrchových vod takovými cestami, jako jsou přímá aplikace, unášení postřiku, odtok, ukládání odpadu, průmyslové, komunální nebo zemědělské emise a atmosférický spad. V této zkušební metodě je popsán laboratorní postup posouzení aerobní a anaerobní transformace organických chemických látek v systémech voda- sediment. Je založena na doporučeních a směrnicích národních a mezinárodních organizací (viz literatura 1 až 8). Tyto studie jsou požadovány u látek, které jsou aplikovány bezprostředně do vody nebo které se mohou dostat do vody výše uvedenými cestami.
Podmínky ve vrchní vodní fázi přírodních systémů voda-sediment jsou často aerobní. Podmínky v povrchové vrstvě sedimentu mohou být buď aerobní, nebo anaerobní, zatímco podmínky hlouběji v sedimentu jsou obvykle anaerobní. S cílem zahrnout všechny tyto možnosti je v tomto dokumentu popsána zkouška jak za aerobních podmínek, tak za anaerobních podmínek. Aerobní zkouškou se simuluje aerobní vodní sloupec nad aerobní vrstvou sedimentu, pod níž leží vrstva s anaerobním gradientem. Anaerobní zkouška simuluje zcela anaerobní systém voda-sediment. Pokud je z okolností zřejmé, že je třeba se odchýlit od těchto doporučení, např. použít nedotčené střední vrstvy sedimentů nebo sedimenty, které mohly být exponovány zkoušenou látkou, existují jiné metody určené k tomuto účelu (viz literatura 9).
XXIV.1.2 DEFINICE
Ve všech případech je třeba používat jednotky mezinárodní soustavy jednotek (SI).
Zkoušená látka: jakákoli látka, ať již výchozí látka, nebo příslušné transformační produkty. Transformační produkty: všechny látky vznikající při biotických a abiotických transformačních reakcích zkoušené látky, včetně CO
2
a vázaných reziduí.
Vázaná rezidua: „Vázaná rezidua“ jsou sloučeniny v půdě, rostlině nebo v živočichu, které po extrakci zůstávají v matrici ve formě výchozí látky nebo jejího metabolitu (jejích metabolitů). Metoda extrakce nesmí podstatně měnit samotné sloučeniny nebo strukturu matrice. Povahu vazeb lze částečně vyjasnit extrakcí spojenou se změnami v matrici a náročnými analytickými technikami. Dosud byly tímto způsobem vyjasněny např. kovalentní, iontové a adsorpční vazby a rovněž záchyty. Tvorba vázaných reziduí obecně podstatně snižuje biologickou přístupnost a dostupnost (viz literatura 10) [upraveno IUPAC 1984 (viz literatura 11)].
Aerobní transformace: (oxidační): reakce, ke kterým dochází za přítomnosti kyslíku (viz literatura 12).
Anaerobní transformace: (redukční): reakce probíhající s vyloučením molekulárního kyslíku (viz literatura 12).
Sediment: je směs minerálních a organických chemických složek, přičemž organické složky obsahují sloučeniny s vysokým obsahem uhlíku a dusíku a vysokou molekulovou hmotností. Ukládají se v povrchových vodách a vytvářejí rozhraní s těmito vodami.
Mineralizace: je úplný rozklad organické sloučeniny na CO
2
a H
2
O za aerobních podmínek a na CH
4
, CO
2
a H
2
O za anaerobních podmínek. V rámci této zkušební metody, při níž se používají sloučeniny značené radioisotopy, se mineralizací rozumí rozsáhlý rozklad molekuly, při němž se značící atomy uhlíku kvantitativně oxidují nebo redukují, přičemž se uvolňuje odpovídající množství
14
CO
2
nebo
14
CH
4
. Poločas, t0,5, je čas, za který dojde k 50% transformaci zkoušené látky, jestliže lze transformaci popsat kinetikou prvního řádu; nezávisí na počáteční koncentraci.
DT
50
(doba odbourání 50): doba, za kterou se počáteční koncentrace zkoušené látky sníží o 50 %.
DT
75
(doba odbourání 75): doba, za kterou se počáteční koncentrace zkoušené látky sníží o 75 %.
DT
90
(doba odbourání 90): doba, za kterou se počáteční koncentrace zkoušené látky sníží o 90 %.
XXIV.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Referenční látky by měly být použity pro identifikaci a kvantitativní stanovení transformačních produktů spektroskopickými a chromatografickými metodami.
XXIV.1.4 INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE
Pro stanovení rychlosti transformace lze použít jak látky neznačené radioisotopy, tak značené látky, přičemž značené materiály jsou upřednostňovány. Značený materiál je nezbytný pro studium způsobu transformace a pro stanovení látkové bilance. Doporučuje se značení isotopem
14
C, avšak užitečné mohou být i jiné isotopy, např.
13
C,
15
N,
3
H,
32
P. Značena by měla být pokud možno nejstabilnější část (části) molekuly. Pokud například látka obsahuje kruh, je třeba tento kruh označit; pokud látka obsahuje dva nebo více kruhů, může být nezbytné provést samostatné studie za účelem stanovení osudu každého z označených kruhů, a získat tak vhodné informace o tvorbě transformačních produktů. Chemická a/nebo radiochemická čistota látky by měla být alespoň 95 %.
Před provedením zkoušky by měly být k dispozici tyto informace o látce:
a) rozpustnost ve vodě (metoda A.6);
b) rozpustnost v organických rozpouštědlech;
c) tlak par (metoda A.4) a Henryho konstanta;
d) rozdělovací koeficient n-oktanol/voda (metoda A.8);
e) adsorpční koeficient (podle potřeby Kd, Kf nebo Koc) (metoda C.18);
f) hydrolýza (metoda C.7);
g) disociační konstanta (pKa) [směrnice OECD 112] (viz literatura 13);
h) chemická struktura zkoušené látky a případně poloha značícího nuklidu.
Poznámka: Ve zprávě se uvede teplota, při které byla měření prováděna.
Mezi další užitečné informace patří údaje o toxicitě zkoušené látky pro půdní mikroorganismy, údaje o snadné nebo vlastní biologické rozložitelnosti a údaje o aerobní a anaerobní transformaci v půdě.
K dispozici by měly být analytické metody (včetně extrakčních a izolačních metod) pro kvantitativní stanovení a identifikaci zkoušené látky a jejích transformačních produktů ve vodě a sedimentu (viz oddíl 1.7.2).
XXIV.1.5 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
V metodě popsané v této zkoušce se používají aerobní i anaerobní systémy voda-sediment (viz dodatek 1), které umožňují
i) měřit rychlost transformace zkoušené látky v systému voda-sediment,
ii)měřit rychlost transformace zkoušené látky v sedimentu,
iii) měřit rychlost mineralizace zkoušené látky a/nebo produktů její transformace (pokud se použije zkoušená látka značená isotopem
14
C),
iv)identifikaci a kvantitativní stanovení produktů transformace ve vodě a v sedimentu, včetně látkové bilance (pokud se použije značená zkoušená látka),
v) měřit distribuci zkoušené látky a produktů její transformace mezi dvěma fázemi během inkubace v temnu (aby nedošlo např. k vykvetení řas) při konstantní teplotě. Pokud to údaje umožňují, stanoví se poločasy a hodnoty DT
50
, DT
75
a DT
90
, které by však neměly být příliš extrapolovány mimo obor experimentálních hodnot (viz oddíl 1.2).
Pro aerobní i anaerobní studie jsou nezbytné alespoň dva sedimenty a příslušné vodní fáze (viz literatura 7). V některých případech by však měly být použity více než dva systémy voda-sediment, např. u chemických látek, které mohou být přítomny ve sladkovodním i mořském ekosystému.
XXIV.1.6 POUŽITELNOST ZKOUŠKY
Tato je metoda je použitelná pro všechny chemické látky (neznačené nebo značené radioaktivními isotopy), pro něž je k dispozici analytická metoda s dostatečnou správností a citlivostí. Je použitelná pro mírně těkavé a netěkavé sloučeniny rozpustné nebo špatně rozpustné ve vodě. Zkouška by neměla být použita u látek, které z vody silně těkají (např. fumiganty, organická rozpouštědla), a nelze je tedy ve vodě nebo v sedimentu udržet za experimentálních podmínek této zkoušky.
Tato metoda je dosud používána ke studiu transformace chemických látek ve sladkovodním systému voda-sediment, avšak může být v zásadě použita také na estuarní a mořské systémy. Není vhodná k simulaci podmínek v tekoucích vodách (např. řekách) nebo na otevřeném moři.
XXIV.1.7 KRITÉRIA JAKOSTI
XXIV.1.7.1 Výtěžnost
Extrakce a analýza provedená alespoň u dvou duplikátních vzorků systému voda-sediment ihned po přidání zkoušené látky poskytne první informaci o opakovatelnosti analytické metody a o stejnoměrnosti aplikace zkoušené látky. Výtěžnosti pozdějších stupňů experimentu se zjistí z příslušných látkových bilancí (pokud se použije značený materiál). Výtěžnosti by se měly nacházet v rozmezí 90 % až 110 % u značených chemických látek (viz literatura 6) a v rozmezí 70 % až 110 % u neznačených chemických látek.
XXIV.1.7.2 Opakovatelnost a citlivost analytické metody
Opakovatelnost analytické metody (kromě účinnosti první extrakce) pro kvantitativního stanovení zkoušené látky a transformačních produktů lze ověřit provedením analýzy duplikátních vzorků týchž extraktů vzorků vody nebo sedimentu, které byly dostatečně dlouho inkubovány, aby došlo k vytvoření transformačních produktů.
Mez detekce analytické metody (LOD) pro zkoušenou látku a pro transformační produkty by měla být alespoň 0,01 mg na kg vody nebo sedimentu (pro zkoušenou látku) nebo 1 % výchozího množství aplikovaného do zkušebního systému, podle toho, která z hodnot je nižší. Rovněž by měla být specifikována mez kvantitativní stanovitelnosti (LOQ).
XXIV.1.7.3 Správnost dat o transformaci
Regresní analýza závislosti koncentrace zkoušené látky na čase poskytuje vhodné informace o správnosti transformační křivky a umožňuje vypočítat intervaly spolehlivosti pro poločasy (v případě zdánlivé kinetiky prvního řádu) nebo pro hodnoty DT50 a popřípadě hodnoty DT
75
a DT
90
.
XXIV.1.8 POPIS METODY
XXIV.1.8.1 Zkušební systém a aparatura
Studie se provede se skleněnými nádobami (např. baňkami, centrifugačními kyvetami), pokud z předběžných informací (např. z rozdělovacího koeficientu n-oktanol/voda, ze sorpčních dat atd.) nevyplývá, že látka může ulpívat na skle; v takovém případě lze zvážit použití náhradního materiálu (např. teflonu). Pokud je o zkoušené látce známo, že ulpívá na skle, lze problém zmírnit jednou z následujících metod:
— stanovením hmotnosti zkoušené látky a transformačních produktů sorbovaných na skle;
— zajištěním, aby se na konci zkoušky omylo rozpouštědlem veškeré laboratorní sklo;
— použitím komerční úpravy přípravků (viz také oddíl 1.9.2);
— použitím většího množství pomocného rozpouštědla za účelem přidání zkoušené látky do systému; pokud se použije pomocné rozpouštědlo, nesmí štěpit zkoušenou látku solvolýzou.
Příklady typických zkušebních aparatur, tj. průtokové a biometrické systémy, jsou uvedeny v dodatcích 2 a 3 (viz literatura 14). Jiné užitečné inkubační systémy jsou popsány v literatuře (viz literatura 15). Experimentální aparatura by měla být konstruována tak, aby byla možná výměna vzduchu nebo dusíku a zachycení těkavých produktů. Rozměry aparatury musí splňovat požadavky zkoušky (viz oddíl 1.9.1). Ventilace musí být zajištěna buď jemným probubláváním, nebo proháněním vzduchu nebo dusíku nad hladinou vody. V druhém případě se doporučuje vodu seshora mírně promíchávat, aby docházelo k lepší distribuci kyslíku nebo dusíku ve vodě. Neměl by se použít vzduch zbavený CO
2
, neboť by došlo ke zvýšení pH vody. V žádném případě není žádoucí, aby došlo ke zvíření sedimentu, a je tomu třeba pokud možno zabránit. Slabě těkavé chemické látky se zkoušejí v biometrickém systému za mírného promíchávání vodní hladiny. Lze rovněž použít uzavřené nádobky s volným objemem pod víčkem vyplněným atmosférickým vzduchem nebo dusíkem a vnitřní ampulky pro zachycování těkavých produktů (viz literatura 16). U aerobních zkoušek je nezbytná pravidelná výměna plynu pod víčkem, aby se vyrovnávala spotřeba kyslíku biomasou.
Mezi vhodné lapače pro shromažďování těkavých transformačních produktů patří kromě jiných roztok hydroxidu draselného nebo sodného o koncentraci 1 mol*dm-3 pro zachytávání oxidu uhličitého a ethylenglykol, ethanolamin nebo 2% parafín v xylenu pro organické sloučeniny. Vzhledem k tomu, že alkalické roztoky absorbují oxid uhličitý ze vzduchu určeného k provzdušňování a oxid uhličitý uvolňující se respirací v aerobních experimentech, musí být pravidelně vyměňovány, aby se nevyčerpala jejich absorpční kapacita.Těkavé látky tvořící se za anaerobních podmínek, např. methan, lze zachytávat na molekulovém sítu. Takové těkavé látky lze spálit např. na CO
2
v křemenné trubičce za přítomnosti CuO při teplotě 900 st.C a vzniklý CO
2
lze zachytit v absorbéru s alkálií (viz literatura 17).
Pro chemickou analýzu zkoušené látky a transformačních produktů jsou nezbytné laboratorní přístroje (např. přístroje pro plynovou chromatografii s kapalinovou stacionární fází (GLC), vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (HPLC), pro chromatografii na tenké vrstvě (TLC), hmotnostní spektrometrii (MS), kombinaci plynové chromatografie a hmotnostní spektrometrie (GC-MS), kombinaci kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie (LC-MS), jadernou magnetickou rezonanci (NMR) atd.), včetně detekčních systémů pro detekci sloučenin značených nebo neznačených radioisotopy. Pokud se použije materiál značený radioisotopy, je třeba mít k dispozici scintilační spektrometr a zařízení pro spalování za přítomnosti oxidačního činidla (pro spalování vzorků sedimentů před radiometrickým měřením). Další standardní laboratorní vybavení pro fyzikálně­chemická a biologická stanovení (viz oddíl 1.8.2.2 tabulka 1), laboratorní sklo, chemikálie a činidla se použijí podle potřeby.
XXIV.1.8.2 Výběr a počet vodních sedimentů
Místa odběru by měla být vybrána podle účelu zkoušky v dané situaci. Při výběru místa odběru vzorků musí být přihlédnuto k historii případných zemědělských, průmyslových nebo komunálních vstupů do povodí a do vod proti proudu. Sedimenty by neměly být použity, pokud byly v předchozích 4 letech kontaminovány zkoušenou látkou nebo jejími strukturními analogy.
XXIV.1.8.2.1 Výběr sedimentů
Pro aerobní studie se obvykle použijí dva sedimenty (viz literatura 7). Tyto dva vybrané sedimenty by se měly lišit co do obsahu organického uhlíku a textury. Jeden sediment by měl mít vysoký obsah organického uhlíku (2,5 – 7,5 %) a jemnou texturu a druhý sediment by měl mít nízký obsah organického uhlíku (0,5 – 2,5 %) a hrubou texturu. Obsah organického uhlíku by se měl zpravidla lišit alespoň o 2 %. „Jemná textura“ je definována obsahem složky [jíl + prach] , ([jíl + prach] je minerální frakce sedimentu s velikostí částic < 50 µm) vyšším než 50 % a „hrubá textura“ je definována obsahem složky [jíl + prach] nižším než 50 %. Rozdíl v obsahu složek [jíl + prach] u obou sedimentů by měl být zpravidla alespoň 20 %. V případě, že se může chemikálie dostat do mořských vod, měl by alespoň jeden systém voda- sediment pocházet z moře.
Pro přísně anaerobní studii by měly být odebrány dva sedimenty (včetně příslušné vody) z anaerobních zón povrchových vod (viz literatura 7). Se sedimentem i vodní fází by mělo být zacházeno opatrně a měly by být přepravovány s vyloučením přístupu kyslíku.
Pro výběr sedimentu mohou být důležité i jiné parametry, které by měly být zvažovány případ od případu. Rozpětí pH sedimentů je například důležité pro zkoušení chemikálií, u nichž transformace a/nebo sorpce mohou záviset na pH. Závislost sorpce na pH by se mohla odrážet v hodnotě pKa zkoušené látky.
XXIV.1.8.2.2 Charakterizace vzorků systému voda- sediment
Klíčové parametry, které musí být jak u vody, tak u sedimentu měřeny a uvedeny ve zprávě (s odkazem na použitou metodu), a fáze zkoušky, ve které mají být měřeny, jsou shrnuty v níže uvedené tabulce. Metody stanovení těchto parametrů jsou pro informaci uvedeny v literatuře 18 až 21. Kromě toho může být případ od případu nezbytné měřit a uvádět další parametry (např. u sladkovodního systému: obsah částic, alkalita, tvrdost, vodivost, NO
3
/PO
4
(poměr jednotlivých hodnot); u sedimentů: kationtová výměnná kapacita, retenční vodní kapacita, obsah uhličitanů, celkový obsah dusíku a fosforu; u mořských systémů: salinita). Pro posouzení oxidačně-redukčních podmínek, a zejména v souvislosti s anaerobní transformací, může být také užitečná analýza sedimentů a vody na dusičnany, sírany, biologicky dostupné železo, popřípadě na jiné akceptory elektronů.
Měření parametrů pro charakterizaci vzorků systémů voda- sediment (viz literatura 7, 22 a 23)
-------------------------------------------------------------------------
 Parametr                       Fáze zkušebního postupu

             odběr v manipulace     zahájení   zahájení  samotná   konec
             terénu   po odběru   aklimatizace  zkoušky  zkouška  zkoušky

-------------------------------------------------------------------------
Voda
-------------------------------------------------------------------------
Původ/          x                                                     
zdroj

Teplota         x                                                     

pH              x                      x           x        x        x
TOC                                    x           x                 x

Koncentrace     x                      x           x        x        x
O
2
* Oxidačně- x x x x redukční potenciál* ------------------------------------------------------------------------- Sediment ------------------------------------------------------------------------- Původ/ x zdroj Hloubka x vrstvy pH x x x x x Distribuce x částic TOC x x x x Mikrobiální x x x biomasa** Oxidačně- Pozorování x x x x redukční potenciál* (barva/ zápach) ------------------------------------------------------------------------- * Výsledky nedávných výzkumů ukázaly, že měření koncentrace kyslíku ve vodě a oxidačně-redukčního potenciálu vody nemají vypovídací hodnotu, pokud jde o mechanismus růstu a vývoje mikrobiální populace v povrchových vodách, a nemají ani předpovědní hodnotu (viz literatura 24 a 25). Stanovení biochemické spotřeby kyslíku (BOD, při odběru vzorků v terénu a při zahájení a na konci zkoušky) a koncentrace mikro- a makroživin Ca, Mg a Mn ve vodě (při zahájení a na konci zkoušky) a měření celkového obsahu N a P v sedimentech (při odběru vzorků v terénu a na konci zkoušky) může být lepším nástrojem pro interpretaci a hodnocení rychlosti a způsobů aerobní biotransformace. ** Metoda měření rychlosti mikrobiální respirace (viz literatura 26), fumigační metoda (viz literatura 27) nebo měření počtu mikroorganismů (např. bakterií, aktinomycet, plísní a celkového počtu kolonií) pro aerobní studie; rychlost methanogeneze u anaerobních studií.
XXIV.1.8.3 Odběr vzorků, manipulace s nimi a jejich skladování
XXIV.1.8.3.1 Odběr
Vzorky sedimentu se odeberou podle návrhu směrnice ISO pro odběr vzorků sedimentů (viz literatura 8). Vzorky se odeberou z celé 5 až 10 cm silné horní vrstvy sedimentu. Současně se sedimentem se odebere z téhož místa nebo lokality příslušný vzorek vody. U anaerobní studie musí být sediment a příslušná voda odebrány a přepravovány s vyloučením přístupu kyslíku (viz literatura 28) (viz oddíl 1.8.2.1). V literatuře je popsáno několik odběrových zařízení (viz literatura 8 a 23).
XXIV.1.8.3.2 Manipulace
Sediment se oddělí od vody filtrací a poté se pomocí přebytku vody z místa odběru prosévá za mokra na 2mm sítu; voda se odstraní. Poté se v inkubační baňce v požadovaném poměru (viz oddíl 1.9.1) smísí známé množství sedimentu a vody a směs se připraví pro aklimatizaci (viz oddíl 1.8.4). U anaerobní studie musí být všechny kroky prováděny s vyloučením přístupu kyslíku (viz literatura 29 až 33).
XXIV.1.8.3.3 Skladování
V každém případě se doporučuje používat čerstvě odebraný sediment a vodu; je-li však skladování nezbytné, sediment s vodou se proseje výše popsaným způsobem a zalitý vodou (vrstva vody 6 – 10 cm) se skladuje v temnu při (4 +/-2) st.C (viz literatura 4) maximálně 4 týdny (viz literatura 7, 8 a 23). Vzorky pro aerobní studie se skladují za volného přístupu vzduchu (např. v otevřených nádobách), zatímco vzorky pro anaerobní studie se skladují s vyloučením přístupu kyslíku. Při přepravě a skladování nesmí sediment a voda zmrznout a sediment nesmí být vysušován.
XXIV.1.8.4 Příprava vzorků systému sediment-voda ke zkoušce
Před přidáním zkoušené látky musí proběhnout aklimatizace, při níž musí být vzorky sedimentu- vody umístěny v inkubační nádobě, která se použije při hlavní zkoušce; podmínky aklimatizace musí být totožné s podmínkami inkubace při zkoušce (viz oddíl 1.9.1). Doba aklimatizace je čas nezbytný pro dostatečnou stabilizaci systému, kterou lze posoudit podle pH, koncentrace kyslíku ve vodě, oxidačně-redukčního potenciálu sedimentu a vody a makroskopické separace fází. Doba aklimatizace není obvykle delší než jeden až dva týdny a neměla by překročit čtyři týdny. Výsledky měření provedených během této doby se uvedou ve zprávě.
XXIV.1.9 PROVEDENÍ ZKOUŠKY
XXIV.1.9.1 Zkušební podmínky
Zkouška se provede v inkubační aparatuře (viz oddíl 1.8.1) při poměru objemu vody a sedimentu 3:1 až 4:1, s vrstvou sedimentu 2,5 cm (+/- 0,5 cm). Doporučené minimální množství sedimentu na inkubační nádobu je 50 g (hmotnost sušiny). Z nedávných studií vyplývá, že skladování při 4 st.C může vést k poklesu obsahu organického uhlíku v sedimentu, který by mohl případně vést k poklesu mikrobiální aktivity. Zkouška se provádí v temnu za konstantní teploty v rozmezí 10 až 30 st.C. Vhodná je teplota (20 +- 2) st.C. Podle potřeby lze případ od případu v závislosti na zaměření zkoušky zvolit další, nižší teplotu (např. 10 st.C). Inkubační teplota se sleduje a uvede se ve zprávě.
XXIV.1.9.2 Úprava zkoušené látky a její aplikace
Použije se jedna zkušební koncentrace chemické látky. Zkouška s druhou koncentrací může být užitečná u chemických látek, které se dostávají do vod různými cestami, a vykazují tedy významně odlišné koncentrace, pokud lze nižší koncentraci analyzovat s dostatečnou správností. U přípravků na ochranu rostlin aplikovaných přímo do vodního tělesa se použije maximální dávkování uvedené na etiketě jako maximální aplikovaná dávka vypočtená podle plochy hladiny vody ve zkušební nádobě. Ve všech ostatních případech se použije koncentrace založená na odhadech emise do životního prostředí. Je třeba spolehlivě zajistit, aby byla aplikována dostatečná koncentrace zkoušené látky pro charakterizaci postupu transformace a tvorby a odbourávání transformačních produktů. V situaci, kdy se koncentrace zkoušené látky na začátku studie blíží mezím detekce a/nebo kdy by nebylo možné detekovat hlavní transformační produkty, jsou-li přítomny v množství odpovídajícím 10 % výchozí aplikované dávky, může být nezbytné aplikovat vyšší dávky (např. 10krát vyšší). Použité vyšší koncentrace však nesmí mít významné nepříznivé účinky na mikrobiální aktivitu v systému voda-sediment. S cílem dosáhnout konstantní koncentrace v nádobách různých rozměrů může být nezbytné upravit množství použitého materiálu, přičemž se vychází z výšky vodního sloupce v nádobě v poměru k hloubce vody v odběrovém místě (předpokládá se hloubka 100 cm, možná je však i jiná hloubka). Příklad výpočtu je uveden v dodatku 4.
V ideálním případě se zkoušená látka aplikuje do vodné fáze zkoušeného systému ve formě vodného roztoku. Je-li to nevyhnutelné, je přípustné použít pro aplikaci a rozptýlení zkoušené látky malé množství rozpouštědla mísitelného s vodou (např. acetonu nebo ethanolu), avšak jeho množství by nemělo překročit 1 % (obj.) a rozpouštědlo by nemělo mít nepříznivé účinky na mikrobiální aktivitu ve zkušebním systému. Přípravě vodného roztoku zkoušené látky je třeba věnovat pozornost a k zajištění naprosté homogenity může být vhodné použít generátorové kolony a předem připravené směsi. Po přidání vodného roztoku do zkušebního systému se doporučuje vodnou fázi mírně promíchat tak, aby se sediment zvířil co nejméně.
Použití komerčních úprav přípravků se nedoporučuje, neboť složky přípravku mohou mít vliv na distribuci zkoušené látky a/nebo transformačních produktů mezi vodu a sediment. U špatně rozpustných zkoušených látek však může být použití komerční úpravy vhodnou možností.
Počet inkubačních nádob závisí na počtu intervalů, v nichž mají být prováděny odběry (viz oddíl 1.9.3). Je třeba nasadit dostatečný počet zkušebních systémů, aby bylo možné v každém intervalu vyhodnotit dva systémy. Použijí-li se pro každý systém voda-sediment kontrolní systémy, neexponují se zkoušené látce. Kontrolní systémy lze použít pro stanovení mikrobiální biomasy sedimentu a celkového organického uhlíku ve vodě na konci studie. Dva kontrolní systémy (tj. po jednom kontrolním systému z každého systému voda- sediment) mohou být použity pro sledování požadovaných parametrů v sedimentu a ve vodě v průběhu aklimatizace (viz tabulka v oddílu 1.8.2.2). Dva další kontrolní systémy musí být nasazeny za účelem měření nepříznivých účinků na mikrobiální aktivitu ve zkušebním systému v případě, že se zkoušená látka aplikuje pomocí rozpouštědla.
XXIV.1.9.3 Délka zkoušky a odběry vzorků
Délka experimentu by neměla překročit 100 dnů (6) a experiment by měl trvat tak dlouho, dokud se nestanoví způsob rozkladu a distribuce ve vodě/sedimentu, nebo dokud se transformací a/nebo těkáním nevyčerpá 90 % zkoušené látky. Odběr by měl být proveden nejméně v šesti časech (včetně času 0), přičemž vhodný režim odběrů a délka zkoušky se stanoví nepovinnou orientační studií (viz oddíl 1.9.4), nejsou-li k dispozici vhodné údaje o zkoušené látce z dřívějších studií. U hydrofobních zkoušených látek může být potřeba dodatečným vzorkováním v průběhu počáteční fáze studie zjistit stupeň distribuce mezi vodu a sediment.
V příslušnou dobu se k analýze odebere celý obsah inkubačních nádob (včetně duplikátních nádob). Sediment a voda nad sedimentem se analyzují zvlášť. Může-li snadno docházet k rychlé opětovné oxidaci produktů anaerobní transformace, měly by být během odběru a analýzy zachovány anaerobní podmínky.
Voda se za minimálního zvíření sedimentu opatrně odebere. Vhodnými analytickými postupy se provedou extrakce a charakterizace zkoušené látky a transformačních produktů. Je třeba také pečlivě shromáždit materiál, který může být adsorbován na inkubační nádobě nebo ve spojovacích trubičkách použitých k zachycení těkavých látek.
XXIV.1.9.4 Nepovinná orientační zkouška
Pokud nelze délku etapy, kdy jsou odebírány vzorky, odhadnout z jiných relevantních studií zkoušené látky, lze případně provést orientační zkoušku, která se provede za týchž zkušebních podmínek, jaké jsou navrženy pro hlavní studii. Příslušné podmínky a výsledky orientační zkoušky, pokud byla provedena, by měly být v krátkosti uvedeny ve zprávě.
XXIV.1.9.5 Měření a analýza
Pro každý čas odběru se provede měření koncentrace zkoušené látky a transformačních produktů ve vodě a v sedimentu a výsledky se uvedou ve zprávě (jako koncentrace a v procentech aplikovaného množství). V zásadě by měla být při každém odběru provedena identifikace transformačních produktů, které obsahují >= 10 % radioaktivity aplikované do celého systému voda- sediment, pokud nejsou dostatečné důvody proti tomu. Měly by být také identifikovány transformační produkty, jejichž koncentrace v průběhu studie nepřetržitě roste, třebaže nedosahuje výše uvedené meze, neboť to může znamenat, že se jedná o perzistentní produkty. Tento postup by měl být zvážen případ od případu a ve zprávě by měl být odůvodněn.
Pro každý čas odběru se uvedou výsledky ze systémů pro zachycování plynů/těkavých látek (CO
2
a jiných těkavých organických sloučenin). Uvede se rychlost mineralizace. Pro každý čas odběru se uvedou neextrahovatelná (vázaná) rezidua v sedimentu.
XXIV.2.DATA
XXIV.2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ
Pro každý čas odběru se vypočte celková látková bilance nebo výtěžnost (viz oddíl 1.7.1) přidané radioaktivity. Výsledky se uvedou v procentech přidané radioaktivity. Pro každý čas odběru se uvede distribuce radioaktivity mezi vodu a sediment (vyjádřeno v koncentracích a v procentech).
Pro zkoušenou látku se vypočítá poločas a hodnoty DT50 a popřípadě hodnoty DT
75
a DT
90
a intervaly spolehlivosti těchto hodnot (viz oddíl 1.7.3). Vhodnými hodnotícími nástroji lze zjistit míru zániku zkoušené látky ve vodě a v sedimentu. Může jít o použití zdánlivé kinetiky prvního řádu, o techniky proložení empirické křivky za použití grafického nebo numerického řešení a o složitější hodnocení, např. pomocí modelu s jednou nebo více složkami. Další podrobné informace lze získat z publikované literatury 35 až 37).
Všechny přístupy mají své silné a slabé stránky a značně se liší v komplexnosti. Předpoklad kinetiky prvního řádu může být sice přílišným zjednodušením procesu rozkladu a distribuce, vede však v ideálním případě k hodnotám (rychlostní konstantě nebo poločasu), které jsou snadno srozumitelné a mají význam pro simulační modelování a výpočet předpokládaných koncentrací v životním prostředí. Empirický přístup nebo lineární transformace mohou vést k lepšímu proložení dat křivkami, a tedy k lepšímu odhadu poločasů, hodnot DT
50
a popřípadě DT
75
a DT
90
. Použití odvozených konstant však má své meze. Složkové modely mohou poskytovat řadu užitečných konstant, které jsou důležité pro posouzení rizika a pro popis rozkladu chemické látky v různých složkách a pro její distribuci. Použijí se rovněž pro odhad rychlostních konstant tvorby a rozkladu hlavních transformačních produktů. V každém případě však musí být volba metody odůvodněna a experimentátor by měl graficky nebo statisticky prokázat její oprávněnost.
XXIV.3.ZPRÁVY
XXIV.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
Protokol musí obsahovat následující informace:
Zkoušená látka:
— obecný název, chemický název, číslo CAS, strukturní vzorec (s uvedením polohy značícího nuklidu u látek značených radionuklidy) a relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti;
— čistota zkoušené látky (obsah nečistot);
— popřípadě radiochemická čistota značené chemické látky a molární aktivita.
Referenční látky:
— chemický název a struktura referenčních látek použitých k charakterizaci a/nebo identifikaci transformačního produktu.
Zkušební sedimenty a vody:
— lokalita a popis odběrového místa (odběrových míst) sedimentu a vody, pokud možno včetně dřívější kontaminace;
— všechny informace týkající se odběru, případného skladování a aklimatizace systému voda-sediment;
— charakteristiky vzorků systému voda-sediment, jak jsou uvedeny v tabulce v oddílu 1.8.2.2.
Zkušební podmínky:
— použitý zkušební systém (např. průtokový systém, biometrický systém, způsob provzdušňování, způsob míchání, objem vody, hmotnost sedimentu, tloušťka vrstvy vody i sedimentu, rozměry zkušebních nádob atd.);
— aplikace zkoušené látky do systému: použitá zkušební koncentrace, počet duplikátních vzorků a kontrol, způsob aplikace zkoušené látky (např. případné použití rozpouštědla) atd.
— inkubační teplota;
— doby odběru;
— metody extrakce a účinnosti extrakce, analytické metody a meze detekce;
— metody charakterizace/identifikace transformačních produktů;
— odchylky od zkušebního postupu nebo zkušebních podmínek.
Výsledky:
— původní číselná data reprezentativních analýz (všechna původní data musí být uložena v archivu vedeném podle zásad správné laboratorní praxe);
— opakovatelnost a citlivost použitých analytických metod;
— hodnoty výtěžnosti (hodnoty v % pro platnou studii jsou uvedeny v oddíle 1.7.1);
— výsledky pro zkoušenou látku, popřípadě i pro transformační produkty a neextrahovatelnou radioaktivitu, zpracované v tabulkové formě a vyjádřené v % aplikované dávky a v mgkg
­1
pro vodu, sediment a celý systém (pouze v %);
— látková bilance během studií na jejich konci;
— grafické schéma transformace ve vodě a sedimentu a v celém systému (včetně mineralizace);
— rychlosti mineralizace;
— poločas, hodnoty DT
50
a popřípadě DT
75
a DT
90
pro zkoušenou látku, popřípadě i pro hlavní transformační produkty, včetně intervalů spolehlivosti, pro vodu, sediment a celý systém;
— charakteristika kinetiky transformace zkoušené látky, popřípadě i hlavních transformačních produktů;
— případný návrh způsobu transformace;
— diskuse o výsledcích.
XXIV.4.LITERATURA
(1) BBA-Guidelines for the examination of plant protectors in the registration process. (1990). Part IV, Section 5-1: Degradability and fate of plant protectors in the water/sediment system. Germany.
(2) Commission for registration of pesticides: Application for registration of a pesticide. (1991). Part G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air, Section G.2.1 (a). The Netherlands.
(3) MAFF Pesticides Safety Directorate. (1992). Preliminary guideline for the conduct of biodegradability tests on pesticides in natural sediment/water systems. Ref No SC 9046. United Kingdom.
(4) Agriculture Canada: Environmental chemistry and fate. (1987). Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic (Laboratory) –Anaerobic and aerobic. Canada. 35 – 37.
(5) US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental fate (1982). Section 162 – 3, Anaerobic aquatic metabolism.
(6) SETAC-Europe publication. (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides. Vyd. Dr. Mark R. Lynch. SETAC-Europe, Brussels.
(7) OECD Test Guidelines Programme. (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/sediments, Belgirate, Italy, 18. – 20. ledna 1995.
(8) ISO 5667-12. (1995). Water quality – Sampling – Part 12: Guidance on sampling of bottom sediments, Technical Committee ISO/TC 146/SC 6.
(9) US-EPA (1998a). Sediment/water microcosm biodegradation test. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3180). EPA 712-C-98- 080.
(10) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley-VCH (1998).
(11) T. R. Roberts: Non-extractable pesticide residues in soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).
(12) OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegradability in Soil (přijato 12. května 1981).
(13) OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals. Paris. OECD (1994-2000): Addenda 6- 11 to Guidelines for the Testing of Chemicals.
(14) Scholz, K., Fritz R., Anderson C., Spiteller M. (1988) Degradation of pesticides in an aquatic model ecosystem. BCPC – Pests and Diseases, 3B-4, 149 – 158.
(15) Guth, J. A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In: Progress in Pesticide Biochemistry. Vyd. D. H. Hutson, T. R. Roberts, J. Wiley & Sons, Vol. 1, 85 – 114.
(16) Madsen, T., Kristensen, P. (1997). Effects of bacterial inoculation and non- ionic surfactants on degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil. Environ. Toxicol. Chem. 16, 631 – 637.
(17) Steber, J., Wierich, P. (1987). The anaerobic degradation of detergent range fatty alcohol ethoxylates. Studies with 14C- labelled model surfactants. Water Research 21, 661 – 667.
(18) Black, C. A. (1965). Methods of Soil Analysis. Agronomy Monograph No. 9. American Society of Agronomy, Madison.
(19) APHA (1989). Standard Methods for Examination of Water and Wastewater (17. vyd.). American Public Health Association, American Water Works Association and Water Pollution Control Federation, Washington D.C.
(20) Rowell, D. L. (1994). Soil Science Methods and Applications. Longman.
(21) Light, T. S. (1972). Standard solution for redox potential measurements. Anal. Chem. 44, 1038 – 1039.
(22) SETAC-Europe publication (1991). Guidance document on testing procedures for pesticides in freshwater mesocosms. From the Workshop „A Meeting of Experts on Guidelines for Static Field Mesocosms Tests“, 3. – 4. června 1991.
(23) SETAC-Europe publication. (1993). Guidance document on sediment toxicity tests and bioassays for freshwater and marine environments. From the Workshop „On Sediment Toxicity Assessment (WOSTA)”, 8. – 10. listopadu 1993. Vyd. I. R. Hill, P. Matthiessen, F. Heimbach.
(24) Vink, J. P. M., van der Zee, S. E. A. T. M. (1997). Pesticide biotransformation in surface waters: multivariate analyses of environmental factors at field sites. Water Research 31, 2858 – 2868.
(25) Vink, J. P. M., Schraa, G., van der Zee, S. E. A. T. M. (1999). Nutrient effects on microbial transformation of pesticides in nitrifying waters. Environ. Toxicol, 329 – 338.
(26) Anderson, T. H., Domsch, K. H. (1985). Maintenance carbon requirements of actively- metabolising microbial populations under in- situ conditions. Soil Biol. Biochem. 17, 197 – 203.
(27) ISO-14240-2. (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.
(28) Beelen, P. Van, F. Van Keulen. (1990), The Kinetics of the Degradation of Chloroform and Benzene in Anaerobic Sediment from the River Rhine. Hydrobiol. Bull. 24 (1), 13 – 21.
(29) Shelton, D. R., Tiedje, J. M. (1984). General method for determining anaerobic biodegradation potential. App. Environ. Microbiol. 47, 850 – 857.
(30) Birch, R. R., Biver, C., Campagna, R., Gledhill, W. E., Pagga, U., Steber, J., Reust, H., Bontinck, W. J. (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere, 19, 1527 – 1550.
(31) Pagga, U., Beimborn, D. B. (1993). Anaerobic biodegradation tests for organic compounds. Chemosphere, 27, 1499 – 1509.
(32) Nuck, B. A., Federle, T. W. (1986). A batch test for assessing the mineralisation of 14C-radiolabelled compounds under realistic anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol. 30, 3597 – 3603.
(33) US-EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of organic chemicals. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3400). EPA 712-C-98-090.
(34) Sijm, Haller, Schrap (1997). Influence of storage on sediment characteristics and drying sediment on sorption coefficients of organic contaminants. Bulletin Environ. Contam. Toxicol. 58, 961 – 968.
(35) Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986) Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues II. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 39, 187 – 203.
(36) Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 33, 47 – 60.
(37) Carlton, R.R., Allen, R. (1994). The use of a compartment model for evaluating the fate of pesticides in sediment/water systems. Brighton Crop Protection Conference – Pest and Diseases, 1349 – 1354.
DODATEK 1
POKYNY K AEROBNÍM A ANAEROBNÍM ZKUŠEBNÍM SYSTÉMŮM
Aerobní zkušební systém
Aerobní zkušební systém popsaný v této zkušební metodě se skládá z aerobní vodní vrstvy (typická koncentrace kyslíku v rozmezí od 7 do 10 mg*l
­1
) a vrstvy sedimentu, která je na povrchu aerobní a pod povrchem anaerobní (typické průměrné oxidačně-redukční potenciály (E
h
) v anaerobní zóně sedimentu jsou v rozmezí ­80 až ­190 mV). Nad vodní hladinu v každé inkubační jednotce se zavádí zvlhčený vzduch, aby se v prostoru pod víčkem udržovala dostatečná koncentrace kyslíku.
Anaerobní zkušební systém
Pro anaerobní zkušební systém je zkušební postup v podstatě tentýž, jako postup popsaný pro aerobní systém, liší se však tím, že nad hladinu vody v každé inkubační jednotce se zavádí zvlhčený dusík, aby se udržovala jeho koncentrace v prostoru pod víčkem. Sediment a voda jsou považovány za anaerobní, pokud je oxidačně-redukční potenciál (E
h
) nižší ­100 mV. V anaerobní zkoušce se mineralizace posuzuje na základě měření uvolněného oxidu uhličitého a methanu.
DODATEK 2
PŘÍKLAD SKLENĚNÉ PRŮTOKOVÉ APARATURY



DODATEK 3
PŘÍKLAD BIOMETRICKÉ APARATURY



DODATEK 4
PŘÍKLAD VÝPOČTU DÁVKY APLIKOVANÉ DO ZKUŠEBNÍCH NÁDOB
----------------------------------------------------------------------
Vnitřní průměr válce:                             = 8 cm

Výška vodního sloupce bez sedimentu:              = 12 cm

Plocha hladiny: 3,142 × 42                        = 50,3 cm
2
Dávkování: 500 g zkoušené látky na ha odpovídá 5 µg/cm
2
Celkové množství v µg: 5 × 50,3 = 251,5 µg Přepočet celkového množství na hloubku 100 cm: 12 × 251,5 ÷ 100 = 30,18 µg Objem vodního sloupce: 50,3 × 12 = 603 ml Koncentrace ve vodě: 30,18 ÷ 603 = 0,050 µg/ml nebo 50 µg/l ----------------------------------------------------------------------

Související dokumenty